Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61289

⸱

6 августа 2020 г.

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Ингибиторы ацетилтрансферазы гистона (АТ, также известный как лизин ацетилтрансферазы), такие как CBP/p300, являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения рака. Однако необходимы строгие методы проверки этих ингибиторов. Три метода in vitro для проверки включают анализы HAT с рекомбинантными ацетилтрансферазами, иммуноблоттинг для ацетилирования гистона в клеточной культуре и ChIP-qPCR.

Аннотация

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина на гистонах и других белках для регулирования динамики хроматина и экспрессии генов. KATs, такие как CBP/p300, находятся под интенсивным исследованием в качестве терапевтических целей из-за их критической роли в tumorigenesis различных видов рака. Разработка новых малых молекул ингибиторы ориентации гистона ацетилтрансферазы (HAT) функция KATs является сложной задачей и требует надежных анализов, которые могут проверить специфику и потенцию потенциальных ингибиторов.

В этой статье излагается конвейер из трех методов, которые обеспечивают строгую проверку in vitro для новых ингибиторов HAT (HATi). Эти методы включают в себя пробирку HAT анализ, хроматин гиперацетилирования Ингибирование (ChHAI) анализ, и хроматин иммунопреципиентно-количественный ПЦР (ChIP-qPCR). В HAT анализ, рекомбинантные HATs инкубируются с гистонами в реакции пробирки, что позволяет ацетилирования конкретных остатков лизина на хвостах гистона. Эта реакция может быть заблокирована HATi и относительные уровни сайта конкретных ацетилирования гистон может быть измерена с помощью иммуноблоттинга. Ингибиторы, выявленные в анализе HAT, должны быть подтверждены в клеточной среде.

ChHAI анализ использует иммуноблоттинг для экрана для романа HATi, которые занижают надежные гиперацетилирования гистонов индуцированных ингибитором диацетилазы гистона (HDACi). Добавление HDACi полезно, потому что базальные уровни ацетилирования гистон может быть трудно обнаружить с помощью иммуноблоттинга.

Анализы HAT и ChHAI измеряют глобальные изменения в ацетилляции гистона, но не предоставляют информацию об ацетиляции в конкретных геномных регионах. Таким образом, ChIP-qPCR используется для исследования влияния HATi на уровни ацетилирования гистона в генных регуляторных элементах. Это достигается путем селективной иммунопреципиентации гистон-ДНК комплексов и анализа очищенной ДНК с помощью qPCR. Вместе эти три анализа позволяют тщательно продумать специфику, потенцию и механизм действия романа HATi.

Введение

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина как на гистоне, так и на неистоновыхбелках 1,,2,,3,,4. Недавние исследования показывают, что KATs и их функции ацетилтрансферазы может способствоватьтвердому росту опухоли 4,,5,,6,,7,,8,,9. Например, CREB-связывающий белок (CBP)/p300 являются двумя паралогичными КАТ, которые регулируют многочисленные сигнальныепути при раке 2,,3. CBP/p300 имеют хорошо охарактеризованные гистон ацетилтрансферазы (HAT) функции и катализ Гистон 3 Лизин 27 ацетилляции (H3K27ac)2,4,5,10,11, важным маркером для активных усилителей, промоутер регионов и активной транскрипции генов12,13,14. CBP/p300 служить в качестве критических соактиваторов для про-рост сигнализации путей в твердых опухолей путем активации транскрипции онкогенов через ацетилирование гистонов и других факторов транскрипции4,9,15,16,17,18. В связи с их ролью в прогрессировании опухоли, CBP/p300 и другие KATs находятся под следствием для разработки новых ингибиторов, которые блокируют их онкогенную функцию4,,5,,6,,7,,8,,9,,18,,19,,20. A-485 и GNE-049 представляют собой две успешные попытки разработать мощные и специфические ингибиторы для CBP/p3004,9. В настоящее время проводятся дополнительные исследования в отношении CBP/p300 и других KATs.

Качество ранее описанных ингибиторов KAT (KATi) в настоящее время под вопросом, со многими ингибиторами демонстрируя целевые эффекты и плохой характеристикой21. Поэтому строгая характеристика и проверка новых кандидатов на наркотики имеет важное значение для разработки высококачественных химических зондов. Здесь изложены три протокола, которые образуют конвейер для скрининга и тщательной проверки потенции и специфичности новых KATi, с конкретным акцентом на ингибирование функции HAT (HATi) KATs. CBP/p300 и их ингибиторы используются в качестве примеров, но эти протоколы могут быть адаптированы для других KATs, которые имеют функцию HAT7.

Первый протокол является in vitro гистон ацетилтрансферазы (HAT) анализ, который использует очищенные рекомбинантные p300 и гистоны в контролируемой реакции пробирки. Этот анализ прост в работе, является экономически эффективным, может быть использован для проверки соединений в условиях низкой пропускной способности, и не требует радиоактивных материалов. В этом протоколе рекомбинантный p300 катализин ацетилирования лизина на хвостах гистона в течение короткого инкубационный период и уровни ацетилирования гистона измеряются с помощью стандартных иммуноблоттинговых процедур. Ферментативная реакция может быть выполнена при наличии или отсутствии ингибиторов CBP/p300 для проверки на наличие соединений, которые уменьшают ацетилирование гистона. Кроме того, анализ HAT может быть использован для проверки того, являются ли новые соединения селективными для CBP/p300, оценивая их активность по отношению к другим очищенным KATs, таким как PCAF. Анализ HAT является отличной отправной точкой для изучения новых ингибиторов из-за его простоты, низкой стоимости и способности определять потенцию/селективность ингибитора. Действительно, этот протокол часто используется в литературе в качестве экрана in vitro5,10. Тем не менее, ингибиторы, выявленные в анализе HAT, не всегда эффективны в клеточной культуре, потому что реакция пробирки намного проще, чем живая клеточная система. Поэтому необходимо дополнительно охарактеризовать ингибиторы в экспериментах клеточной культуры22,,23.

Вторым протоколом в трубопроводе является анализ ингибирования гиперацетилирования хроматина (CHHAI). Эта клетка на основе анализа использует ингибиторы диацетилазы гистона (HDACi) в качестве инструмента для гиперацетилата гистонов в хроматине до совместного инкубации с HATi24. Базальный гистон ацетилляции может быть низким в клеточной культуре, что делает его трудно зондировать с помощью иммуноблотинга без добавления HDACi для увеличения ацетилирования. Цель анализа ChHAI заключается в выявлении новых HATi, которые могут затухать увеличение ацетилирования гистон, вызванного ингибированием HDAC. Преимущества этого анализа включают его низкую стоимость, относительную легкость для выполнения, и использование клеток в культуре, которая обеспечивает более физиологическую актуальность, чем пробирка HAT анализа. Как и в hat-анализе, в этом протоколе используется стандартный иммуноблоттинг для сбора данных.

Анализы HAT и ChHAI предоставляют данные о потенции новых соединений для ингибирования глобального ацетилирования гистонов, но не дают представления о том, как эти соединения влияют на модификации в конкретных геномных регионах. Таким образом, окончательный протокол, Хроматин иммунопреципиентации количественных полимеразной цепной реакции (ChIP-qPCR) является экспериментом клеточной культуры, который исследует ДНК-белковых взаимодействий в конкретных регионах генома. В протоколе ChIP хроматин пересекается для сохранения ДНК-белковых взаимодействий. Хроматин затем извлекается из клеток, а ДНК-белковый комплекс подвергается селективной иммунопреципитации для белка интереса (например, с использованием антитела, специфичного для H3K27ac). Затем ДНК очищается и анализируется с помощью qPCR. Например, ChIP-qPCR может быть использован для определения того, если роман HATi downregulates гистон ацетилирования на отдельных онкогенов, таких как килин D125. Хотя ChIP-qPCR является общей техникой, используемой в полевых условиях, это можетбыть трудно оптимизировать 4,,10,,26. Этот протокол содержит советы по предотвращению потенциальных ловушек, которые могут возникнуть при выполнении процедуры ChIP-qPCR, и включает проверку качества, которая должна быть выполнена на данных.

При использовании вместе эти три протокола позволяют тщательной характеристики и проверки романа HATi. Кроме того, эти методы предлагают много преимуществ, поскольку они просты в работе, относительно дешевы и предоставляют данные о глобальной, а также региональной ацетилирования гистон.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Анализ IN vitro HAT

  1. Буферная подготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для буферных рецептов.
    1. Подготовь 5x анализ буфера и 6x додекил сульфат натрия (SDS) и хранить при -20 градусов по Цельсию. Aliquot SDS в 1 mL aliquots.
    2. Подготовка 10x SDS гель работает буфер и 10x TBST и хранить при комнатной температуре.
    3. Подготовьтесь к 1x буферу передачи и храните при 4 градусах Цельсия.
      ВНИМАНИЕ: Проверьте лист данных о безопасности для всех химических веществ, используемых в этом протоколе. SDS, DTT, и бромофено-голубой являются токсичными и не должны быть проглатываемы, вдыхаются, или подвергаются воздействию кожи или глаз. Пожалуйста, посмотрите лист данных безопасности для надлежащих процедур обработки. Пожалуйста, используйте химический дым капот для обработки опасных химических веществ.
  2. Реакция HAT
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анакардиновая кислота является известным ингибитором p3003 и используется в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как анализ HAT может определить новые ингибиторы p300. См. Дополнительный протокол(Схема 1)для схемы шага 1.2.1.
    1. Подготовь следующую энзиматичную реакцию в ПЦР-трубке 0,2 мл: 2 МКЛ 5x буфера анализа, 1 мл очищенного p300 (0,19 мкг/ЛЬ), 1 мл анакардиновой кислоты (HATi) или контроль DMSO, разбавленный в буфере анализа 1x и 2 МКЛ автоклавного ddH2O. Предварительно инкубировать эту смесь в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте к реакции 3 МКЛ из 100 МКМ Ацетил-КоА и 1 МКЛ очищенного H3.1 (0,2 мкг/ОЛ).
    2. Инкубировать полную реакционной смеси при 30 градусов по Цельсию в течение 1 ч в ПЦР теплового цикла.
    3. Добавьте 2 меркаптоэтанол в соотношении 1:10 к буферу образца 6x SDS.
    4. Удалите образцы из теплового цикла ПЦР и добавьте 2 МКЛ 6x SDS (с добавлением 2 меркаптоэтанола) в смесь реакции.
      ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол является токсичным и должны быть использованы внутри химического дыма капот. Пожалуйста, посмотрите лист данных безопасности для надлежащей обработки.
    5. Нагрейте пробы при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут на тепловой блок и охладить на льду. Храните образцы при -20 или -80 градусов по Цельсию или выполнять гель электрофорез и иммуноблоттинг, как описано ниже.
  3. Гель электрофорез и иммуноблоттинг
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не знакомы с гель электрофорез и иммуноблоттинга, см. этустандартную процедуру 27 для получения дополнительной информации о том, как выполнять шаги 1.3.1-1.3.17. Дополнительную информациюможно найти здесь 28,,29,,30,,31,,32,,33.
    1. Pipette 10 йл образцов (от шага 1.2.5.) в скважины 4-20% градиента полиакриламинидного геля. Pipette 5 йл белковой лестницы в одну из скважин в качестве молекулярной ссылки веса. Вы запустите гель на 120 V в течение 90 минут с помощью геля танка.
    2. Передача геля в мембрану поливинилидена дифторида (PVDF) при 100 V в течение 70 минут с помощью переноса бака.
    3. Снимите мембрану с переносного аппарата и поместите ее в пластиковый контейнер. Заблокив мембрану, добавив 1x TBST (содержащий 5% молока) в контейнер и осторожно встряхните в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Удалите 1x TBST из шага 1.3.3. Инкубировать мембрану на ночь с выбранным участком конкретных ацетил антител (например, H3K18ac или H3K27ac первичных антител при 1:5,000 разбавления в 1x TBST, содержащий 5% молока) при 4 градусов по Цельсию с нежной тряской.
    5. Удалите первичный раствор антитела. Вымойте мембрану 2x с 1x TBST (без молока) при комнатной температуре с нежной тряской в течение 15 минут каждой стирки.
    6. Разбавить вторичное антитело при температуре 1:20 000 в 1x TBST (содержащий 5% молока) и инкубировать мембрану в течение 1 ч при комнатной температуре с нежной тряской.
    7. Удалите вторичный раствор антитела. Вымойте мембрану 2x с 1x TBST (без молока) при комнатной температуре с нежной тряской в течение 15 минут каждой стирки.
    8. Слейте 1x TBST из мембраны. Смешайте раствор перекиси субстрата HRP и раствор субстрата HRP в соотношении 1:1 (1 мл каждого) и пипетку 2 мл комбинированного раствора к поверхности мембраны.
    9. Инкубировать раствор мембраной в течение 5 минут при комнатной температуре.
    10. Слейте излишки химилюминесцентного субстрата из мембраны на бумажное полотенце и поместите мембрану в полиэтиленовую пленку внутри держателя рентгеновской кассеты.
    11. Перейдите в темную комнату, посвященную обработке рентгеновской пленки. Подвергните мембрану рентгеновской пленке, поместив пленку поверх мембраны и закрыв кассету на 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время контакта между пленкой и мембраной должно быть определено экспериментально. Сильные сигналы будут нуждаться в коротких экспозициях (секундах), а более слабые сигналы могут потребовать более длительного воздействия.
    12. Удалите рентгеновую пленку из кассеты и обработать пленку, запуская ее через рентгеновский процессор пленки. Смотрите руководства производителя для получения конкретных инструкций о том, как обработать рентгеновую пленку.
    13. Снимите мембрану с полиэтиленовой пленки и промыть ее ddH2O в течение 5 минут при комнатной температуре с нежной тряской.
    14. Инкубировать мембрану с 0,2 М НаОХ в течение 5 минут при комнатной температуре с нежной тряской.
    15. Вымойте мембрану ddH2O в течение 5 минут при комнатной температуре с нежной тряской.
    16. Заблокив мембрану, добавив 1x TBST (содержащий 5% молока) в контейнер и осторожно встряхните в течение 1 ч при комнатной температуре.
    17. Добавьте следующее первичное разбавление антител (например, зонд для H3K27ac, если первое используемое антитело было H3K18ac) и встряхните на ночь при 4 градусах Цельсия. Повторите шаги 1.3.4-1.3.17 до тех пор, пока не будут завершены все зонды антител.

2. Анализ ЧХАИ

  1. В пробирке медикаментозное лечение и анализ ацетилированных гистонов
    ПРИМЕЧАНИЕ: A-485 является мощным и хорошо характеризуется p300 HATi2,4 . Этот ингибитор будет использоваться в оставшихся анализах из-за его эффективности и специфичности в клеточной культуре. МС-275 (Энтиностат)24 является HDACi, что заметно повышает уровень ацетилирования гистона и используется для облегчения обнаружения ацетилляционных зондов со стандартным иммуноблоттом. Видеть Дополнительный протокол (Схема 2) для схемы разбавления препарата, используемого в шаге 2.1.
    1. Семя 100000 MCF-7 клеток в 12 хорошо пластины и позволяют клеткам расти до 80-90% слияния в 1 мл клеточной культуры среды. Отметь скважины для следующей экспериментальной конструкции: скважина 1: управление DMSO (точка отсчета); а также 2: А-485 (3 МКМ); ну 3: А-485 (10 МКМ); хорошо 4: МС-275 (3 МКМ); а также 5: МС-275 (3 МКМ) и А-485 (3 МКМ); а 6: МС-275 (3 МКМ) и А-485 (10 МКМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования клеток MCF-7 используйте полные DMEM-средства массовой информации и позволяйте клеткам расти при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Смотрите таблицу 1 для полного рецепта DMEM.
    2. При 24 ч после посева пипетка 4 мл полного DMEM-средства массовой информации к стерильной 15 мл конической трубки. Пипетка 2 МКЛ МС-275 (6 мМ в ДМСО) до 4 мл среды для окончательной концентрации 3 МКМ МС-275.
    3. Пипетт 2 МКЛ DMSO до 4 мл среды в отдельной стерильной 15 мл конической трубки.
      ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проверьте лист данных о безопасности для правильного обращения с DMSO. Некоторые типы перчаток не оцениваются для обработки DMSO.
    4. Аспирировать клеточной культуры среды из скважин 4-6 и пипетки 1 мл 3 МКМ МС-275 в среднем (шаг 2,1,2) к каждой скважине. Откажитесь от неиспользованного разбавленного МС-275.
    5. Аспирировать клеточной культуры среды от скважин 1-3 и пипетки 1 мл разбавленной DMSO (шаг 2.1.3) к каждой скважине. Откажитесь от неиспользованного разбавленного DMSO.
    6. Вернуть клетки в инкубатор и инкубировать в течение 4 ч, чтобы накопление ацетилированных гистонов в клетках, подверженных MS-275 (колодцы 4-6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: MS-275 является HDACi и вызовет гиперацетилирование гистон24. Это 4 ч предварительной инкубации необходимо, чтобы MS-275, чтобы вызвать гиперацетацию до добавления A-485, который уменьшает ацетилированиегистон 2,4.
    7. После 4 ч инкубации с МС-275, подготовить следующие разбавления в отдельных стерильных 1,5 мл труб путем трубопроводов: 1,0 мл DMSO до 1 мл DMEM средств массовой информации; 0,5 МЛ ДМСО и 0,5 МЛ А-485 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации ДМЭМ; 0,5 МЛ ДМСО и 0,5 МКЛ А-485 (20 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации DMEM; 0,5 МЛ ДМСО и 0,5 МКЛ МС-275 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации ДМЭМ; 0,5 МЛ А-485 (6 мМ) и 0,5 МЛ МС-275 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации DMEM; 0,5 МЛ А-485 (20 мМ) и 0,5 МЛ МС-275 (6 мМ) до 1 мл СРЕДСТВ массовой информации DMEM.
    8. Аспирировать клеточной культуры среды из скважин 1-6 и пипетки 1 мл разбавления 1 хорошо 1, разбавления 2 хорошо 2, разбавления 3 хорошо 3, разбавления 4 хорошо 4, разбавления 5 хорошо 5, и разбавления 6 хорошо 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее правило заключается в том, чтобы сбалансировать содержание DMSO (solvent) между экспериментальными группами и не превышать 0,1% содержания DMSO в клеточной культуре, чтобы избежать клеточной токсичности и изменений в распространении.
    9. Верните клетки в инкубатор и культуру на 20 ч.
    10. После 20 ч, аспирировать клеточной культуры среды из колодцев 1-6.
    11. Вымойте клетки путем трубопроводов 1 мл PBS к скважинам 1-6. Аспирировать PBS.
    12. Добавьте 100 мл 1x пассивного буфера лиза (см. таблицу 1) к скважинам 1-6. Храните пластину клеточной культуры (с образцами в буфере пассивного лиза) при 80 градусах Цельсия на ночь для замораживания-оттепели и лиза клеток.
      ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проверьте лист данных безопасности для всех химических веществ, прежде чем делать буферы. CDTA может вызвать серьезные повреждения глаз и раздражение.
    13. Образцы оттепели при комнатной температуре с нежной тряской в течение 10 мин. Перенесите образцы в отдельные трубы 1,5 мл и сразу же поместите на лед.
    14. Измерьте концентрацию белка в каждом образце. Концентрация белка может быть определена с помощью нескольких устоявшихсяпротоколов 34.
    15. Равноцилибратная концентрация белка между образцами 1-6 (в равном объеме) с использованием 1x пассивного буфера лиза для разбавления, по мере необходимости.
    16. Добавьте 2 меркаптоэтанол в соотношении 1:10 к буферу образца 6x SDS.
    17. Добавьте буфер образца 6x SDS с 2-меркаптоэтаноном в образцы 1-6 к окончательной концентрации буфера образца 1x SDS.
    18. Нагрейте пробы при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут на тепловой блок и охладить на льду. Образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию до шага 2.1.19.
    19. Pipette том, содержащий 30 мкг белка для образцов 1-6 к скважинам в 4-20% градиент полиакриламинид гель. Выполните процедуру иммуноблоттинга в соответствии с протоколом, описанным в Протоколе 1.

3. ЧГИП-КПКР

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол ниже описан для ингибиторов p300 в качестве примера.

  1. Буферная подготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для буферных рецептов. Общие этапы протокола ChIP (например, рецепты буфера, время стирки и время центрифугации) ниже изменены и адаптированы из рекомендаций производителя коммерчески доступного комплекта (см. таблицу материалов)и излитературы 35,36.
    1. Подготовка буфера разбавления ChIP, буфера отеков ядер, буфера для мытья соли, буфера для мытья соли, буфера для мытья LiCl и буфера TE. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
    2. Подготовка буфера sDS lysis, буфера глицина 10x и буфера elution ChIP. Хранить при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проверьте лист данных безопасности для всех химических веществ, прежде чем сделать буферы для обеспечения надлежащей обработки.
  2. Лекарственное лечение
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный протокол (Схема 3) для схемы разбавления препарата, используемого в шаге 3.2.
    1. Семена MCF-7 клетки в двух 15 см культуры посуды и растут клетки до 90% слияния в 12 мл полной среды DMEM. Отметь блюда для следующего экспериментального дизайна: Блюдо 1: DMSO управления (точка отсчета); Блюдо 2: A-485 (3 МКМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования клеток MCF-7 используйте полные DMEM-средства массовой информации и расти при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Смотрите таблицу 1 для полного рецепта DMEM.
    2. В стерильной конической трубке 15 мл, пипетке 12 мл DMEM-медиа и пипетке 6 йл DMSO. Хорошо перемешать.
    3. В отдельной стерильной конической трубке 15 мл, пипетке 12 мл DMEM-медиа и пипетке 6 МКЛ А-485 (6 мМ в ДМСО), чтобы получить окончательную концентрацию 3 МКМ А-485. Хорошо перемешать.
    4. Аспирировать средства массовой информации из Блюдо 1 и 2.
    5. Добавьте 12 мл разбавленного DMSO в DMEM (шаг 3.2.2.) в Блюдо 1.
    6. Добавьте 12 мл 3 МКМ А-485 в DMEM (шаг 3.2.3.) в Блюдо 2.
    7. Верните блюда клеточной культуры в инкубатор и инкубировать в течение 24 ч.
  3. Фиксация ячейки
    1. Pipette 330 йл (27,5 мкл на мл) 37% формальдегида для полного средства массовой информации и осторожно вихрем пластины для смешивания.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен. Пожалуйста, посмотрите лист данных безопасности для надлежащих процедур обработки.
    2. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    3. Pipette 2 мл 10x глицина к пластине и вихрем для смешивания.
    4. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
    5. После инкубации поместите блюда на лед и оттаивать алицит ингибитора протеазы коктейль.
    6. Подготовь следующие решения для образцов DMSO и A-485 с использованием буферов, подготовленных в шаге 3.1.
      1. 2 мл PBS с 1:1,000 разбавления ингибитора протеазы коктейль
      2. 1 мл буфера отеков ядер с 1:1,000 разбавления ингибитора протеазы коктейль
      3. 0,5 мл буфера лиза SDS с разбавлением ингибитора протеазы 1:1000
    7. Аспирировать средства массовой информации из клеточной культуры посуды и мыть клетки дважды с 15 мл холодного PBS.
    8. Pipette 2 мл PBS с коктейлем ингибитора протеазы (шаг 3.3.6.1) к блюдам клеточной культуры. Поднимите клетки в раствор с помощью клеточного скребка.
    9. Перенесите подвеску клетки в микроцентрифугную трубку. Соберите оставшиеся ячейки с дополнительным PBS, если это необходимо.
    10. Спиновые трубки при 800 x g при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут, чтобы гранулы клеток.
    11. Аспирировать супернатант и пипетку 1 мл буфера отеков ядер с коктейлем ингибитора протеазы (шаг 3.3.6.2) к грануле. Повторное производство гранул и инкубации на льду в течение 10 мин.
    12. Центрифуга труб при 2700 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин для гранул нуклей.
    13. Аспирировать супернатант и пипетку 0,5 мл буфера лиза SDS с коктейлем ингибитора протеазы (шаг 3.3.6.3) к грануле. Повторное производство гранул и инкубации на льду в течение 10 мин.
    14. Храните образцы хроматина при -80 градусов по Цельсию до шага 3.4.1 или немедленно приступайте к шагу 3.4.
  4. ДНК-соника
    1. Передача 130 МКЛ хроматина из образца DMSO (шаг 3.3.14) в две звуковые трубки ДНК с помощью пипетки (по 130 йл каждая).
    2. Передача 130 МКЛ хроматина из образца А-485 (шаг 3.3.14) в две звуковые трубки ДНК с помощью пипетки (по 130 мкл каждая).
    3. Sonicate ДНК примерно 150-200 фрагментов базовой пары с использованием следующих параметров sonicator: Пик Инцидент державы (W) 175, Долг фактор 10%, 200 циклов на взрыв и 430 с времени лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки Sonication могут отличаться между моделями и настройками, возможно, потребуется настроить для достижения соответствующего размера фрагмента для различных линий ячейки.
    4. Храните образцы на льду после звукового окония.
    5. Перенесите звуковой хроматин в трубку 1,5 мл с помощью пипетки и центрифуги при 10 000 х г при 4 градусах цельсия в течение 10 мин для гранулированного мусора.
    6. Пипетт супернатант (содержит звуковой хроматин) в новую трубку и выбросить мусор. Соникированный хроматин можно хранить при -80 градусов по Цельсию.
  5. Хроматин иммунопреципиентация (ChIP)
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный протокол (Схема 3) для схемы групп ИС в шаге 3.5.
    1. Измерьте содержание белка звукового хроматина для образцов DMSO и A-485 из шага 3.4.6. Содержание белка можно измерить с помощью устоявшихсяпротоколов 34.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для простоты, этот протокол будет считать содержание белка равным и 100 йл звукового хроматина будет использоваться. В противном случае, содержание белка должно быть равновесным между всеми образцами в равном объеме.
    2. Pipette 100 йл из DMSO sonicated хроматина до двух трубок 1,5 мл (по 100 мкл каждая). Pipette 400 йл буфера разбавления ChIP (содержащий 1:1,000 разбавления ингибитора протеазы коктейль) к каждой трубке, чтобы принести общий объем до 500 йл. Удалить 5 мкл раствора из одной из трубок и хранить при -20 градусов по Цельсию, как DMSO Input.
    3. Pipette 100 йл A-485 звукового хроматина до двух трубок 1,5 мл (по 100 мкл каждая). Pipette 400 МКЛ буфера разбавления ChIP (содержащий 1:1000 разбавления ингибитора протеазы коктейль) к каждой трубке, чтобы принести общий объем до 500 йл. Удалить 5 МКЛ раствора из одной из трубок и хранить при -20 градусов по Цельсию, как A-485 Вход.
    4. Используя пипетку, добавьте антитела иммунопреципиентации (IP) (например, неспецифический контроль IgG или специфические антитела H3K27ac) к соответствующим пробкам DMSO и A-485: IP #1 DMSO хроматин с антителами IgG (5-10 г); IP #2 хроматин DMSO с антителами H3K27ac (5-10 мкг); IP #3 А-485 хроматин с антителами IgG (5-10 мкг); IP #4 A-485 хроматин с антителами H3K27ac (5-10 мкг).
    5. Добавьте 20 йл белка магнитных бусинок в каждую трубку. Убедитесь, что бисер хорошо перерасход.
    6. Поверните образцы на ночь при 4 градусах Цельсия.
    7. Пеллет белка магнитных бусин с помощью магнитного сепаратора и удалить супернатант. Не беспокоить бисер.
    8. Вымойте шарики с 500 йл до 1 мл буфера для мытья соли и поверните в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора, и удалить супернатант.
    9. Вымойте бисер с 500 йл до 1 мл буфера высокой соли мыть и вращаться в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора, и удалить супернатант.
    10. Вымойте бусинки с 500 йл до 1 мл буфера мытья LiCl и повернуть в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора, и удалить супернатант.
    11. Вымойте бисер с 500 йл до 1 мл буфера TE и поверните в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выполните быстро спина вниз. Держите шарики в буфере TE до шага 3.5.14.
    12. Удалите образцы ввода (из шага 3.5.2 и 3.5.3) из морозильной камеры и держите на льду.
    13. Оттепель алицита протеиназы К.
    14. Пеллет бисера с помощью магнитного сепаратора и удалить te буфер из бисера (из шага 3.5.11).
    15. Добавьте в каждый образец буфер элюциона ChIP 1 МЛ Proteinase K, включая образцы Input. Инкубационые образцы со тряской при 62 градусов по Цельсию в течение 2 ч с помощью термоциклера.
    16. После 2 ч, тепла образцов до 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут с помощью термоциклера.
    17. Охладив образцы до комнатной температуры.
    18. Гранулы магнитных бусин с помощью магнитного сепаратора и передачи супернатанта (содержит ДНК, представляющие интерес) в новую трубку 1,5 мл.
    19. Очистите ДНК с помощью стандартного комплекта очистки ПЦР.
    20. Очищенная ДНК может храниться при -20 градусов по Цельсию и может использоваться в качестве шаблонов в стандартных протоколах qPCR. Следуйте протоколам производителя для запуска qPCR.
  6. Анализ данных ChIP-qPCR
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два распространенных метода для анализа результатов ChIP-qPCR являются фолд обогащения по сравнению с антителами IgG и 1% Входной метод. Отличный шаблон для обоих методов анализа предоставляется коммерческим источником может быть использован для быстрого расчета раза обогащения для каждого IP антитела / целевой интерес37.
    1. Для расчета складного обогащения и % ввода, копирования и вставки значений ККТ из данных qPCR, полученных для каждого антитела (неспецифический IgG, антитело IP H3K27ac и 1% Вход) в соответствующую область в шаблоне анализа и Fold Enrichment and Yield % Input автоматически заполняется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ ацетилтрансферазы in vitro histone (HAT) может быть использован для зондирования соединений, которые подавляют активность p300 HAT в направлении гистонового субстрата. Рисунок 1A предоставляет экспериментальную схему для анализа HAT. Анакардиевая кислота, известный HATi3,38, был использован в этом анализе в диапазоне концентрации от 12,5-100 МКМ. При 100 МКМ анакардиевая кислота downregulates p300 катализируемых ацетилирования...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) ацетилат несколько остатков лизина на хвостах гистона и транскрипции факторовдля регулирования транскрипции генов 2,3. Работа в последние два десятилетия показала, что KATs, такие как CBP/p300, PCAF и GCN5, взаимодействуют с онкогенными транскрипционными факторами и помогают стимулировать рост опухоли внескольких твердых типах опухолей 4,,5,,9,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов или раскрытия информации, чтобы сделать.

Благодарности

Эта работа была поддержана гранты от Джеймса и Эстер Кинг биомедицинских исследований программы (6JK03 и 20K07), и Бэнкхед-Коли онкологических исследований программы (4BF02 и 6BC03), Флорида Департамент здравоохранения, Флорида рака молочной железы Фонда, и UF health Cancer Center. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить д-ра Закари Осинкинга и д-ра Андреа Лин за их поддержку в процессе публикации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Туба 1,5 млFisher Scientific05-408-129Для всех методов
10 см тарелкаSarstedt AG & Co.83.3902Для клеточной культуры клеток MCF-7
10 мкл наконечниковFisher Scientific02-707-454Для всех методов
1000 мкл наконечниковCorning4846Для всех методов
10X Глициновый буфердля метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
10X Running Bufferдля методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1.
10X TBSTдля методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1.
12 луночная тарелкаCorning3513Для метода 2
15 см тарелкаSarstedt AG & Co.83.3903Для метода 3
коническая трубка 15 млSanta Cruz Biotechnologysc-200249для методов 2 и 3
1X TBST с 5% молока и 0,02% азидадля методов 1 и 2. Может использоваться для разведения первичных антител, которые будут использоваться не один раз. Обеспечивает кратковременное хранение первичных разведений антител. Не используйте для вторичного разбавления антителами. ВНИМАНИЕ: Азид натрия токсичен.
1X TBST с 5% молокомдля методов 1 и 2. Используется для блокировки мембраны PVDF и для расширения антител. Рецепт см. в Таблице 1.
200 мкл наконечниковCorning4844для всех методов
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM3148для SDS подготовка буфера
4-20% полиакриламидный гельThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXдля методов 1 и 2
5X Буфер для анализадля метода 1. Рецепт см. в Таблице 1.
пассивного лизисадля метода 2. Рецепт см. в Таблице 1.
6X додецилсульфат натрия (SDS)для методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Ингибитор для использования в методах 2 и 3. Растворен в ДМСО.
Ацетил-CBP(K1535)/p300(K1499) антителоТехнология клеточной сигнализации4771для метода 1
Ацетил-КоАSigma-AldrichA2056для использования в методе 1
Антитело к ацетил-гистону H3 (Lys 27) (H3K27ac)Технология клеточной сигнализацииCST 8173антоитела для H3K27ac для иммуноблотов и антитела ChIP
Ацетил-гистон H3 (Lys18) (H3K18ac)Технология клеточной сигнализацииCST 9675антоитела для H3K18ac для иммуноблотов и антитела к
альфа-тубулинуChIP Millipore SigmaT5168для метода 2. Разведите 1:20 000
Anacardic acidCayman Chemical13144Для метода 1
Антитела против мышей IgG HRP, связанные стехнологией клеточной сигнализации7076Для методов 1 и 2. Разведите 1:10 000
вторичного антитела IgG против кроликаJackson ImmunoResearch711-035-152для методов 1 и 2. Разбавлять авторадиографическую пленку от 1:10 000 до 1:20 000
MIDSCIBX810Для методов 1 и 2
Вращающаяся платформа для танцовщицы животаStovall Life Science IncorporatedнедоступноДля методов 1 и 2
Сыворотка для телят крупного рогатого скота (BCS)HyCloneSH30072.03среда для культивирования клеток
крупного рогатого скота Альбумин (БСА)Sigma-AldrichA2153для приготовления буфера
Бромфенол СинийСигма-ОлдричB0126для приготовления образцов SDS Буфер
CDTASpectrum Chemical125572-95-4Для скребка клеток для приготовления буфера
Millipore SigmaCLS3010Для Метода 3
БуферДля Метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
элюирования ChIPдля метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
Полный DMEM для клетокдля методов 2 и 3. Рецепт см. в Таблице 1.
Covaris 130 µ l microTUBECovaris520045Sonication Tube для использования с Covaris S220 в методе 3
Covaris S220 Фокусированный ультразвуковойCovarisS220DNA Sonator для использования в методе 3
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-Aldrich41639для разведения лекарственного препарата и контроля транспортного средства
DL-Дитиотреитол (DTT)Sigma-Aldrich43815для буфера для образцов SDS
препарат DMEMCorning10-013-CVсреда для клеточных культур
EDTAFisher ScientificBP120-1для приготовления буфера
Пример передаточного резервуара и передаточного аппаратаBio-rad1704070для методов 1 и 2
EZ-Magna ChIP A/G Набор для иммунопреципитации хроматинаMillipore Sigma17-10086для метода
3 FK228 ( Ромидепсин)Cayman Chemical128517-07-7Ингибитор HDAC для использования в Методе 2
Раствор формальдегидаSigma-AldrichF8775для фиксации клеток
глицеринаFisher ScientificBP229-1Для буферного препарата
глицинSigma-AldrichG7126для буферного препарата
HEPESSigma-Aldrich54457для буферный препарат
Высокосолевой промывочный буферДля метода 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021для буферного препарата
Immobilon Chemiluminescent HRP SubstrateMillipore SigmaWBKLS0500для методов 1 и 2
KClFisher ScientificBP366-500для буферного препарата
LiClSigma-AldrichL9650Для приготовления буфера
LiCl промывочный буфердля метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
для промывки с низким содержанием солидля метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
Магнитный сепараторPromegaZ5341Для использования в Методе 3
МетанолSigma-Aldrich494437Для приготовления буфера
Мини гелевый бакInvitrogenA25977Для Методов 1 и 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2Ингибитор HDAC для использования в Методе 2. Растворен в ДМСО.
NaClFisher Scientific7647-14-5для получения буфера
NaOHFisher ScientificS318-100для получения буфера в методах 1 и 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Контроль антител кролика для использования в методе 3
Буфердля метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
Набор для очистки ПЦРQiagen28104Для использования в Методе 3
Пенициллин/Стрептомицин 100XCorning30-002-CIСреда для клеточных культур
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Corning21-040-CVДля Методов 2 и 3
PIPESSigma-Aldrich80635для приготовления буфера
сухого молокаNestle CarnationДля Методы 1 и 2
Power Pac 200 для переноса вестерн-блоттингаBio-radДля методов 1 и 2
Power Pac 3000 для SDS геля бегущегоBio-radДля методов 1 и 2
Предварительно окрашенный белковый лестницаThermo Fisher26616Для методов 1 и 2
Коктейль ингибиторов протеазыSigma-AldrichPI8340для использования в методе 3
Протеин А Магнетические шарикиNew England BioLabsS1425SДля использования в методе 3
Proteinase K NewEngland BioLabsP8107SДля использования в методе
3 PTC-100 Программируемый термоконтроллерMJ Research Inc.PTC-100Для Метода 1
Передаточная мембрана PVDFMillipore SigmaIEVH00005Для Методов 1 и 2
Рекомбинант H3.1New England BioLabsM2503Sдля использования в Методе 1
Рекомбинант p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100для использования в Методе 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9Ингибитор HDAC для использования в Методе 2
для лизиса SDSдля метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
Азид натрияFisher Scientific26628-22-8для методов 1 и 2. ВНИМАНИЕ: Азид натрия токсичен. Смотрите SDS для правильного обращения.
Бикарбонат натрияFisherScientific S233-500для приготовления буфера
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750для приготовления
буфера Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-Aldrich71725для подготовки образцов SDS
Стандартный термоблокVWR Scientific ProductsMPN: 949030Для методов 1 и 2
Настольная центрифугаEppendorf5417RДля всех методов
TE буферДля метода 3. Рецепт см. в Таблице 1.
Буфер передачидля методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1.
Трихостатин АCayman Chemical58880-19-6Ингибитор HDAC для использования в методе 2
Tris Fisher ScientificBP152-5для получения буфера
Triton X-100Sigma-AldrichT8787для приготовления буфера
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5для приготовления буфера в методах 1 и 2
Процессоррентгеновской пленкиKonica Minolta Medical & График, Инк.SRX-101Aдля методов 1 и 2
натрия 5X Буфер для разбавления ChIP Буфер MCF-7 аппарат Буфер для набухания ядер Буфер

Ссылки

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539(2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47(2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527(2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702(2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047(2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HATChHAIChIP qPCRKqPCR
Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.