Ингибиторы ацетилтрансферазы гистона (АТ, также известный как лизин ацетилтрансферазы), такие как CBP/p300, являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения рака. Однако необходимы строгие методы проверки этих ингибиторов. Три метода in vitro для проверки включают анализы HAT с рекомбинантными ацетилтрансферазами, иммуноблоттинг для ацетилирования гистона в клеточной культуре и ChIP-qPCR.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина на гистонах и других белках для регулирования динамики хроматина и экспрессии генов. KATs, такие как CBP/p300, находятся под интенсивным исследованием в качестве терапевтических целей из-за их критической роли в tumorigenesis различных видов рака. Разработка новых малых молекул ингибиторы ориентации гистона ацетилтрансферазы (HAT) функция KATs является сложной задачей и требует надежных анализов, которые могут проверить специфику и потенцию потенциальных ингибиторов.
В этой статье излагается конвейер из трех методов, которые обеспечивают строгую проверку in vitro для новых ингибиторов HAT (HATi). Эти методы включают в себя пробирку HAT анализ, хроматин гиперацетилирования Ингибирование (ChHAI) анализ, и хроматин иммунопреципиентно-количественный ПЦР (ChIP-qPCR). В HAT анализ, рекомбинантные HATs инкубируются с гистонами в реакции пробирки, что позволяет ацетилирования конкретных остатков лизина на хвостах гистона. Эта реакция может быть заблокирована HATi и относительные уровни сайта конкретных ацетилирования гистон может быть измерена с помощью иммуноблоттинга. Ингибиторы, выявленные в анализе HAT, должны быть подтверждены в клеточной среде.
ChHAI анализ использует иммуноблоттинг для экрана для романа HATi, которые занижают надежные гиперацетилирования гистонов индуцированных ингибитором диацетилазы гистона (HDACi). Добавление HDACi полезно, потому что базальные уровни ацетилирования гистон может быть трудно обнаружить с помощью иммуноблоттинга.
Анализы HAT и ChHAI измеряют глобальные изменения в ацетилляции гистона, но не предоставляют информацию об ацетиляции в конкретных геномных регионах. Таким образом, ChIP-qPCR используется для исследования влияния HATi на уровни ацетилирования гистона в генных регуляторных элементах. Это достигается путем селективной иммунопреципиентации гистон-ДНК комплексов и анализа очищенной ДНК с помощью qPCR. Вместе эти три анализа позволяют тщательно продумать специфику, потенцию и механизм действия романа HATi.
Введение
Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина как на гистоне, так и на неистоновыхбелках 1,,2,,3,,4. Недавние исследования показывают, что KATs и их функции ацетилтрансферазы может способствоватьтвердому росту опухоли 4,,5,,6,,7,,8,,9. Например, CREB-связывающий белок (CBP)/p300 являются двумя паралогичными КАТ, которые....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Анализ IN vitro HAT
- Буферная подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для буферных рецептов.- Подготовь 5x анализ буфера и 6x додекил сульфат натрия (SDS) и хранить при -20 градусов по Цельсию. Aliquot SDS в 1 mL aliquots.
- Подготовка 10x SDS гель работает буфер и 10x TBST и хранить при комнатной температуре.
- Подготовьтесь к 1x буферу передачи и храните при 4 градусах Цельсия.
ВНИМАНИЕ: Проверьте лист данных о безопасности для всех химических веществ, используемых в этом протоколе. SDS, DTT, и бромофено-голубой являются токсичными и не должны быть проглатываемы, вдыхаются, или подвергаю....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ ацетилтрансферазы in vitro histone (HAT) может быть использован для зондирования соединений, которые подавляют активность p300 HAT в направлении гистонового субстрата. Рисунок 1A предоставляет экспериментальную схему для анализа HAT. Анакардиевая кислота, известный HATi3,38, был использован в этом анализе в диапазоне концентрации от 12,5-100 МКМ. При 100 МКМ анакардиевая кислота downregulates p300 катализируемых ацетилирования.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Лизин ацетилтрансферазы (KATs) ацетилат несколько остатков лизина на хвостах гистона и транскрипции факторовдля регулирования транскрипции генов 2,3. Работа в последние два десятилетия показала, что KATs, такие как CBP/p300, PCAF и GCN5, взаимодействуют с онкогенными транскрипционными факторами и помогают стимулировать рост опухоли внескольких твердых типах опухолей 4,,5,,9,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов или раскрытия информации, чтобы сделать.
Благодарности
Эта работа была поддержана гранты от Джеймса и Эстер Кинг биомедицинских исследований программы (6JK03 и 20K07), и Бэнкхед-Коли онкологических исследований программы (4BF02 и 6BC03), Флорида Департамент здравоохранения, Флорида рака молочной железы Фонда, и UF health Cancer Center. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить д-ра Закари Осинкинга и д-ра Андреа Лин за их поддержку в процессе публикации.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Туба 1,5 мл | Fisher Scientific | 05-408-129 | Для всех методов |
| 10 см тарелка | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | Для клеточной культуры клеток MCF-7 |
| 10 мкл наконечников | Fisher Scientific | 02-707-454 | Для всех методов |
| 1000 мкл наконечников | Corning | 4846 | Для всех методов |
| 10X Глициновый буфер | для метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| 10X Running Buffer | для методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| 10X TBST | для методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| 12 луночная тарелка | Corning | 3513 | Для метода 2 |
| 15 см тарелка | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | Для метода 3 |
| коническая трубка 15 мл | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | для методов 2 и 3 |
| 1X TBST с 5% молока и 0,02% азида | для методов 1 и 2. Может использоваться для разведения первичных антител, которые будут использоваться не один раз. Обеспечивает кратковременное хранение первичных разведений антител. Не используйте для вторичного разбавления антителами. ВНИМАНИЕ: Азид натрия токсичен. | ||
| 1X TBST с 5% молоком | для методов 1 и 2. Используется для блокировки мембраны PVDF и для расширения антител. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| 200 мкл наконечников | Corning | 4844 | для всех методов |
| 2-меркаптоэтанол | Sigma-Aldrich | M3148 | для SDS подготовка буфера |
| 4-20% полиакриламидный гель | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | для методов 1 и 2 |
| 5X Буфер для анализа | для метода 1. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| пассивного лизиса | для метода 2. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| 6X додецилсульфат натрия (SDS) | для методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Ингибитор для использования в методах 2 и 3. Растворен в ДМСО. |
| Ацетил-CBP(K1535)/p300(K1499) антитело | Технология клеточной сигнализации | 4771 | для метода 1 |
| Ацетил-КоА | Sigma-Aldrich | A2056 | для использования в методе 1 |
| Антитело к ацетил-гистону H3 (Lys 27) (H3K27ac) | Технология клеточной сигнализации | CST 8173 | антоитела для H3K27ac для иммуноблотов и антитела ChIP |
| Ацетил-гистон H3 (Lys18) (H3K18ac) | Технология клеточной сигнализации | CST 9675 | антоитела для H3K18ac для иммуноблотов и антитела к |
| альфа-тубулину | ChIP Millipore Sigma | T5168 | для метода 2. Разведите 1:20 000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | Для метода 1 |
| Антитела против мышей IgG HRP, связанные с | технологией клеточной сигнализации | 7076 | Для методов 1 и 2. Разведите 1:10 000 |
| вторичного антитела IgG против кролика | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | для методов 1 и 2. Разбавлять авторадиографическую пленку от 1:10 000 до 1:20 000 |
| MIDSCI | BX810 | Для методов 1 и 2 | |
| Вращающаяся платформа для танцовщицы живота | Stovall Life Science Incorporated | недоступно | Для методов 1 и 2 |
| Сыворотка для телят крупного рогатого скота (BCS) | HyClone | SH30072.03 | среда для культивирования клеток |
| крупного рогатого скота Альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich | A2153 | для приготовления буфера |
| Бромфенол Синий | Сигма-Олдрич | B0126 | для приготовления образцов SDS Буфер |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | Для скребка клеток для приготовления буфера |
| Millipore Sigma | CLS3010 | Для Метода 3 | |
| Буфер | Для Метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| элюирования ChIP | для метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| Полный DMEM для клеток | для методов 2 и 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| Covaris 130 µ l microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication Tube для использования с Covaris S220 в методе 3 |
| Covaris S220 Фокусированный ультразвуковой | Covaris | S220 | DNA Sonator для использования в методе 3 |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | 41639 | для разведения лекарственного препарата и контроля транспортного средства |
| DL-Дитиотреитол (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | для буфера для образцов SDS |
| препарат DMEM | Corning | 10-013-CV | среда для клеточных культур |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | для приготовления буфера |
| Пример передаточного резервуара и передаточного аппарата | Bio-rad | 1704070 | для методов 1 и 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Набор для иммунопреципитации хроматина | Millipore Sigma | 17-10086 | для метода |
| 3 FK228 ( Ромидепсин) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | Ингибитор HDAC для использования в Методе 2 |
| Раствор формальдегида | Sigma-Aldrich | F8775 | для фиксации клеток |
| глицерина | Fisher Scientific | BP229-1 | Для буферного препарата |
| глицин | Sigma-Aldrich | G7126 | для буферного препарата |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | для буферный препарат |
| Высокосолевой промывочный буфер | Для метода 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | для буферного препарата |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | для методов 1 и 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | для буферного препарата |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | Для приготовления буфера |
| LiCl промывочный буфер | для метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| для промывки с низким содержанием соли | для метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| Магнитный сепаратор | Promega | Z5341 | Для использования в Методе 3 |
| Метанол | Sigma-Aldrich | 494437 | Для приготовления буфера |
| Мини гелевый бак | Invitrogen | A25977 | Для Методов 1 и 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | Ингибитор HDAC для использования в Методе 2. Растворен в ДМСО. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | для получения буфера |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | для получения буфера в методах 1 и 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Контроль антител кролика для использования в методе 3 |
| Буфер | для метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| Набор для очистки ПЦР | Qiagen | 28104 | Для использования в Методе 3 |
| Пенициллин/Стрептомицин 100X | Corning | 30-002-CI | Среда для клеточных культур |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Corning | 21-040-CV | Для Методов 2 и 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | для приготовления буфера |
| сухого молока | Nestle Carnation | Для Методы 1 и 2 | |
| Power Pac 200 для переноса вестерн-блоттинга | Bio-rad | Для методов 1 и 2 | |
| Power Pac 3000 для SDS геля бегущего | Bio-rad | Для методов 1 и 2 | |
| Предварительно окрашенный белковый лестница | Thermo Fisher | 26616 | Для методов 1 и 2 |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Sigma-Aldrich | PI8340 | для использования в методе 3 |
| Протеин А Магнетические шарики | New England BioLabs | S1425S | Для использования в методе 3 |
| Proteinase K New | England BioLabs | P8107S | Для использования в методе |
| 3 PTC-100 Программируемый термоконтроллер | MJ Research Inc. | PTC-100 | Для Метода 1 |
| Передаточная мембрана PVDF | Millipore Sigma | IEVH00005 | Для Методов 1 и 2 |
| Рекомбинант H3.1 | New England BioLabs | M2503S | для использования в Методе 1 |
| Рекомбинант p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | для использования в Методе 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Ингибитор HDAC для использования в Методе 2 |
| для лизиса SDS | для метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| Азид натрия | Fisher Scientific | 26628-22-8 | для методов 1 и 2. ВНИМАНИЕ: Азид натрия токсичен. Смотрите SDS для правильного обращения. |
| Бикарбонат натрия | Fisher | Scientific S233-500 | для приготовления буфера |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | D6750 | для приготовления |
| буфера Додецилсульфат натрия (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | для подготовки образцов SDS |
| Стандартный термоблок | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | Для методов 1 и 2 |
| Настольная центрифуга | Eppendorf | 5417R | Для всех методов |
| TE буфер | Для метода 3. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| Буфер передачи | для методов 1 и 2. Рецепт см. в Таблице 1. | ||
| Трихостатин А | Cayman Chemical | 58880-19-6 | Ингибитор HDAC для использования в методе 2 |
| Tris Fisher Scientific | BP152-5 | для получения буфера | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | для приготовления буфера |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | для приготовления буфера в методах 1 и 2 |
| Процессор | рентгеновской пленкиKonica Minolta Medical & График, Инк. | SRX-101A | для методов 1 и 2 |
Ссылки
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveal....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
