Method Article

Предконцентрация и изоляция микровесикул и экзосом на бумажной основе

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол для изготовления бумажного устройства для эффективного обогащения и изоляции микровесий и экзосом.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микровесицы и экзосомы являются небольшими membranous везикулы выпущен в внеклеточной среде и циркулирует по всему телу. Поскольку они содержат различные родительские клетки, полученные биомолекулы, такие как ДНК, мРНК, миРНК, белки и липиды, их обогащение и изоляция являются важными шагами для их эксплуатации в качестве потенциальных биомаркеров для клинических применений. Однако обычные методы изоляции (например, ультрацентрарифизация) приводят к значительным потерям и повреждению микровесичек и экзосом. Эти методы также требуют нескольких повторяющихся шагов ультрацентрифугации, загрузки и расточительства реагентов. В этой статье описывается подробный метод изготовления оригами-бумажного устройства (Exo-PAD), предназначенного для эффективного обогащения и изоляции микровесий и экзосом простым способом. Уникальный дизайн Exo-PAD, состоящий из аккордеонных многослойных с конвергентных образных областей, интегрирован с техникой поляризации концентрации иона, что позволяет пятикратное обогащение микровесий и экзосом на конкретных слоях. Кроме того, обогащенные микровесицы и экзосомы изолированы, просто разворачивая Exo-PAD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микровесицы и экзосомы представляют собой небольшие мембранные пузырьки размером 0,2–1 мкм и 30–200 нм соответственно. Они выделяются в внеклеточной среде несколькими различными типами клеток1,,2,,3,,4,,5. Они содержат информацию о родительских клетках в виде подмножеств ДНК, мРНК, миРНК, белков и липидов, и циркулируют по всему телу через различные жидкости организма, такие как сыворотка, плазма, моча, спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость и слюна6,,7,,8,,9. Таким образом, методы эффективной изоляции микровесий и экзосом от биологических жидкостей могут предоставить широкие возможности в области диагностики, прогноза и мониторинга заболеваний в режиме реального времени, а также в разработке новых терапевтических средств.

Однако обычный метод изоляции микрорезокм и экзосом на основе ультрацентрифугации занимает чрезвычайно много времени и приводит к значительным потерям и загрязнению образца. Это потому, что она включает в себя несколько громоздких трубопроводов и погрузочных шагов и отбрасывания различных реагентов с повторными ультрацентрифугации5,6,10,11,12. Кроме того, высокий сдвига стресса, вызванного ультрацентрифугации (100000 х г) может вызвать физический лизис микрорез и экзосомы, что дает плохие темпы восстановления (5-23%)6,13,14. Поэтому необходимо разработать высокоэффективный, ненавязчивый метод изоляции микровесицы и экзосомы для уменьшения урона и потерь, тем самым достигая более высоких скоростей восстановления.

Устройство на основе оригами (Exo-PAD) было разработано для более простой, мягкой и высокоэффективной изоляции микровесий и экзосом6. Конструкция Exo-PAD представляет собой многоотраслую бумагу с последовательно связанными участками образца, которые постепенно уменьшаются в диаметре. Техника поляризации концентрации иона (ICP), которая является наноэлектрическим явлением, которое предконцентрирует заряженные биомолекулы, была интегрирована с этой уникальной конструкцией. Использование Exo-PAD привело к пятикратному обогащению микровесиков и экзосом в определенных слоях и их изоляции, просто развернувшись устройством. В этой статье подробно описывается Exo-PAD, от общего изготовления и эксплуатации устройства до анализа его использования, иллюстрации метода и показа репрезентативных результатов6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление устройств

  1. Определите регион, который будет напечатан на бумаге с помощью программного обеспеченияпринтера( Таблица материалов ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция имеет 12 восковых узорных слоев, в которых диаметры круговой выборки постепенно сужаются от 5 мм до 2 мм(рисунок 1A).
  2. Печать гидрофобного воска на обозначенных областях по обе стороны целлюлозы бумаги(Таблица материалов) с помощью коммерческого воскового принтера(Таблица материалов) (Рисунок 1B).
  3. Поместите бумагу, напечатанную на воске, в лабораторную духовку на 80 с при температуре 120 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет воску достичь внутренней части бумаги путем достижения теплового потока печатного воска. С этим протоколом инкубации разрешение шаблона составляет 2 мм. Таким образом, будьте осторожны, чтобы не печатать узоры менее 2 мм. В противном случае узоры будут заблокированы воском.
  4. Вырезать воск печатной бумаги с резаком, чтобы сделать отдельные устройства (Рисунок 1C).
  5. Падение 5 л и 2 л пермяки (например, Нафион; Таблица материалов) на выборочных участках в левом и правом слоях, соответственно(рисунок 1D).
  6. Поместите слои, покрытые пермякой мембраной, на горячую тарелку при 70 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы испарить пермякзевую мембрану растворителя.
  7. Уплотните внешнюю поверхность слоя с покрытием, обращенного к буферному раствору лентой, чувствительной к давлению, оставляя небольшое отверстие.
  8. Сложите напечатанное отдельное устройство (т.е. Exo-PAD) взад и вперед вдоль белых линий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сложив устройство, все области выборки становятся конвергентно связаны(Рисунок 1E). Эта конвергентная конструкция фокусирует линии электрического поля, когда напряжение применяется для МСП, достигая более интенсивной предконцентрации микровесий и экзосом.

2. Обогащение и пространственное фокусировка микровесичек и экзосом поляризацией концентрации иона

  1. Нагрузка 15 мл микровесицы и экзосомного образца (3 х 1011 частиц/мл в 0,1x фосфатном солевом солевом соленом (PBS) с 0,05% Tween 20) в конвергентных областях образца путем пипетки и подождите несколько секунд, чтобы обеспечить полное смачиивание всех образцовобластей (Рисунок 1F).
  2. Поместите две акриловые камеры на обоих концах Exo-PAD и зажим Exo-PAD надежно с небольшими клипами связующего для предотвращения разворачивающихся (Рисунок 1G).
  3. Заполните камеры с 110 МЛ 0,1x PBS и вставьте два Ag/AgCl электродов (Рисунок 1H).
  4. Применить 30 V к электродам в течение 20 минут с помощью системы измерения тока напряжения источника(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прикладное напряжение генерирует явление ПМС и, следовательно, предконцентрирует микровесицы и экзосомы на слоях 8 и 9 Exo-PAD.

3. Изоляция обогащенных микровесиков и экзосом

  1. Отделить сложенный Exo-PAD от акриловых камер и развернуть устройство, чтобы изолировать обогащенные микровесицы и экзосомы от других слоев(рисунок 1I).
  2. Удар из образца областей в слоях 8 и 9, где микровесицы и экзосомы обогащаются, для анализа вниз по течению (Рисунок 1J).

4. Сканирование электронной микроскопии анализ

  1. Исправить обогащенные микровесицы и экзосомы, погрузив пробитые области в 2,5% глутаральдегида в 0,1 млн натрия какодилат буфера на 1 ч и в 1% осмиум тетроксида в 0,1 М натрия cacodylate за 1 ч.
    ВНИМАНИЕ: Тесмий тетроксид является очень ядовитым и опасным химическим веществом. Поскольку тетроксид осмия может проникать в пластик, он должен храниться в стекле. Любая обработка тетроксида осмия должна выполняться в химическом капюшоне дыма с двойными перчатками нитрила.
  2. Обезвоживание фиксированных микровесий и экзосом с восходящими сортами 200 доказательство этанола (т.е., 50%, 70%, 90%, и 100%) в течение 30 мин каждый.
  3. Химически высушите образец, погрузив его в гексаметилдисилазан в десикатор в течение 30 мин.
    ВНИМАНИЕ: Гексаметилдисилазан является легковоспламеняющимся и влагочувствительным химическим веществом. Он должен храниться в сухом и хорошо проветриваемом участке вдали от источников зажигания.
  4. Пальто полностью высушенные микрорезы и экзосомы с золотом / палладием (20 нм) через распыление и захват сканирования электронной микроскопии (SEM) изображений.

5. Анализ отслеживания наночастиц

  1. Удар из образца областей в слоях 6, 8 и 10 с помощью биопсии удар после 20 мин работы устройства.
  2. Погрузите каждую пробитую область в буферное решение (0,1x PBS с 0,01% Tween 20).
  3. Вихрь в течение 10 мин и центрифуга на 30 с при 6000 об/мин, чтобы восстановить обогащенные микровесицы и экзосомы.
  4. Удалите пробитые области из раствора и измерьте концентрацию микровесов и экзосом с помощью инструмента анализа наночастиц (NTA)(Таблица материалов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Время работы должно быть оптимизировано для достижения максимального выхода на восстановление обогащенных микровесий и экзосом. Недостаточное время не позволяет достаточной миграции микровесицы и экзосомы, что уменьшает обогащение, в то время как чрезмерное время ухудшает пространственную фокусировку и, следовательно, рассеивает микровесицы и экзосомы. Таким образом, благодаря этапу оптимизации времени можно определить максимальный фактор предконцентрации микровесов и экзосом и конечное место, где микровесицы и экзосомы ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя Exo-PAD был успешно использован для обогащения и изоляции микрорезокм и экзосом, следует тщательно рассмотреть несколько критических точек: 1) время инкубации печи во время подготовки устройства, 2) время обработки, 3) применение напряжения с различными номерами слоя и диаметрами выборки, и 4) применимость к клиническим образцам.

Время инкубации и температура, приведенные в протоколе, оптимизированы для изготовления надежного устройства. Более длительное время инкубации или более высокая ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee был поддержан исследовательским грантом Университета Кванвуна в 2019 году. Херин Ким был поддержан «Программой развития компетенций для специалистов отрасли» Министерства торговли, промышленности и энергетики Кореи (MOTIE), управляемой Корейским институтом развития технологий (KIAT) (No. P0002397, HRD программа для промышленной конвергенции носимых смарт-устройств).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl электродыA-M Systems, Inc.531500диаметром 0,15 дюйма
из бычьей сыворотки (BSA), конъюгат Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA13101BSA, сопряженный с Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 нм)
Карбонатно-бикарбонатный буферSigma-AldrichC3041-50CAPКарбонатный буфер
программное обеспечение CorelDraw (Coral Co., Канада)Corel Corporationдля определения восковой печати регион
ColorQube 8870Xerox CorporationВосковой принтер
Хроматографическая бумага марка 1Whatman3001-861Целлюлозная бумага, размер: 20 * 20 см
Флуоресцентные маркированные стандарты экзосомHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Экзосома меченая FITC (Ex/Em: 490/520 нм)
Источник-измеритель тока/напряжения Keithley 2410Keithley Instruments, Inc.Текущий– Система измерения источника напряжения
Nafion раствор перфторированной смолыSigma-Aldrich31175-20-9Пермеселективная мембрана, 20 мас.% в смеси низших алифатических спиртов и воды; содержит 34% воды
NanoSight LM10NanoSight TechnologyNanoparticle tracking analysis (NTA) машина
фосфатно-солевого буфера (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001
Альбумин Программное обеспечение для принтера

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175(2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles