Method Article

Предконцентрация и изоляция микровесикул и экзосом на бумажной основе

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол для изготовления бумажного устройства для эффективного обогащения и изоляции микровесий и экзосом.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микровесицы и экзосомы являются небольшими membranous везикулы выпущен в внеклеточной среде и циркулирует по всему телу. Поскольку они содержат различные родительские клетки, полученные биомолекулы, такие как ДНК, мРНК, миРНК, белки и липиды, их обогащение и изоляция являются важными шагами для их эксплуатации в качестве потенциальных биомаркеров для клинических применений. Однако обычные методы изоляции (например, ультрацентрарифизация) приводят к значительным потерям и повреждению микровесичек и экзосом. Эти методы также требуют нескольких повторяющихся шагов ультрацентрифугации, загрузки и расточительства реагентов. В этой статье описывается подробный метод изготовления оригами-бумажного устройства (Exo-PAD), предназначенного для эффективного обогащения и изоляции микровесий и экзосом простым способом. Уникальный дизайн Exo-PAD, состоящий из аккордеонных многослойных с конвергентных образных областей, интегрирован с техникой поляризации концентрации иона, что позволяет пятикратное обогащение микровесий и экзосом на конкретных слоях. Кроме того, обогащенные микровесицы и экзосомы изолированы, просто разворачивая Exo-PAD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микровесицы и экзосомы представляют собой небольшие мембранные пузырьки размером 0,2–1 мкм и 30–200 нм соответственно. Они выделяются в внеклеточной среде несколькими различными типами клеток1,,2,,3,,4,,5. Они содержат информацию о родительских клетках в виде подмножеств ДНК, мРНК, миРНК, белков и липидов, и циркулируют по всему телу через различные жидкости организма, такие как сыворотка, плазма, моча, спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость и слюна6,,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление устройств

  1. Определите регион, который будет напечатан на бумаге с помощью программного обеспеченияпринтера( Таблица материалов ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция имеет 12 восковых узорных слоев, в которых диаметры круговой выборки постепенно сужаются от 5 мм до 2 мм(рисунок 1A).
  2. Печать гидрофобного воска на обозначенных областях по обе стороны целлюлозы бумаги(Таблица материалов) с помощью коммерческого воскового принтера(Таблица материалов) (Рисунок 1B).
  3. Поместите бумагу, напечатанную на воске, в лабораторную духовку н....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Время работы должно быть оптимизировано для достижения максимального выхода на восстановление обогащенных микровесий и экзосом. Недостаточное время не позволяет достаточной миграции микровесицы и экзосомы, что уменьшает обогащение, в то время как чрезмерное время ухудшает пространственную фокусировку и, следовательно, рассеивает микровесицы и экзосомы. Таким образом, благодаря этапу оптимизации времени можно определить максимальный фактор предконцентрации микровесов и экзосом и конечное место, где микровесицы и экзосомы .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя Exo-PAD был успешно использован для обогащения и изоляции микрорезокм и экзосом, следует тщательно рассмотреть несколько критических точек: 1) время инкубации печи во время подготовки устройства, 2) время обработки, 3) применение напряжения с различными номерами слоя и диаметрами выборки, и 4) применимость к клиническим образцам.

Время инкубации и температура, приведенные в протоколе, оптимизированы для изготовления надежного устройства. Более длительное время инкубации или более высокая .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee был поддержан исследовательским грантом Университета Кванвуна в 2019 году. Херин Ким был поддержан «Программой развития компетенций для специалистов отрасли» Министерства торговли, промышленности и энергетики Кореи (MOTIE), управляемой Корейским институтом развития технологий (KIAT) (No. P0002397, HRD программа для промышленной конвергенции носимых смарт-устройств).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl электродыA-M Systems, Inc.531500диаметром 0,15 дюйма
из бычьей сыворотки (BSA), конъюгат Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA13101BSA, сопряженный с Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 нм)
Карбонатно-бикарбонатный буферSigma-AldrichC3041-50CAPКарбонатный буфер
программное обеспечение CorelDraw (Coral Co., Канада)Corel Corporationдля определения восковой печати регион
ColorQube 8870Xerox CorporationВосковой принтер
Хроматографическая бумага марка 1Whatman3001-861Целлюлозная бумага, размер: 20 * 20 см
Флуоресцентные маркированные стандарты экзосомHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Экзосома меченая FITC (Ex/Em: 490/520 нм)
Источник-измеритель тока/напряжения Keithley 2410Keithley Instruments, Inc.Текущий– Система измерения источника напряжения
Nafion раствор перфторированной смолыSigma-Aldrich31175-20-9Пермеселективная мембрана, 20 мас.% в смеси низших алифатических спиртов и воды; содержит 34% воды
NanoSight LM10NanoSight TechnologyNanoparticle tracking analysis (NTA) машина
фосфатно-солевого буфера (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001
Альбумин Программное обеспечение для принтера

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles