Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изображение Внутриядерных Actin Роды в Live Heat подчеркнул Drosophila эмбрионов

3.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61297

⸱

15 мая 2020 г.

 ,  , 
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого протокола заключается в том, чтобы ввести родамина конъюгированных шаровых актин в дрозофила эмбрионов и изображения внутриядерных актин стержня сборки после теплового стресса.

Аннотация

Целью данного протокола является визуализация внутриядерных актин-стержней, которые собираются в живых эмбрионах drosophila melanogaster после теплового стресса. Actin стержней являются отличительной чертой сохраняется, неудобоваемые Actin стресс ответ (ASR), который сопровождает человеческие патологии, в том числе нейродегенеративных заболеваний. Ранее мы показали, что ASR способствует морфогенеза неудачи и снижение жизнеспособности развивающихся эмбрионов. Этот протокол позволяет продолжить изучение механизмов, лежащих в основе сборки актин стержня и ASR в модельной системе, которая очень податлима для визуализации, генетики и биохимии. Эмбрионы собираются и устанавливаются на крышку, чтобы подготовить их к инъекциям. Родамин-конъюгированный шаровые актин (G-actinRed) разбавляется и загружается в микроиглу. В центр каждого эмбриона делается одна инъекция. После инъекции эмбрионы инкубируется при повышенной температуре, а внутриядерные актиновые стержни визуализируются с помощью конфокалярной микроскопии. Восстановление флуоресценции после фотоотбивания (FRAP) эксперименты могут быть выполнены на актин стержней; и другие богатые актином структуры в цитоплазме также могут быть изображены. Мы находим, чтоG-актин красный полимеризируется как эндогенный G-актин и не, сам по себе, вмешиваться в нормальное развитие эмбриона. Одним из ограничений этого протокола является то, что необходимо позаботиться о том, чтобы во время инъекции избежать серьезных повреждений эмбриона. Однако, с практикой, инъекционные G-актинкрасный в drosophila эмбрионов является быстрым и надежным способом визуализации актин стержней и может быть легко использован с мухами любого генотипа или с введением других клеточных стрессов, в том числе гипоксии и окислительного стресса.

Введение

Этот протокол описывает, как вводить G-actinRed, чтобы визуализировать сборку внутриядерных актин-стержней в термечных эмбрионах, которые проходят неопругиваемый actin Stress Response (ASR)1. Мы разработали этот протокол, чтобы помочь исследованиям ASR, который в эмбрионах приводит к нарушению морфогенеза и снижению жизнеспособности, а у взрослых типов клеток человека связано с патологиями,включая почечную недостаточность 2,мышечные миопатии 3, и болезнь Альцгеймераи болезнь Хантингтона 4,5,6,7,8. Это ASR вызвано многочисленными клеточными напряжениями, в томчисле тепловой шок 9,10,11,окислительный стресс 4,6, снижениесинтеза АТФ 12, и ненормальные Хантингтин или β-амилоидаолигомеризации 4,5,6,7,9,13,14,15,16. Отличительной чертой ASR является сборка аноматических актиновых стержней либо в цитоплазме, либо в ядре пораженных клеток, что обусловлено вызванной стрессом гиперактивацией актин-взаимодействующих белков, cofilin1,5,6,10. К сожалению, по-прежнему сохраняются пробелы в знаниях в отношении ASR. Например, функция актин-стержней неизвестна. Мы не понимаем, почему стержни образуются в цитоплазме некоторых типов клеток, но ядро других. Также не ясно, является ли ASR защитным или неадаптивным для клеток или эмбрионов, переживая стресс. Наконец, мы до сих пор не знаем подробных механизмов, лежащих в основе гиперактивации Cofilin или сборки актин стержня. Таким образом, этот протокол обеспечивает быстрый и универсальный анализ для зондирования ASR путем визуализации актин формирования стержня и динамики в высокоуроспособной экспериментальной системы эмбриона живой плодовой мухи.

Протокол микроинъекций G-actinRed в живые эмбрионы дрозофилы был первоначально разработан для изучения динамики нормальных цитоплазмических актиновыхструктур 17 во время построения тканей. В этих исследованиях мы обнаружили, что инъекция G-actinRed не оказывает негативного влияния на ранние процессы развития эмбриона, включая цитокинезили гастрипуляцию 17,18. Затем мы изменили протокол, адаптируя обработку эмбриона и G-actinRed инъекции, чтобы изображение актин стержней в тепловой подчеркнул эмбрионов, проходящих ASR1. Другие методы, кроме инъекции G-actinRed, могут быть использованы для визуализации актина в эмбрионах. Эти методы опираются на выражение флуоресцентных белков (FPs) помечены актина или доменов актин связывания белков, таких как Утрофин-мчерри, Lifeact, F-tractin-GFP, и Moesin-GFP (рассмотренв 19). Однако, используя эти FP зонды требует осторожности, потому что они могут стабилизировать или нарушить некоторые актин структуры, не в равной степенимаркировать все актин структуры 20, а в случае актин-GFP, очень переэкспрессированы - проблематично для анализа стержня сборки, которая является не только стресс зависит, но и actin концентрациизависит 1. Таким образом, G-actinRed является предпочтительным зондом для исследования стержня в эмбрионах мух, а большой размер эмбриона позволяет его легко инъекцию.

Рабочий процесс этого протокола похож на другие устоявшиеся методы микроинъекции, которые были использованы для инъекций белков, нуклеиновых кислот, лекарств и флуоресцентных индикаторов в эмбрионы дрозофилы21,22,23,24,25,26,27. Однако, после микроинъекции G-actinRed здесь, эмбрионы подвергаются легкому тепловому стрессу, чтобы вызвать сборку ASR и внутриядерного актина стержня. Для лабораторий с доступом к мухам и инъекционной установке этот метод должен быть легко реализуемым и адаптируемым для конкретных линий исследования в отношении ASR, включая его индукцию различными стрессами или модуляцией в различных генетических фонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка эмбриона сбора чашки и яблочный сок агар пластин

  1. За пять дней до инъекционного эксперимента, построить28 или закупить по крайней мере две небольшие чашки сбора эмбрионов. Сделать свежие 60 мм яблочный сок агар пластины, которые будут использоваться с небольшой коллекциичашки 28. Храните тарелки в пластиковых коробках, покрытых влажными бумажными полотенцами при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие чашки для сбора эмбрионов, населенные номерами мух, описанные в шаге 1.3, обеспечат достаточное количество эмбрионов за эксперимент, а также обеспечат, чтобы обработка и инъекция эмбриона можно было сделать в достаточно короткие сроки, чтобы сделать визуализацию ранних стадий развития.
  2. Теплый яблочный сок пластины до 18 градусов по Цельсию и добавить мазок дрожжевой пасты в центр пластины. Дрожжевая паста – это простая паста из активных дрожжей и дистиллированной воды.
  3. Для продвижения самых щедрых яйцекладка, создать сбор чашки с мухами 2 дней до эксперимента. Добавьте не менее 100 самок и 50 самцов мух в чашки коллекции, а сверху с подготовленной тарелкой яблочного сока(рисунок 1, шаг 1). В дни, предшествующие эксперименту по инъекциям, меняются тарелки яблочного сока не реже двух раз в день, один раз утром и один раз вечером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшие результаты инъекций и визуализации получены, когда чашки для сбора эмбрионов хранятся при 18 градусах Цельсия при свете 12 ч/свет от цикла.

2. Подготовить рабочее решение фонда G-actinRed для микроинъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот препарат составляет всего 2 л из 5 мг / мл рабочего запаса G-actinRed, так что если пользователи непривычны к методу микроинъекции, это выгодно, чтобы пропустить шаг 3 и практиковать микроинъекции с нейтральным буфером рН для сохранения драгоценного рабочего запаса. 10 мкг запас G-actinКрасный от поставщика могут храниться в оригинальной упаковке в 16 унций винт верхней банке с 500 г desiccant при 4 КК на срок до 6 месяцев.

  1. Подготовь решение для G-буферного запаса заранее: 5 мМ Трис-HCl, 0,2 мММ CaCl2, рН 8,0. Фильтр и хранить при комнатной температуре.
  2. В день инъекций подготовьте 1 мл G-буферного рабочего раствора в свежей микроцентрифуге крышки на льду с использованием G-буферного запаса от шага 2.1, дополненного следующими в указанных конечных концентрациях: 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 0,2 мМ АТФ, рН 8,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем работы G-буфера объемом 1 мл больше, чем требуется для эксперимента, но упрощает подготовку. Избыток может быть отброшен после эксперимента или пользователи могут сократить в зависимости от их предпочтений.
    1. Сохраняя 10 мкг G-actinКрасный бульон на льду, сначала добавить 1 йл фильтруемой, дистиллированной воды в верхней части розовой капли G-actinRed внутри трубки.
    2. Затем добавьте 1 мл холодного, свежеприготовленного рабочего решения G-буфера из шага 2.2. Труба вверх и вниз в 20 раз, чтобы хорошо перемешать с объемом пипетки установлен на 1 мкл. G-actinКрасный запас теперь будет на окончательное разбавление 5 мг/мл.
  3. Инкубировать подготовленный G-actinRed в течение 30 минут на льду спокойно.
  4. Центрифуга подготовленный G-актинкрасный при 16000 х г в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию в микроцентрифуге, чтобы удалить любой осадок.
  5. Тщательно пипетки 1,5 йл супернатанта в свежей крышкой оснастки микроцентрифуг трубки на льду, избегая темно-розовый гранулы.
  6. Храните подготовленный G-актинкрасный супернатант на льду до 6 ч, пока не будет готов к загрузке в микроиглу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроиглы можно заранее вытащить из капиллярных трубок на шкиве микропипеда, а затем хранить при комнатной температуре на полоске модели глины в чашке Петри диаметром 100 х 20 мм. Предлагаемые параметры для вытягивания микроиглы можно найти в Pipette Cookbook29.

3. Собирать эмбрионы и монтировать для инъекций

  1. Разрешить мухам выкладывать эмбрионы в течение 30 мин на тарелках яблочного сока с дрожжевой пастой при 18 градусах Цельсия.
  2. Пока мухи укладываются, предварительно разогревайте агарную тарелку яблочного сока без дрожжевой пасты до комнатной температуры, вырежьте прямоугольный клин яблочного сока агара длиной 4 см и поместите на 25 мм х 75 мм стеклянную горку.
    1. Урожай пластины из 30-минутного сбора и дехорионата эмбрионов путем заливки свежего отбеливателя, разбавленной 1:1 с дистиллированной водой, на тарелку и закрученного пластины в течение 1 мин,как описано в 28 (Рисунок 1, шаг 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные марки отбеливателя продаются в разных концентрациях. Отбеливатель, используемый здесь 6% гипохлорит натрия из бутылки и разбавлен до окончательной концентрации 3% гипохлорита натрия. Другие бренды отбеливателя при несколько более низких концентрациях будут работать одинаково хорошо.
    2. Налейте отбеливатель и dechorionated эмбрионов в корзину сбора (70 мкм клетки ситечко) и промыть пластину дважды дистиллированной водой из бутылки шприц, добавив эти моет в корзину сбора.
    3. Энергично промойте дехорионизированные эмбрионы в корзине сбора дистиллированной водой до тех пор, пока не будут видны дрожжевые сгустки и корзина не оставляет розовых следов от лишнего отбеливателя при смытости на бумажном полотенце.
  3. Используя кисть с щетиной, смоченной дистиллированной водой, перенесите дехорионированные и вымытые эмбрионы из корзины для сбора на подготовленный яблочный сок агар-клин на стеклянной горке.
  4. Используйте пару тонкого кончика пинцета или вскрытия иглы, чтобы организовать десять эмбрионов по прямой вдоль длинной оси прямоугольногоагар-клина (рисунок 1, шаг 3). Упорядочить эмбрионы голова к хвосту, так что их передний полюс обращен к правой и спинной стороне сталкивается с исследователем(рисунок 1, шаг 3, увеличенный).
  5. Отрежьте 0,5 см конца наконечника пипетки P200 лезвием бритвы и окунитесь в «эмбриональный клей» (описанныйв 28). Обильно пальто области 5 мм в ширину(рисунок 1, шаг 4) вдоль длинного края 24 мм х 50 мм прямоугольный крышкой, и дайте высохнуть, клей вверх. Сушка займет 30 с и будет завершена, как только весь клей покрытием области появляется матовый, а не мокрый или блестящий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте "эмбриональный клей" по крайней мере 48 ч заранее. Добавьте n-Heptane к полоскам односторонней ленты в флаконе сцинтилляции, как описано в28.
  6. После того, как "эмбрион клей" высохнет, осторожно поместите крышку клея сторону вниз на верхней части ряда выровненных эмбрионов на агар, оставляя 2-3 мм пространства между краем крышки и ряд эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прилипание эмбрионов слишком близко к краю крышки может привести к высыханию эмбрионов слишком много в ходе эксперимента.
  7. Переверните крышку над так, что эмбрионы в настоящее время сталкиваются вверх. Они должны быть застряли в линии вдоль одного длинного края крышки, и их брюшной области, обращенной к ближайшему краю крышки (Рисунок 1, шаг 4, увеличенный).
  8. Высасывайте эмбрионы, поместив крышку с эмбрионами мягко на вершине 150 г свежего синего desiccant хранится в 16 унций винт верхней банке. Плотно винт на крышке и инкубировать в течение 8-10 мин(рисунок 1, шаг 5).
  9. После высыхания, удалить крышки из desiccant банку и ленты каждой короткой стороне крышки на микроскоп слайд, эмбрион сторонувверх , с двумя 4см 2 куска двусторонний ленты так, что эмбрион coverslip будет соответствовать на стадии инъекции(рисунок 1, шаг 6).
  10. Добавьте 2-3 капли масла Halocarbon 27 с пипеткой Pasteur, чтобы покрыть выровненные эмбрионы и защитить их от дальнейшегообезвоживания (рисунок 1, шаг 6).

4. Инъекционные и тепловые эмбрионы стресса для содействия образованию актин стержня

ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекции делаются в комнате, контролируемой температурой, при температуре 18 градусов по Цельсию.

  1. Подготовка влажных инкубационные камеры из стеклянной чашки Петри по крайней мере 100 мм х 20 мм в размерах и линии камеры с поворотами лабораторных стеклоочистителей ткани смоченнойдистиллированной водой (рисунок 1, шаг 8). Предварительно разогреть инкубационной камеры при температуре 32 градусов по Цельсию или желаемую температуру инкубации до введения эмбрионов.
  2. Откройте клапан воздушного потока для микроинъектора и включите микроинъектор (подходит сжатый воздух или домашний воздух с давлением не менее 90 пси).
  3. В то время как эмбрионы высасывания, backload ранее подготовленных G-актинкрасный супернатант в микроиглы с помощью микро погрузчика отзыв. Установите пипетки, чтобы составить 1-1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вязкости актина, объемы загрузки не могут быть точными и может быть достаточно актина осталось загрузить по крайней мере один-два микроиглы. До 60 эмбрионов могут быть введены на загруженную микроиглу, если микроигла откалибровывается должным образом и не засоряется в ходе эксперимента.
  4. Прикрепите микроиглу к держателю иглы и затяните винт. Подключите воздушную трубку к микроинъектору и убедитесь, что давление обратного потока на микроигле эквилибраты до 30 hPa.
  5. Калибруйте настройки микроинъектора, чтобы изгнать пузырь диаметром 100 мкм G-actinRed (500 мл) на слайд-микрометре. Поверните ручку давления (500-1500 hPa) и ручку времени импульса впрыска (0.1-0.5 s) на микроинъекторе для того чтобы получить правый размер пузыря. Отрегулируйте эти настройки каждый раз, когда новый микроигл загружается для учета изменчивости в вязкости актина и размера наконечника микроиглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленный G-актинкрасный вязкий и может быть воздух в кончике микроиглы, которые должны быть исключены до введения эмбрионов. Если G-actinRed не легко изгоняется из кончика микроиглы, аккуратно разбейте кончик микроиглы по краю слайд-микрометра.
  6. Поместите слайд с установленными эмбрионами на сцену микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая инъекция создана будет отличаться, так что исследователи должны будут настроить их метод инъекции соответственно. Здесь эмбрионы перемещаются по стационарному микроиглу, вводя каждый эмбрион путем запуска эмбриона в микроиглу.
  7. Отрегулируйте стадию микроманипулятора и сосредоточьте цель 10x на световом микроскопе так, чтобы эмбрионы были видны. Эмбрионы находятся в правильной фокусной плоскости, когда очертания вителлиновой мембраны являются острыми и эмбрион кажется крупнейшим. Выберите эмбрионы для инъекций, которые находятся в правильной стадии развития, так что к тому времени, когда после инъекции инкубации завершена, большая часть сцепления достигает желаемой стадии развития (например, вводить эмбрионы на стадии Боунса 2-330 для того, чтобы наблюдать стержней при клетчатой после теплового стресса при температуре 32 градусов по Цельсию).
  8. Используйте элементы управления микроиглами, чтобы привести иглу в ту же фокусную плоскость, что и эмбрионы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если микроигла ловит на крышке при перемещении стадии или микроиглы, то микроигла слишком близко к слайду и не находится в правильной фокусной плоскости. Микроигла должна быть параллельно крышке, а не под значительным углом(рисунок 1, шаг 7).
  9. Вставьте микроиглу в эмбрион так, чтобы он попал в эмбрион в середине его брюшной области, на эмбрионе "экватор". Инъекция триггера с педалью ноги или кнопкой "впрыскить", когда кончик микроиглы виден внутри середины эмбриона(рисунок 1, шаг 7).
  10. Введать G-актинкрасный один раз и медленно удалить микроиглы. Переместите сцену и повторите для каждого эмбриона соответствующую стадию развития.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расширение эмбриона нормально, как G-актинкрасный вводится и немного цитоплазмы может просочиться из эмбриона.
  11. После того, как все эмбрионы были введены, поместите слайд с эмбрионами в подготовленную влажную инкубационную камеру и закройте крышку(рисунок 1, шаг 8). При попытке получить эмбрионы, которые достигают клеточной, тепло стресс эмбрионов при температуре 32 градусов по Цельсию в течение 60-75 мин во влажной инкубационой камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации отмечается, что позволяют визуализировать стержни в клеточной тепла подчеркнул эмбрионов. Инкубацио время будет больше для не теплового стресса контроля эмбрионов, потому что развитие будет медленнее при более низкойтемпературе 31. Эти контрольные эмбрионы могут быть инкубированы во влажных камерах при температурах, таких как 18 градусов по Цельсию или 25 градусов по Цельсию, в зависимости от конструкции конкретного эксперимента и вопроса, который необходимо задать. Минимальное время инкубации, необходимое для G-actinRed, чтобы рассеять по всему эмбриону составляет 30 мин.

5. Изображение актин стержней в тепло подчеркнул эмбрионов конфокальная микроскопия

  1. В то время как эмбрионы в настоящее время тепло подчеркнул, включите конфокальный микроскоп и выбрать 561 нм лазерного канала.
  2. Перемести объективный объектив (25x, 40x или 63x рекомендуется) на рабочую позицию.
  3. При визуализации тепла подчеркнул эмбрионов, а затем установить инкубатор нагретой стадии для достижения внутренней температуры 32 градусов по Цельсию. Точечный и стрелять или инфракрасный термометр может быть использован для проверки температуры на или вблизи цели.
  4. Удалите слайд с вводимых эмбрионов из влажной инкубационной камеры после инкубации завершена(рисунок 1, шаг 9).
  5. Работая быстро, аккуратно вырвать двустороннюю ленту штук, которые были использованы для прилипания крышки с установленными эмбрионами на слайде(рисунок 1, шаг 9).
    ВНИМАНИЕ: Будьте нежны во время этих шагов, как coverslips может легко разрушить, если слишком много силы применяется.
  6. Stick два 2,5 см в длину куски двусторонний ленты вместе и сократить ленту пополам вдоль, чтобы сделать две полосы, 2,5 х 0,5 см в длину(рисунок 1, шаг 10).
  7. Stick две трети длины каждой ленты полосы на первый coverslip, фланговые каждой стороне эмбрионов в Halocarbon 27 нефти (Рисунок 1, шаг 10, оранжевый), в результате чего одна треть ленты полосы висит от края первого крышки, где эмбрионы застряли. Используйте руки в перчатках и будьте осторожны, чтобы не коснуться эмбрионов во время этого шага.
  8. Аккуратно поместите второй прямоугольный крышку поверх ленточных полос, чтобы зажатие эмбрионов между крышками(рисунок 1, шаг 10, синий). Выровнять 25 мм края, но сохранить 50 мм края смещены друг от друга на 1 см в ширину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная поверхность этого второго крышки станет новой поверхностью изображения, которая столкнется с объективом цели, так что позаботьтесь, чтобы не получить отпечатки пальцев или Масло Halocarbon 27 на этой второй поверхности крышки. Смещение необходимо для того, чтобы дополнительное масло Halocarbon 27 можно было добавить, чтобы равномерно погрузить эмбрионы. При необходимости добавьте масло Halocarbon 27 в шов, где две крышки встречаются в верхней части сэндвича, и это покроет эмбрионы капиллярным действием (см. пунктирной линии на рисунке 1, шаг 10).
  9. Аккуратно нажмите вниз на области крышки, которые находятся непосредственно на верхней части ленты полосы с тупой стороной razorblade, чтобы получить крышку придерживаться ленты.
  10. Переверните сэндвич с крышкой и поместите на стеклоочиститель лабораторной ткани, чтобы сохранить поверхность изображения чистой и нести в конфокальный микроскоп(рисунок 1, шаг 11). Убедитесь, что лента полностью прилипает к обеим обложкам перед визуализацией.
  11. Подтвердите, что нагретая стадия находится при температуре и при использовании перевернутого микроскопа, добавьте жидкость для погружения в выбранную объективную линзу.
  12. Поместите сэндвич с крышкой на сцену тщательно, чтобы убедиться, что новая поверхность изображения(2-й крышкой) является одним касаясь погружения жидкости (Рисунок 1, шаг 11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, придерживаться крышки сэндвич на сцену с двумя небольшими кусочками двусторонний ленты для предотвращения ненужного движения во время изображения, если coverslips не вписываются хорошо в стадии нагревания.
  13. Сосредоточьтесь на эмбрионе, который находится в клеточной (Bownes этапе 4a30) или желаемой стадии развития с использованием либо передаваемого света или флуоресценции.
  14. После того, как эмбрион был привлечен к фокусу, переключитесь на режим лазерного приобретения на конфокальном микроскопе и отрегулируйте мощность и увеличение мощности лазера, размер рамы, плитку и настройки проекции по желанию.
  15. Сделайте снимки с поверхности через фокусные плоскости ядер эмбриона, чтобы найти внутриядерные актиновые стержни. Роды должны отображаться в нескольких ориентациях в виде ярких полос или точек внутри сравнительно темныхядер (рисунок 2A, 2C).

6. Альтернативные эксперименты с визуализацией

  1. Выполните FRAP для исследования актин оборота по длине внутриядерных актин стержней или в цитоплазмических структур актина, таких как кончики плазменной мембраны борозды во время клетчатой.
  2. В программном обеспечении для визуализации выберите прямоугольную область вокруг кончиков борозды или актиновые стержни, в которых будут проведены эксперименты.
  3. Выберите небольшую квадратную область центра актин стержня в прямоугольной области приобретения для отбеливания. Убедитесь, что кончики актин стержня видны и не отбеливаться в ходе эксперимента, чтобы обеспечить точное отслеживание стержня внутри ядра.
  4. Установите отбеливатель лазер для итерировать 50x и установить мощность лазера отбеливателя до максимума.
  5. Выберите курс времени для получения изображений каждую секунду в общей сложности до 120 с на максимальной скорости пиксельного жителя и установите лазер для отбеливания после первых двух секунд получения изображения.
  6. Количественная оценка данных для определения половины времени восстановления флуоресценции1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схематический рабочий процесс обработки эмбрионов изображен на рисунке 1,а расписание типичного эксперимента представлено в таблице 1. Оценка хорошего экспериментального результата заключается в том, что на каждые 10 вводимых эмбрионов, по крайней мере половина эмбрионов рассматривается будет на правильной стадии развития, неповрежденной, и проявляют надежную ASR с тепловым стрессом при температуре 32 градусов по Цельсию. Об этом ASR будет свидетельствует сборка внутриядерн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Значение этого метода заключается втом,что он использует устоявшийся протокол микроинъекции в дрозофила эмбрионов 21,22,23,24,25,26,27, чтобы новые исследования в отношении ASR и сопровождающих актин стержня сборки. Основным преимуществом инъекций G-actinRed в живые эмбри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Никакого конфликта интересов не объявлено.

Благодарности

Авторы с благодарностью признают работу Лиулиу Чжэна и Цзэнхуэй Сюэ, которые помогли пионером этой техники в лаборатории Sokac, а также Хасана Сидэ, который помог с анализом. Работа по этому исследованию финансируется за счет гранта NIH (R01 GM115111).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аденозинтрифосфат (АТФ)Millipore-SigmaA23835Gкомпонент буфера G
Яблочный сок, Mott's, 64 жидких унцийMott's014800000344Компонент пластин яблочного сока
Bacto AgarBD214010Компонент пластин яблочного сока
Bleach, PureBright Germicidal, 6,0% гипохлорита натрияKIK International059647210020Для дехорионизирующих эмбрионов
Хлорид кальцияMillipore-SigmaC1016500Gкомпонент буферного
фильтра G, 70 мкм; mFalcon352350Для сбора дехорионированных эмбрионов
Конфокальный микроскоп, LSM 880 34-канальный с AiryscanZeiss0000001994956Для визуализации внутриядерных актиновых стержней
DesiccantDrierite24001Для сушки эмбрионов
Препарирующий микроскоп, Stemi 508 Стереоскоп с зумом 8:1Zeiss4350649000000Для размещения эмбрионов на агаровом клине
Игла для препарирования, 5 вFisher Scientific08965AДля размещения эмбрионов на агаровом клине
Дитиотреитол (DTT)Fisher ScientificBP1725Компонент G буферная
двусторонняя лента, скотч постоянный, 0,5 in x 250 in3M021200010323Для изготовления клея для эмбрионов
Клей для сбора эмбрионов Клетка для сбора эмбрионовGenessee Scientific59100Для размещения взрослых мух и сбора эмбрионов
Пинцет с тонким кончиком, Dumont Tweezer, Style 5Электронная микроскопия Sciences72701DДля размещения эмбрионов на агаровом клине
Стеклянные капилляры, боросилликатное стекло, тонкие 1 мм x 0,75 ммWorld Precision Instruments, Inc.TW1004Для микроигл
Галокарбоновое масло 27Millipore-SigmaH8773100MLДля гидратации эмбрионов
Инкубатор с подогревомZeiss4118579020000, 4118609020000, 4118609010000Для конфокальной визуализации
Лабораторные салфетки, KimWipesKimberly-Clark34155Лабораторные салфетки
Световой микроскоп, Invertoskop 40C Инвертированный фазовый контраст микроскоп, восстановленныйZeissСнятый с производстваинъекционный микроскоп
Метил-4-гидроксибензоатMillipore-SigmaH36471KGКомпонент пластин для яблочного сока
Микроинъектор, FemtoJet4xEppendorf5253000025Микроинъектор
Микрозагрузчик наконечников, epT.I.P.S. 20 μ LEppendorf5242956003Для загрузки микроигл
Микроманипулятор и инъекционный каскад с дисками x,y,z для регулировки иглBernard Instruments, Inc (Хьюстон, Техас)ПользовательскийДля выполнения микроинъекций
Вытягиватель микропипеток, модель P-97, Flaming/BrownSutter InstrumentsP97Для вытягивания капиллярных трубок для изготовления
микроигл Защитное стекло микроскопа 24x50-1,5Fisher Scientific12544EДля крепления эмбрионов
Предметные стекла для микроскопа, Сиреневый Colorfrost, предварительно очищенный, 25 x 75 x 1 ммFisher Scientific22037081Для монтажа эмбрионов для инъекций
н-гептанFisher ScientificH3601Компонент клея для эмбрионов
Объектив, 10xZeissСнят с производства10x Объектив для инъекционного микроскопа
Объектив, C-Apochromat 40x/1,2 Вт корр. FCSZeiss421767997171140x водный объектив для конфокального
объектива, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 для масла, воды, силиконового масла или глицерина иммерсионный (D=0-0.17мм) (WD=0.57мм при D=0.17мм)Zeiss420852987100025x смешанный иммерсионный объектив для конфокального
объектива, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Масляный DIC f/ELYRAZeiss420782990079963x масляный объектив для конфокальных
Кисть, Robert Simmons Expression E85 Заостренная круглая размер 2Daler-Rowney038372016954Для переноса
эмбрионов Бумажные полотенца, Kleenex C-fold бумажные полотенца, белыеKimberly-Clark884266344845Для промокания клеточного фильтра
Пипетка Пастера, 5 3/4 inFisher Scientific1367820AДля покрытия эмбрионов маслом
чашка Петри, стекло, 100 x 20 ммCorning3160102Для влажной инкубационной камеры
чашка Петри, пластик, 60 x 15 ммVWR25384092Для тарелок для яблочного сока
Pipette, Eppendorf Reference 0,5-10 μ LEppendorf2231000604Для загрузки микроигольчатого
наконечника для дозатора, xTIP4 250 μ LBiotix63300006Для добавления зародышевого клея в покровное стекло
Лезвиебритвы VWR55411050Для резки агарового клина, ленты, наконечников пипеток
Родамин сопряженный глобулярный актин, тромбоциты человека (немышечные; 4x10 & мкм; g)Cytoskeleton, Inc.APHR-AG-актин^Красный
сцинтилляционный флакон, 20 мл Стеклоборосилликат с полиэтиленовым вкладышем и крышками мочевиныFisher Scientific033377Для изготовления клея для эмбрионов
Завинчивающаяся верхняя банка, 16 унцийNalgene000194414195Для сушки эмбрионов
Стадия микрометраЭлектронная микроскопия Sciences602104PGДля калибровки объема инъекций G-актина
СахарозаMillipore-Sigma840971KGКомпонент пластин для яблочного сока
Тризма основаMillipore-SigmaT15031KGКомпонент G-буферных
дрожжей, дрожжи Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 унцииLesaffre Yeast Corporation117929157002Компонент дрожжевой пасты

Ссылки

  1. Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
  2. Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
  3. Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
  4. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
  5. Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
  6. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  7. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
  8. Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
  9. Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
  10. Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
  11. Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
  12. Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
  13. Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
  14. Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
  15. Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
  16. Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
  17. Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
  18. Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
  19. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  20. Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
  21. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).
  22. Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).
  23. Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).
  24. Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).
  25. Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).
  26. Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
  27. Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
  28. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).
  29. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
  30. Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
  31. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
  32. Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Тепловой стрессметод микроинъекцийконфокальная микроскопияэксперименты FRAPG-актин Redстрессовый ответ актинамонтаж эмбрионавосстановление флуоресценции
Изображение Внутриядерных Actin Роды в Live Heat подчеркнул Drosophila эмбрионов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.