Методическая статья

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

DOI:

10.3791/61298

⸱

16 июля 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол для определения олигомерного состояния мембранных белков, который использует наночастицу родной клеточной мембраны в сочетании с электронной микроскопией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белково-белковые взаимодействия в клеточных мембранных системах играют решающую роль в широком диапазоне биологических процессов - от взаимодействия клеток к клетке до трансдукции сигнала; от зондирования экологических сигналов до биологической реакции; от метаболической регуляции до контроля развития. Точная структурная информация белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для понимания молекулярных механизмов мембранных белковых комплексов и для разработки высокоспецифических молекул для модулирования этих белков. Для обнаружения и анализа белково-белковых взаимодействий были разработаны многие подходы in vivo и in vitro. Среди них структурный подход биологии уникален тем, что он может обеспечить прямую структурную информацию белково-белковых взаимодействий на атомном уровне. Тем не менее, текущая мембрана белка структурной биологии по-прежнему в значительной степени ограничивается моющих средств на основе методов. Основным недостатком моющих средств на основе методов является то, что они часто диссоциируют или денатурации мембраны белковых комплексов, как только их родной липидный двуслой окружающей среды удаляется моющих средств молекул. Мы разрабатываем родная клеточная мембранная наночастица системы мембранного белка структурной биологии. Здесь мы демонстрируем использование этой системы в анализе белково-белковых взаимодействий на клеточной мембране с помощью исследования олигомерного состояния AcrB.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) играют ключевую роль на протяжении всей биологии, от поддержания структуры и функции белков до регуляции целых систем. ИЦП бывают разных форм и могут быть классифицированы в зависимости от того, какие типы взаимодействий они формируют. Одной из таких категоризации является гомоолигомерная или гетероолигомерная, основанная на том, находятся ли взаимодействия между идентичными субъединицами или различными белками, действующими в качестве субъедилентов. Другая категоризация основана на силе взаимодействия, если взаимодействия приводят к формированию стабильных комплексов или переходных сложных состояний. Структурная информация о ИЦП между белками имеет решающее значение для понимания механизма, с помощью которого белки выполняют свою функцию. Было подсчитано, что более 80% белков полагаются на сложное образование для того, чтобы выполнять свои функциональные функции1. Учитывая процент белков наблюдается полагаться на ИЦП для надлежащего врожденного функционирования их значение в биологии является очевидным, но возможность правильно исследовать белки, которые участвуют в этих взаимодействий остается сложной задачей из-за ограничений в методах, доступных для экспериментального наблюдения, когда белки формируют ИЦП.

Существует высокая степень разногласий между результатами для многих экспериментально определенных ИЦП из-за большого количества шума, ложных срабатываний и ложных негативов, которые являются производными от многих из имеющихся в настоящее время методов определения ИЦП. Это особенно актуально для дрожжей двух-гибридной (Y2H) системы, тандем сродства очистки массы спектрометрии (TAP-MS), и флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET), которые представляют собой три изнаиболее часто используемых методов дляопределения ИЦП 2,3,4,5,6,7. Для сравнения, методы структурной биологии белка, такие как ядерный магнитный резонанс (NMR), рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия (EM), могут быть использованы для получения структурной информации высокого разрешения о белково-белковых взаимодействиях вплоть до атомного уровня и позволяют прямое визуальное подтверждение взаимодействий, происходящих для целевого белка интереса. Все имеющиеся в настоящее время неконституции на основе ИЦП определения методов исследования (например, Y2H, TAP-MS, и FRET) не имеют этой способности и дополнительно страдают от трудностей в выявлении слабых и переходных взаимодействий междубелками 5. Эти недостатки еще больше усиливаются при изучении мембранных белков из-за дополнительной сложности, вызванной дополнительной переменной липидной среды, которая влияет на формирование надлежащей четвертичных структур и гетеромерной сложной сборки.

Мембранные белки составляют большую часть протеома и, как известно, играют важную роль в надлежащем функционировании клеток во всех живых организмах. Несмотря на то, что мембранные белки, по оценкам, составляют 27% генома человека и составляют 60% от всех текущих целей наркотиков есть серьезная аномалия в количестве решенных моделей мембранных белков, которые составляют лишь 2,2% от всех опубликованныхбелковых структур 8,9,10. Основная причина расхождения в доступности структурной информации заключается в внутренних свойствах самих мембранных белков. Из-за их плохой solubility, опоры на взаимодействия с липидной средой для поддержания родной структуры и функции, и различные физико-химические свойства самой липидной мембраны, мембранные белки продолжают представлять собой существенную проблему при реализации структурных методов биологии для их изучения. Из этих свойств, наиболее важным для получения точной структурной информации является требование иметь взаимодействия с их естественной липидной среды для них, чтобы сохранить свою родную структуру и функцию. Липидная среда является такой неотъемлемой частью структуры и функции мембранных белков, что концепция memtein (сочетание слов мембраны и белка) была предложена в качестве основной единицы мембраны-белковой структуры ифункции 11. Несмотря на важность липидно-белковых взаимодействий, имеющиеся в настоящее время методы определения ИЦП на основе структуры часто требуют, чтобы изучаемые белки были растворимыми или растворялись моющими средствами. Воздействие суровых моющих средств может денатурировать белки или вызвать ложные срабатывания и негативы из-за делипидации, которые могут вызвать агрегацию, денатурацию белка, диссоциацию нековалентных взаимодействий и образование искусственных олигомерных состояний. В связи с необходимостью поддержания естественной липидной среды для точного определения родного олигомерного состояния мембранных белков мы разработали систему наночастиц коренных клеток Membrane (NCMNs)12 на основе ранее зарегистрированного метода Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.

SMALP использует стирола мужской кислоты кополитера в качестве мембраны активного полимера для извлечения и solubilize мембранных белков. Поли (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) является уникальным амфифилическим полимером из-за его гидрофобного стирола moiety и диаметрально противоположных гидрофильных мужских кислот moiety. Он образует наночастицы путем адсорбирования, дестабилизации и нарушения клеточной мембраны в рН-зависимом механизме14. Эта функциональная деятельность SMA является то, что позволяет использовать его в качестве моющего средства свободной системы для извлечения мембранного белка и solubilization. Система NCMN отличается от системы SMALP по нескольким аспектам. Самой уникальной особенностью системы NCMN является то, что она имеет мембранную активную полимерную библиотеку с множеством полимеров, которые имеют уникальные свойства, которые делают их пригодными для изоляции различных мембранных белков, которые требуют различных условий для стабильности и постоянного функционирования. Система NCMN также имеет различные протоколы по сравнению с методом SMALP, когда дело доходит до подготовки наночастиц. Одним из таких примеров является то, что NCMNs используют одноступенчатую очистку столбца сродства никеля для определения структуры с высоким разрешением; эффект этих различных протоколов можно наблюдать при сравнении протокола NCMNs, который генерируется 3,2 и 3,0 кро-EM AcrB структур, с аналогичным исследованием с использованием метода SMALP, в результате чего крио-EM AcrB структуры на 8,8й разрешение 12,15. Эти уникальные особенности системы NCMN являются улучшения, сделанные на ранее установленный метод SMALP и сделать его идеальным кандидатом для изучения ИЦП.

Многоразовой эффлюкс транспортер AcrB существует как функциональный гомотример в кишечной палочке12. Мутагеничный анализ показал, что одна мутация точки P223G, расположенная на петле, которая отвечает за стабильность тримера AcrB, дестабилизирует состояние тримера и дает мономер AcrB при приготовлении с моющим средством DDM, который может быть обнаружен с помощью родного синегогеля электрофорез 16. Тем не менее, анализ FRET мутанта AcrB-P223G показал, что, когда в среде липидного бислойного облизываемых клеток, большинство мутантов AcrB-P223G все еще существовали как тример и что уровни экспрессии как для дикого типа AcrB, так и для AcrB-P223G похожи. Тем не менее, несмотря на результаты анализа FRET, анализ активности для мутантного транспортера показал, что активность резко снизилась по сравнению с диким типом16. Хотя технология FRET широко используется для анализа белково-белковых взаимодействий, исследования показали, что она часто может давать ложныесрабатывания 17,18,19,20.

Недавно были определены крио-ЭМ-структуры тримера AcrB, которые показали взаимодействие AcrB с связанным с ним липидным бислойным бислойным липидным бислоем изместных клетокс помощью NCMNs 12 . В принципе, NCMNs можно охотно использовать для анализа взаимодействий протеин-протеина найденных на родной мембране клетки. В ходе испытания этой системы были проведены эксперименты по непосредственному наблюдаю за олигомерным состоянием AcrB-P223G с использованием наночастиц наночастиц на мембраны родных клеток и отрицательной окрашивающей электронной микроскопией. Для сравнения с наночастицами дикого типа AcrB мы использовали тот же мембранный активный полимер (SMA2000, сделанный в нашей лаборатории, который индексирован как NCMNP1-1 в библиотеке NCMN), используемый для определения структуры AcrB с высоким разрешением и альтернативных полимеров, найденных в библиотеке NCMNs12. Основываясь на ранее сообщенных результатах, ожидалось, что большинство мутантов AcrB-P223G будет существовать в виде тримерных наночастицнаночастиц на мембраны родной клетки 21. Тем не менее, не AcrB тримеры были найдены присутствующих в образце, таких, как те, которые наблюдались с диким типом AcrB. Это говорит о том, что большинство AcrB-P223G не формирует тримеры на мембране родной клетки, как предполагалось ранее.

Здесь мы сообщаем подробный анализ мутанта E. coli AcrB-P223G в сравнении с диким типом E. coli AcrB с использованием NCMNs. Это исследование AcrB предполагает, что NCMNs является хорошей системой для анализа взаимодействия белка и белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выражение белка

  1. Прививка 15 мл потрясающий бульон (ТБ) СМИ с антибиотиками, специфичные для плазмидов с BL21(DE3) pLysS клеток, содержащих AcrB экспрессии плазмидов в 50 мл трубки ночь при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 250 об/мин.
  2. Проверьте оптическую плотность ночной культуры на 600 нм (OD600) и убедитесь, что она составляет более 2,0.
  3. Разбавить 5 мл клеточной культуры в 1 л противотуберкулезных средств, содержащих антибиотики, специфичные для плазмидов и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания до OD6000,8, а затем вызвать с IPTG, который имеет окончательную концентрацию 1 мМ.
  4. Провести индукцию при 20 градусов по Цельсию со встряхивания в течение 20 ч.
  5. Пеллет вниз клетки с помощью центрифугации в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию и 4000 х г.

2. Клеточныйлиз и мембранная изоляция

  1. Повторное использование клеточной гранулы в буфере A(таблица 1, использование DDM Buffer A или NCMNs Buffer A в зависимости от схемы очистки, которая должна следовать) с использованием 80 мл на каждые 20 г клеточной гранулы.
  2. Гомогенизировать перерасход гранулы клеток с помощью стекла Dounce гомогенизатор при температуре 4 градусов по Цельсию или если при комнатной температуре не забудьте поставить на лед сразу после.
  3. Перенесите образец в металлический стакан на льду и высасывайте клетки, загрузив их в гомогенизатор высокого давления при 4 градусах Цельсия и 1500 бар.
    1. Повторите процесс загрузки клеток в гомогенизатор и позволяя им проходить через гомогенизатор в течение 3-4 циклов или до тех пор, пока лизат не начнет проясняться.
  4. Центрифуга лизате при 15 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
  5. Соберите супернатант и загрузите в ультрацентрифуговые трубки и центрифугу при 215 000 х г за 1 ч при 4 градусах Цельсия.
  6. Откажитесь от супернатанта и соберите мембранные гранулы из ультрацентрифуговых трубок. Храните излишки мембранных гранул при -80 градусов по Цельсию.

3. Подготовка наночастиц наночастиц на мембраны родных клеток

  1. Resuspend 1 г мембранных гранул в 10 мл NCMNs Buffer A (Таблица 1).
  2. Гомогенизировать образец повторной клеточной мембраны со стеклянным гомогенизатором Dounce при 20 градусах Цельсия.
  3. Перенесите подвесной образец мембраны в полипропиленую трубку 50 мл и добавьте мембранный активный полимерный раствор и дополнительные NCMNs Buffer A, чтобы довести образец до конечной концентрации 2,5% (w/v) мембранного активного полимера (NCMNP1-1 или NCMNP5-2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы мембранных активных полимеров должны быть сделаны в двойной дистиллированной воде и могут храниться в различных концентрациях, но, как правило, 10% (w/v).
  4. Встряхните образец в течение 2 ч при 20 градусах Цельсия.
  5. Загрузите образец в ультрацентрифуг и вращайте при 150 000 х г в течение 1 ч при 20 градусах Цельсия.
  6. В то время как образец в настоящее время ультра-центрифугированных начинают уравночные 5 мл Ni-NTA колонки с 25 мл NCMNs Buffer A.
  7. Соберите супернатант после ультрацентрифугации и загрузите его на 5 мл колонки Ni-NTA при комнатной температуре со скоростью потока 0,5 мл/мин с помощью шприц-насоса.
  8. Вымойте быструю белковую жидкую хроматографию (FPLC) линиями с достаточным количеством NCMNs Buffer B(таблица 1),чтобы полностью промыть систему, а затем подключить столбец к машине FPLC.
  9. Вымойте столбец с 30 мл NCMNs Buffer B с скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
  10. Вымойте столбец с 30 мл NCMNs Buffer C (Таблица 1) с скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
  11. Уберите белок с 20 мл NCMNs Buffer D(таблица 1) со скоростью потока 0,5 мл/мин и соберите образец с помощью коллектора фракций и фракций, каждая из которых устанавливается до 1,0 мл.
  12. Храните образцы белка при 4 градусах Цельсия.
  13. Запустите SDS-PAGE гель электрофорез анализа для того, чтобы проверить образцы, которые соответствуют пикам наблюдается на графике FPLC elution.

4. Электрофорез геля SDS-PAGE

  1. Подготовьте литье камеры, зажимая стекло для литья аппарата.
  2. Подготовка 12% разделение гель в соответствии с рецептом, перечисленным в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только TEMED добавляется гель будет полимеризировать быстро так только добавить это один раз готовы залить гель.
  3. Налейте гель, оставляя 2 см ниже нижней части гребня для укладки геля.
  4. Удалите пузырьки, наслоив верхнюю часть геля 100% изопропанолом и подождите, пока гель разделения полимеризуется.
  5. Удалите изопропанол и вымойте любые следы изопропанола дистиллированной водой.
  6. Подготовка укладки геля в соответствии с рецептом, перечисленным в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только TEMED добавляется гель будет полимеризировать быстро так только добавить это один раз готовы залить гель.
  7. Налейте укладку геля поверх геля разделения.
  8. Добавить гребень в камеру, чтобы сформировать колодцы и ждать укладки гель полностью полимеризации.
  9. Поместите 1 МКЛ из 1 МТТ в микроцентрифугную трубку для каждого образца фракции, который должен быть запущен на геле.
  10. Добавьте 7 йл буфера загрузки 4x к каждой трубке также.
  11. Добавьте 20 МКЛ образца из фракций, которые должны быть запущены на гель для каждой микроцентрифуг трубки.
  12. Вихрь труб, содержащих образцы.
  13. Спин вниз образца труб с помощью столешницы микроцентрифуг для 3 с и убедитесь, что все образцы вернулись в нижней части труб.
  14. Подготовьте гель-электрофорезную клетку, закрепив 12% полиакриламинидную гелевую кассету на место и заполнив внутренние и внешние камеры клетки буфером Tris-acetate-EDTA (TAE)(таблица 1).
  15. Загрузите молекулярный маркер веса в первую полосу геля с соответствующим объемом, требуемым его инструкциями.
  16. Загрузите 28 МКЛ образца из каждой трубки, смешанной с DTT и буфером загрузки.
  17. Поместите крышку электрофорезной ячейки поверх коробки и подключите крышку к электросети.
  18. Включите источник питания и установите его до 100 В и дайте ему работать в течение 20 минут.
  19. Через 20 минут увеличьте ток питания до 140 В и продолжайте запускать его еще 30-40 минут или до тех пор, пока полоса погрузочного буферного красителя не достигнет дна кассеты с гелем.
  20. После завершения электрофорез пятно и де-пятно гель, чтобы визуализировать белковые полосы, содержащиеся в гель.

5. Очистка белка с помощью DDM

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель проведения этого процесса очистки заключается в том, чтобы служить в качестве контроля для экспериментов с использованием мембранных активных полимеров.

  1. Resuspend 6-10 г мембранных гранул, от шага 2.6, в DDM Buffer A (Таблица 1) с использованием 5 мл/г мембранных гранул.
  2. Гомогенизировать перерасход образца со стеклом Dounce гомогенизатор при температуре 4 градусов по Цельсию или если при комнатной температуре не забудьте поставить на лед сразу после.
  3. Перенесите образец в 50 мл полипропиленовой трубки и добавьте DDM и дополнительный DDM Buffer A, чтобы довести образец до конечной концентрации 2% DDM.
  4. Встряхните образец в течение 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  5. Загрузите образец в ультрацентрифуговые трубки и центрифугу на 1 ч при 4 градусах Цельсия и 150 000 х г.
  6. В то время как образец в настоящее время ультра-центрифугированных начинают готовить 5 мл колонки Ni-NTA путем мытья с 25 мл DDM Buffer A (Таблица 1).
  7. После завершения ультрацентрифугации соберите супернатант и загрузите его на 5 мл колонки Ni-NTA при скорости потока 0,5 мл/мин с помощью шприц-насоса.
  8. Вымойте линии FPLC с достаточным DDM Buffer B и 0,05% DDM(таблица 1), чтобы полностью промыть систему, а затем прикрепить столбец к машине FPLC.
  9. Вымойте столбец с 30 мл DDM Buffer B и 0,05% DDM со скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
  10. Вымойте столбец с 30 мл DDM Buffer C и 0,05% DDM(таблица 1) со скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
  11. Уберите белок с 20 мл DDM Buffer D и 0,05% DDM(таблица 1) при скорости потока 0,5 мл/мин и соберите поток с помощью коллектора фракций и фракций, каждая из которых устанавливается до 1,0 мл.
  12. Выберите фракции, содержащие пик элюции для объединения и концентрации, используя центробежный концентратор и центрифугирование на уровне 4000 х г и 4 градусов по Цельсию до достижения 500 МКЛ.
  13. Используя цикл 500 йл, загрузите образец в машину FPLC, а затем на столбец исключения размером 25 мл при 4 градусах Цельсия. Elute с использованием 30 мл DDM Buffer E и 0,05% DDM(таблица 1) при скорости потока 0,5 мл/мин и собирать в качестве фракций с размерами фракции установлен на уровне 0,5 мл на фракцию.
  14. Возьмите фракции и измерить концентрацию белка с помощью 280 нм абсорбции для подтверждения УФ-Vis кривой из графика FPLC elution.
  15. Соберите 20 йл с каждой фракции выборки, которые соответствуют пикам, наблюдаемым на графике FPLC elution, и было подтверждено, что они точны с тестом на абсорбцию.
  16. Заморозить оставшуюся часть этих фракций образца с использованием жидкого азота или сухого льда в желаемых алицитах и хранить образцы белка при -80 градусов по Цельсию.
  17. Запустите SDS-PAGE гель электрофорез анализ, как описано ранее, чтобы проверить образцы, которые соответствуют пикам, наблюдаемым на графике FPLC elution.

6. Отрицательная подготовка сетки пятна

  1. Поместите сетки, которые будут использоваться для подготовки образца, на стеклянной горке, завернутой в фильтровальную бумагу с углеродной стороной вверх.
  2. Поместите стеклянную горку с сетками электронного микроскопа в камеру разгрузщика свечения между двумя электродами и замените стеклянную крышку, убедившись, что она по центру и хорошо запечатана.
  3. Запустите светясь разгрузив машину и убедитесь, что фиолетовый свет, генерируемый плазмой, виден.
  4. Когда машина будет запущена, подождите, пока камера не достигла атмосферного давления, чтобы снять стеклянную крышку, а затем вернуть слайд с сетками на скамейку, где образцы будут загружены на них.
  5. Отрегулируйте концентрацию очищенных образцов белка примерно до 0,1 мг/мл, либо разбавляя образец соответствующим буфером, либо концентрируясь с помощью центробежного концентратора.
  6. Загрузите 3,5 мл образца белка на 10 нм толщиной углеродной сетки и подождите 1 мин.
  7. Удалите жидкость с поверхности сетки EM с помощью фильтровальной бумаги.
  8. Вымойте поверхность сетки 3x, подбирая 3 капли воды с сеткой и удаление воды из сетки с фильтровальной бумагой между собирание каждой капли.
  9. Вымойте поверхность сетки 2x, подбирая 3 капли свежих, фильтрованных 2% ацетата урана и удалить растворы мытья на сетке с фильтровальной бумагой между собирание каждой капли.
  10. Пятно сетки с каплей 3 йл свежего, фильтрованного 2% ацетата урана в течение 1 мин.
  11. Удалите раствор ацетата урана на поверхности сетки EM с помощью фильтровальной бумаги и высушите сетку не менее 1 мин.
  12. Храните сетку в сетке для более длительного использования.

7. EM изображения

  1. Загрузите подготовленную сетку в держатель сетки на безопасной рабочей скамье.
  2. Подготовьте микроскоп, поместив микроскопы dewar в полистирол поле и заполнить двойной 3/4th полный жидкого азота.
  3. Подтвердите, что резиновая крышка окна микроскопа покрывает его, а затем загрузить двойки на микроскоп, поместив медные провода в двойки, пока он не помещается на платформе.
  4. Заполните оставшуюся часть двойки жидким азотом и поместите крышку поверх двойки, чтобы покрыть ее.
  5. Включите высокое напряжение, состояние микроскопа, и ждать микроскопа, чтобы согреться и установить безопасный уровень вакуума для использования.
  6. После того, как микроскоп готов открыть клапан колонки и подтвердить луч присутствует, удалив резиновую крышку на микроскоп окно.
  7. Проверьте клеймо луча путем распространения в и из путем корректировки интенсивности пучка. Если астигматизм присутствует, луч будет иметь эллиптической формы, как один отходит от перекрестного и луч должен быть той же овальной формы с обеих сторон.
  8. Отрегулируйте бинокль микроскопа, чтобы быть правильной высотой и расстоянием в соответствии с глазами наблюдателя.
  9. Проверьте позиционирование луча для поиска, Фокус, и режимы экспозиции, езда на велосипеде через все три режима, пока луч находится в центре в каждом.
  10. Закройте столбец клапана и перейти к загрузке держателя сетки в электронный микроскоп.
  11. Отрегулируйте микроскоп до eucentric высоты с помощью функции воблер микроскопов и регулировки движения сцены с помощью оси З, пока не будет из стороны в сторону движения образца в центре.
  12. Используя режим поиска низких доз на микроскопе, ищите сетку для желаемой области разумного контраста с присутствующими молекулами образца, чтобы сосредоточиться на образце.
  13. Сосредоточьтесь на примере в режиме Фокус, используя высокий размер шага, пока не будет виден образец, а затем уменьшите шаги, чтобы найти правильный уровень фокусировки.
  14. Нулевой и пустой луч, а затем убедитесь, что резиновая колодка покрывает окно микроскопа.
  15. Используя режим Экспозиции, сделайте изображение нужной области сетки для экспозиции 1 с при увеличении в 62 000 раз и проверьте полученное изображение.
  16. При выполненной визуализации сетка закрывает клапаны столбца и удаляет держатель сетки из столбца.
  17. При законченной визуализации все сетки, представляющие интерес, выключают микроскоп, выключая мощность нити и удаляя живойну жидкого азота из микроскопа.
  18. Поместите что-то поглощать влагу на стенде, где девар сидел, чтобы поймать конденсат из медных катушек микроскопа.
  19. Активируйте режим Cryo Cycle и убедитесь, что турбо-насос выключен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя представленные здесь процедуры, были очищены образцы дикого типа E. coli AcrB и мутанта E. coli AcrB-P223G. Образцы были затем адсорбированы до углеродного отрицательного пятна электронной микроскопии сетки и окрашенных с помощью уранил ацетата с боковойметодом blotting 22. Отрицательные изображения пятен были собраны с помощью электронной микроскопии передачи. Отрицательное пятно изображения для AcrB дикий тип образца очищены с DDM показывает однородное решение монодис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белково-белковые взаимодействия важны для целостности структуры и функции мембранных белков. Многие подходы были разработаны для исследования белково-белковых взаимодействий. По сравнению с растворимыми белками мембранные белки и их ИЦП труднее изучать из-за уникальных внутренних свойств мембранных белков. Эта трудность в основном исходит от требования мембранных белков, которые должны быть встроены в родной липидной среды двуслойных для структурной стабильности и функциональности. Это становится проблематичным, потому ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.G указан как изобретатель мембранного активного полимера NCMNP5-2 и системы NCMN.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано VCU стартовый фонд (для YG) и Национальный институт общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R01GM132329 (к YG) Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Мы благодарим Монтсеррат Самсо и Кевина МакРоберта за их щедрую поддержку видеозаписи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>химикаты
30% акриламид/BIS SOL (37,5:1)Bio-Rad161-0158
4x Буфер для образцов Laemmli (загрузочный буфер)Bio-Rad1610747
уксусная кислота ледянойThermoFisher ScientificA38S-212
Персульфат аммония (APS)Bio-Rad161-0700
ХлорамфениколGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 порошок для окрашивания белкаBio-Rad161-0400
DTT (Дитиотреитол) (> 99% чистоты) без протеазыGoldbioDTT10
ГлицеринThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
Имидазолаффиметрикс1 кг
IPTGGoldbioI2481C100
КанамицинGoldbioK-120-25
Магния хлорид гексагидратThermoFisher ScientificAA3622636
МетанолThermoFisher ScientificA412-4
N,N-диметилэтилендиамин (ЭДТА)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Еще не поступил в продажуОтправьте запрос на получение автору-корреспонденту
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Додецилсульфат натрия)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleyОтправьте запрос на получение автору-корреспонденту
Хлорид натрияThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Потрясающий бульон МедиаAffymetrix75856 1 кг
трис BaseBio-Rad161-0719
УранилацетатAmbinterAmb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Угольные электронные сетки для микроскопа (10 нм)Электронная микроскопия наукиCF300-Cu-TH Con-Torque
Гомогенизатор тканейEberbachE7265
Мини-микроцентрифуга Corning LSEThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Вертикальный электрофорезBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 СпектрофотометрThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K УльтрацентрифугаBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO EASIGlow Glow Glow Discharge Система очисткиTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Безопасная шлифовальная машинаWheaton358013
PowerPac Базовый источник питанияBio-Rad164-5050
Razel R99-E Шприцевой насосс регулируемой скоростьюRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Увеличение 10/300 GLGE Здравоохранение Медико-биологические науки28990944
Tecnai F20 200 кВFEI
тип 70 Ti Ротор с фиксированным угломнаклона Beckman Coulter
General Materials
1,5 мл Микроцентрифужные пробиркиThermoFisher Scientific05-408-129
4 мл Amicon Ultra-4 30 кДаMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 мл Коническая центрифугаThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml КолонкаGE Healthcare LifeSciences 17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
: , , , , , , Коллектор фракции

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50(2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390(2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGE

Похожие статьи