Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях

4.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61299

⸱

2 июля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен химически определенный протокол для получения почек-подоцитов человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с высокой эффективностью (>90%) и независимо от генетических манипуляций или отбора субпопуляций. Этот протокол производит желаемый тип клеток в течение 26 дней и может быть полезен для тестирования нефротоксичности и моделирования заболеваний.

Аннотация

Заболевание почек поражает более 10% мирового населения и обходится в миллиарды долларов федеральных расходов. Наиболее тяжелые формы заболевания почек и возможная конечная стадия почечной недостаточности часто вызваны повреждением клубочковых подоцитов, которые являются высокоспециализированными эпителиальными клетками, которые функционируют вместе с эндотелиальными клетками и клубочковой базальной мембраной для формирования фильтрационного барьера почки. Достижения в почечной медицине были затруднены ограниченной доступностью первичных тканей и отсутствием надежных методов получения функциональных клеток почек человека, таких как подоциты. Способность извлекать подоциты из возобновляемых источников, таких как стволовые клетки, может помочь продвинуть современное понимание механизмов развития и заболеваний почек человека, а также предоставить новые инструменты для терапевтических открытий. Целью этого протокола была разработка метода получения зрелых, постмитотических подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPS) с высокой эффективностью и специфичностью и в химически определенных условиях. Подоциты, полученные из клеток hiPS, продуцируемые этим методом, экспрессируют специфические для линии маркеры (включая нефрин, подоцин и опухоль Вильма 1) и проявляют специализированные морфологические характеристики (включая первичные и вторичные процессы стопы), связанные со зрелыми и функциональными подоцитами. Интересно, что эти специализированные особенности заметно отсутствуют в увековеченной клеточной линии подоцитов, широко используемой в этой области, что говорит о том, что протокол, описанный в настоящем описании, производит почки человека, которые имеют более зрелый фенотип, чем существующие клеточные линии подоцитов, обычно используемые для изучения биологии почек человека.

Введение

Достижения в области культуры плюрипотентных стволовых клеток человека готовы революционизировать регенеративную медицину, моделирование заболеваний и скрининг лекарств, предоставляя исследователям возобновляемый, масштабируемый источник биологического материала, который может быть спроектирован для получения практически любого типа клеток в организме человека1. Эта стратегия особенно полезна для получения специализированных и функциональных типов клеток, которые в противном случае было бы трудно получить. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые (hiPS) клетки2,3,4,5 особенно привлекательны из-за их соматического клеточного происхождения и потенциала, который они представляют для персонализированной медицины. Однако разработка методов получения других клеточных линий из hiPS-клеток остается сложной задачей из-за частого использования плохо определенных условий культивирования, что приводит к низкой эффективности и неспецифической генерации гетерогенных клеточных популяций6,7.

Здесь представлен способ получения зрелых почечных подоцитов из hiPS-клеток со специфичностью и высокой эффективностью в химически определенных условиях. Рассматривая роль нескольких факторов в клеточной микросреде, была разработана стратегия дифференцировки стволовых клеток, которая включала оптимизацию растворимых факторов, представленных в среде клеточной культуры, а также нерастворимых факторов, таких как компоненты внеклеточного матрикса или адгезивные субстраты. Учитывая важность передачи сигналов интегрина в развитии и функции подоцитов, первоначально исследовалась экспрессия рецепторов интегрина на поверхности клетки. Интегрины β1 были высоко экспрессированы не только в hiPS-клетках, но и в их производных, включая мезодерму и промежуточные клетки мезодермы8,9,10. Последующие эксперименты подтвердили, что лиганды, которые связываются с интегринами β1 (включая ламинин 511 или фрагмент ламинина 511-E8), поддерживают адгезию и дифференцировку hiPS-клеток в подоциты при использовании в сочетании с растворимыми индуктивными средами, описанными ниже.

Индукция приверженности клеточной линии была инициирована первым подтверждением того, что hiPS-клетки, культивируемые на поверхностях, покрытых ламинином, в течение двух дней в присутствии среды, содержащей Activin A, CHIR99021 и ингибитор породы Y27632, могут дифференцироваться в клетки, которые экспрессируют ранние маркеры мезодермы HAND1, гусыневые и брахиуры8,11. Лечение клеток мезодермы в течение 14 дней средой, дополненной костным морфогенетическим белком 7 (BMP-7) и CHIR99021, позволило получить промежуточные клетки мезодермы, которые экспрессировали нефрон-прогениторные клеточные маркеры опухоли Вильма 1 (WT1), нечетно пропущенный родственный белок 1 (OSR1)8,11и парный белок бокс-гена 2 (PAX2)12. Чтобы получить зрелые почечные клубочковые подоциты, промежуточные клетки мезодермы обрабатывали в течение 4-5 дней новой средой, состоящей из BMP-7, активина А, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), полностьютранс-ретиноевой кислоты и CHIR99021. Проточная цитометрия и иммуноокрашивание были использованы для подтверждения того, что >90% полученных клеток проявляли молекулярные, морфологические и функциональные характеристики зрелых подоцитов почек8,11,13. К таким характеристикам относятся развитие первичных и вторичных процессов стопы; экспрессия специфических для линии подоцитов генов, включая SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 и экспрессию белков, включая подоцин, нефрин и WT114,15,16. Кроме того, было обнаружено, что подоциты, полученные из клеток hiPS, могут поддерживаться в культуре до четырех недель in vitro с использованием коммерчески доступной среды8,11, которая обеспечивает дополнительную гибкость в сроках последующих экспериментов. Для получения дополнительной информации о панелях проточной цитометрии, используемых для определения чистоты hiPS-подоцитов, пожалуйста, обратитесь к нашей предыдущей публикации11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка реагентов

  1. Разбавляйте размороженные 5x hiPS клеточные культуральные среды (CCM) добавки в базальной среде культуры клеток hiPS для получения 1x раствора hiPS CCM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженная добавка 5x hiPS CCM требует медленного процесса оттаивания, в идеале при 4 °C в течение ночи. Аликвоты 1x hiPS CCM могут храниться до 6 месяцев при -20 °C.
  2. Приготовление пластин с покрытием 1-слойной матрицы базальной мембраны (БМ) для культуры клеток hiPS: Оттаивать BM матрицу 1 на ночь на льду при 4 °C. После размораживания приготовьте аликвоты с соответствующими коэффициентами разбавления, как это предлагает производитель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, аликвоты готовят для последующего разбавления в 25 мл холодного DMEM/F12 в конической трубке 50 мл с последующим тщательным перемешиванием для полного растворения матрицы BM 1 и предотвращения образования остаточных кристаллов.
  3. Переложить 1 мл раствора BM matrix 1 в каждую скважину из 6-й пластины скважины и инкубировать при 37 °C в течение 1-2 ч или при 4 °C в течение не менее 24 ч, обернутый парафиновой пленкой. Пластины с покрытием BM matrix 1 можно хранить при 4 °C до 2 недель.
  4. Получение матрицы 2 с покрытием из фундаментной мембраны (БМ): Разбавить соответствующие количества матрицы BM 2 в 9 мл стерильной дистиллированной воды для получения конечной концентрации 5 мкг/мл. Добавляют 700 мкл раствора матрицы BM 2 в каждую скважину из 12-й скважинной пластины и инкубируют пластину при комнатной температуре в течение 2 ч или на ночь при 4°С.
  5. Готовят по 100 мкг/мл растворов BMP7, Activin A и VEGF следующим образом: повторно воссоздают BMP7 в стерильной дистиллированной воде, содержащей 0,1% (мас./об.) BSA, и повторно воссоздают активин A и VEGF отдельно в стерильных PBS, содержащих 0,1% (мас./об.) BSA. Чтобы избежать частых циклов замораживания-оттаивания, приготовьте 100 мкл аликвот из каждого запасного раствора и храните при -20 °C до 6 месяцев.
  6. Приготовьте 10 мМ раствора Y27632, растворив 10 мг Y27632 в 3,079 мл стерильной дистиллированной воды. Аликвот 100 мкл со склада и хранить при -20 °C до 6 месяцев.
  7. Растворить 2 мг CHIR99021 в 143,4 мкл стерильного ДМСО для приготовления 30 мМ запасного раствора. Приготовьте 5 мкл аликвот и храните при -20 °C до 1 месяца (или по рекомендации производителя).
  8. Растворить 10 мг алл-транс-ретиноевой кислоты в 3,33 мл стерильного ДМСО. Приготовьте 500 мкл аликвоты и храните при -20 °C до 6 месяцев.

2. Подготовка питающих сред

  1. Готовят мезодермную дифференцированную среду путем восстановления соответствующих исходных растворов до конечной концентрации 100 нг/мл активина А, 3 мкМ CHIR99021, 10 мкМ Y27632 и 1x B27 без сыворотки добавки в соответствующем объеме DMEM/12 с добавкой глутамина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среду дифференцировки мезодермы следует предварительно подготовить перед этапами дифференцировки и в объеме, соответствующем масштабу эксперимента (как правило, 50 мл среды достаточно для двух плит скважины по 12 скважин).
  2. Готовят промежуточную среду дифференцировки мезодермы путем восстановления соответствующих растворов до конечной концентрации 100 нг/мл BMP7, 3 мкМ CHIR99021 и 1x B27 без сыворотки добавки в DMEM/F12 с добавкой глутамина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости среду можно дополнить 1% (об/об)пенициллин-стрептомицин. Отрегулируйте объем среды с помощью DMEM/F12 с добавкой глутамина. Эта среда может быть приготовлена большими партиями; однако рекомендуется хранить в меньших аликвотах (например, 45 мл в конических трубках по 50 мл), чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Эти носители могут храниться при -20 °C в течение 3 месяцев и могут быть разморожено при 4 °C в течение ночи перед использованием.
  3. Подготавливают среду индукции подоцитов путем повторного введения в конечную концентрацию 100 нг/мл BMP7, 100 нг/мл активина А, 50 нг/мл VEGF, 3 мкМ CHIR99021, 1x B27 без сыворотки добавки и 0,1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты в DMEM/F12 с добавкой глутамина. Защитите среду от света (например, обернув контейнер фольгой).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда может быть приготовлена большими партиями и храниться в темноте при -20 °C в течение 3 месяцев. Замороженные аликвоты следует разморозить на ночь при 4 °C перед использованием.
  4. Готовят 25 мл нейтрализующего трипсина раствора, добавляя 10% (об/об)инактивированный теплом FBS в DMEM/F12 и фильтруют в стерильных условиях.
  5. Для постдифференциационного поддержания подоцитов, полученных из стволовых клеток, подготовьте полную среду с поддерживающей средой подоцитов, добавив добавку в базальную среду в соответствии с рекомендациями производителя, и храните при 4 °C в течение двух недель.

3. Культура клеток hiPS без кормителя с использованием среды культуры клеток hiPS

  1. Аспирировать остаточный раствор BM матрицы 1 из предварительно покрытых пластин и промыть скважины 3 раза 1-2 мл нагретого DMEM/F12.
  2. Аспират проводят hiPS CCM из hiPS клеток и промывают клетки 3 раза с подогретым DMEM/F12. Добавьте 1 мл теплого раствора для отслоения клеток и инкубируют в течение 1 мин при 37 °C, чтобы помочь диссоциировать клетки. Выполните визуальный осмотр клеток под микроскопом культуры тканей и убедитесь, что края клеточных колоний кажутся округлыми, затем быстро аспирируют раствор отслоения клеток из клеток (гарантируя, что колонии клеток все еще прикреплены к пластине, хотя и свободно). Осторожно промыть клетки один раз DMEM/F12, чтобы удалить раствор для отсоединения клеток.
  3. Добавьте 3 мл hiPS CCM к ячейкам hiPS (в каждой скважине 6-скважинной пластины), которые были обработаны раствором для отсоединения клеток. Соскребайте колонии с помощью клеточного лифтера и осторожно суспензируйте клетки пипетки вверх и вниз, чтобы выбить слабо приклеенные клетки. Тщательно вымойте пластину, чтобы убедиться, что все клетки собраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пипетку 5 мл, чтобы избежать избыточного сдвига на клетках.
  4. Перенесите 0,5 мл клеточной суспензии в каждую скважину новой 6-скважинной пластины с 6-м покрытием матрицы БМ, содержащей 2 мл hiPS CCM на скважину. Переместите пластину в виде восьмерки, чтобы распределить колонии клеток внутри колодцев и инкубировать при 37 °C в инкубаторе CO2 с 5%. Обновляйте среду ежедневно до тех пор, пока клетки не будут готовы к прохождению или использованию для эксперимента по дифференцировке (примерно 70% конфлюзии).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный размер колонии для рутинного прохождения иПСК составляет от 200 до 500 мкм в условиях без фидеров с использованием hiPS CCM (без ингибитора ROCK). Если клетки индивидуализированы во время лечения ферментами диссоциации или буферами, hiPS CCM может быть дополнен ингибитором ROCK (например, 10 мкМ Y27632) для улучшения жизнеспособности клеток.

4. Дифференцировка hiPS-клеток в клетки мезодермы (дни 0-2)

  1. В то время как культуры клеток hiPS находятся в фазе экспоненциального роста (примерно в течение 4 дней после посева и около 70% слияния), визуально осмотрите наличие спонтанно дифференцированных клеток внутри и вокруг краев колоний. При необходимости асептически соскребают участки дифференциации.
  2. Аспирировать hiPS CCM из hiPS клеток и промыть клетки 3 раза теплым DMEM/F12. Инкубируйте клетки с 1 мл буфера диссоциации клеток без ферментов в течение 10 мин при 37 °C и проверьте диссоциацию под микроскопом. Из-за внутренних различий между различными клеточными линиями hiPS фактическое время инкубации для буфера диссоциации клеток должно быть определено для данной клеточной линии.
  3. Осторожно соскоблите колодец с помощью клеточного лифтера, чтобы выбить слабо приклееные клетки и перенести клеточную суспензию в коническую трубку 15 мл, а затем несколько раз пипетировать вверх и вниз для индивидуализации клеток hiPS.
    1. Доведите клеточную суспензию до объема 15 мл с теплым DMEM/F12 и центрифугой в течение 5 мин при 290 х г при комнатной температуре.
    2. Осторожно аспирируют супернатант и повторно суспендируют ячейки теплым DMEM/F12 для еще одного раунда центрифугирования для удаления остаточной матрицы BM 1 и компонентов буфера диссоциации.
  4. Аспирировать надотворные и повторноуспендные клетки в 1 мл индукционной среды мезодермы, как описано выше. Подсчитайте общее количество клеток с помощью гемоцитометра или счетчика сошника для определения соответствующего объема мезодермной дифференцированной среды, необходимой для достижения концентрации 1 х 105 клеток/мл.
  5. Аспирировать раствор ECM из пластин с 2-м покрытием BM matrix и дважды промыть пластины теплым DMEM/F12. Осторожно перемешайте суспензию клеток hiPS, несколько раз пипеткой. Переложите 1 мл клеточной суспензии в каждую скважину 12-скважинных пластин матрицы BM, покрытой 2, а затем осторожно встряхните пластины, чтобы распределить ячейки более равномерно.
  6. Инкубировать пластину при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе. Освежите среду индукции мезодермы на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2 дня клетки мезодермы, полученные из hiPS, будут готовы к промежуточной индукции мезодермы.

5. Дифференцировка мезодермных клеток hiPS-клеток в промежуточные мезодермы (дни 2-16)

  1. На 2 день протокола дифференцировки аспирируют мезодерму индукционной средой и пополняют 1 мл на скважину промежуточную мезодерму индукционной среды.
  2. Обновляйте среду каждый день, чтобы поддерживать точный порог факторов роста и малых молекул для метаболически активных клеток. При значительном росте клеток и быстром истощении питательных веществ среды (на что указывает пожелтение среды) объем промежуточной мезодермной дифференцировочной среды может быть увеличен до 1,3 мл на скважину из 12 пластин скважины.
  3. Культивировать клетки дополнительно 14 дней для получения промежуточных клеток мезодермы. К 16-му дню эти клетки могут быть криоконсервы для последующего использования.

6. Дифференцировка промежуточных клеток мезодермы hiPS в подоциты (дни с 16 по 21)

  1. Промежуточные клетки мезодермы промыть теплым DMEM/F12 с последующим инкубацией клеток с 0,5 мл на скважину 0,05 % трипсина-ЭДТА в течение 3 мин при 37 °C. Провести визуальный осмотр, чтобы убедиться, что клетки начинают диссоциировать.
  2. Соскребайте ячейки с помощью клеточного лифтера и пипетки клеточной суспензии несколько раз, используя наконечник пипетки 1000 мкл для получения индивидуализированных (или небольших скоплений) клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе убедитесь, что клетки полностью диссоциированы, поскольку агрегированные клетки могут не приобрести терминально дифференцированный фенотип в течение временной шкалы протокола.
  3. Добавьте около 2 мл на скважину трипсина, чтобы остановить активность трипсина.
  4. Перенесите ячейки в коническую трубку объемом 50 мл и доведите объем до 50 мл с помощью DMEM/F12, а затем центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 мин при 201 х г при комнатной температуре.
  5. Аспирировать надпомнивные и повторно суспендировать клетки в среде индукции подоцитов. Для достижения оптимальных результатов обеспечьте окончательную плотность посева примерно 100 000 клеток/скважину плиты из 12 скважин. Добавьте клеточную суспензию к пластинам с 2-м покрытием BM-матрицы и осторожно встряхните пластину, чтобы помочь распределить клетки более равномерно.
  6. Инкубировать клетки при 37 °C и 5% CO 2 и обновлятьсреду ежедневно в течение 5 дней для получения подоцитов к 21-му дню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные в результате hiPS-клеточные подоциты могут поддерживаться в культуре в течение 2-4 дополнительных недель с использованием полной среды с поддерживающей средой подоцитов. Попав в поддерживающую питательную жиму подоцитов, клетки можно кормить через день и могут использовать для последующих исследований или последующих анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Цель этого протокола состояла в том, чтобы продемонстрировать, что зрелые человеческие подоциты могут быть получены из hiPS-клеток в химически определенных условиях. Данные, представленные в этой рукописи, были сгенерированы с использованием клеточной линии DU11 hiPS17,которые были впервые протестированы и оказались свободными от микоплазмы. Также был проведен хромосомный анализ, и было обнаружено, что клетки являются кариотипически нормальными. Начиная с недифференцированных hiPS-клеток DU11, стр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом отчете мы описываем протокол генерации клубочковых подоцитов почек из hiPS-клеток. Подоциты, полученные из клеток hiPS, демонстрируют морфологические и молекулярные особенности, связанные со зрелым фенотипом подоцитов почек13. В предыдущих публикациях мы показали, что подоциты, полученные из клеток hiPS, могут имитировать структуру и селективную фильтрационную функцию клубочка почки при совместной культивировании с клубочковыми микрососудистыми эндотелиальными клетками в перфузируемом микро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

С.M. является автором патента на способы генерации почечных подоцитов из плюрипотентных стволовых клеток (заявка на патент США 14/950859). Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Инженерной школой Пратта в Университете Дьюка, Отделом нефрологии в Медицинской школе Дьюка, Премией за исследования кафедры от Департамента медицины в Университете Дьюка и Специальной премией Фонда Берроуза Wellcome FUND PDEP Career Transition Ad Hoc Award для S.M.. M.B была поддержана Программой стипендий для аспирантов Национального научного фонда. Мы благодарим лабораторию Bursac за щедрое предоставление нам линии стволовых клеток DU11 и лабораторию Варгезе в Университете Дьюка за временное совместное использование своего центра культивирование тканей с нашей группой. Эта публикация посвящена профессору Лауре Л. Кисслинг, профессору химии Novartis в Массачусетском технологическом институте, в честь празднования ее60-летия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cells
DU11 человеческие iPS-клеткиЛиния iPS-клеток DU11 (клон #11 Университета Дьюка) была создана в центре iPSC Университета Дьюка и предоставлена нам лабораторией Bursac в Университете Дьюка. Эта линия была протестирована на микоплазму и в последний раз была кариотипирована в июле 2019 года нашей лабораторией, и была признана кариотипически нормальной.
<сильные>факторы роста и медиа-добавки
все транс-ретиноевая кислота (500 мг)72262Stem Cell Technologies
бессывороточная добавка B2717504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004Stemgentможет демонстрировать вариации от партии к партии
Полный средний набор с CultureBoost-R4Z0-500-RКлеточныесистемы Среда для поддержания подоцитов
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 с добавкой GlutaMAX10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 с добавкой глутамина
Термоинактивированный FBS10082147Thermo/Life Technologies
Активин человека АPHC9564Thermo/Life Технологии
Human BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
VEGF человека VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
среда05850Технологии стволовых клетокhiPS клеточные культуры среды (CCM)
Пенициллин– стрептомицин, жидкий (100&раз;)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 Ингибитор ROCK1254Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– и Alexa Fluor 594– конъюгированные вторичные антителаА32744; А32754; А-11076; A32790Thermo/Life Technologies Brachyury
(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R& D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234миллипор
<сильной>ЭКМ
iMatrix-511 Ламинин-Е8 (LM-E8) фрагментN-892012Иваи Северная АмерикаМатрица базальной мембраны (БМ) 2
Матрикс Матригель hESC, флакон объемом 5 мл354277BD Биологические наукиМатрица базальной мембраны (БМ) 1. Может показывать вариации от партии к партии
<сильно>ферменты и другие реагенты
аккутазаA1110501Thermo/Life TechnologiesРаствор для отсоединения клеток
BSAA9418Сигма-Олдрич
Диметилсульфоксид (ДМСО)D2438Сигма-ОлдричДМСО токсичен. Следует обрабатывать в химически безопасном капюшоне
Бесферментный буфер для диссоциации клеток, Hank' s сбалансированная соль13150016Thermo/Life Technologies
, 70% (об/об.), биотехнологический класс97065-058VWRЭтанол легковоспламеняющийся и токсичный
FBS431097
(PFA)28906Thermo/Life TechnologiesС PFA следует обращаться в вытяжном шкафу для химических веществ с надлежащими средствами индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Следует избегать вдыхания и контакта с кожей.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
Стерильная дистиллированная вода15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Трипсин-ЭДТА, 0,05%25300-120Thermo/Life Technologies
Equipment
Аспирационные пипетки, в индивидуальной упаковке29442-462Центрифуга Corning
Avanti J-15RB99516Beckman Coulter
, 15 мл352097
, 50 мл352098Corning
3395465Thermo/Life TechnologiesДля хранения замороженных aliquots
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life TechnologiesФлуоресцентный микроскоп, используемый для получения изображений фиксированных и окрашенных iPS-клеток и их производных
Гемоцитометр100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2-инкубатор51030403Thermo/Life TechnologiesДля рутинного культивирования и поддержания iPS-клеток и их производных
Инвертированный Zeiss Axio Observer, оснащенный камерой AxioCam 503491916-0001-000 (микроскоп) ; 426558-0000-000 (камера)Микроскопия Carl Zeiss Используетсядля получения фазово-контрастных изображений живых iPS-клеток и их производных на каждой стадии дифференцировки подоцитов
Kimberly-Clark нитриловые перчатки40101-346VWR
Kimwipes, большие21905-049VWR
Kimwipes, малые21905-026Прецизионные
P10P1096-FRDenville Scientific
P100 Барьерные наконечники для пипетокP1125Барьерные
P1000P1126Denville Scientific
P20P1121Барьерные
P200P1122Denville Scientific
Serological pipette, 10 мл, в индивидуальной упаковке356551
, 25 мл, в индивидуальной упаковке356525
, 5 мл, в индивидуальной упаковке356543Corning
Steriflip, 0,22 μ m, PESSCGP00525EMD Millipore
Стерильные микроцентрифужные пробирки1138W14ThomasScientific Для аликвотирования факторов роста
Культура тканей– обработанные 12-луночные планшеты353043тканей Corning
– обработанные шестилуночные планшеты353046Corning
VWR белый лабораторный халат techuni10141-342VWR
Широкоскошенный клеточный лифтер3008Corning
молекулы действующая раствор этанола параформальдегид Corning Коническая центрифуга Коническая центрифуга Corning Криобоксы барьерные наконечники для пипеток VWR наконечники для пипеток Denville Scientific Барьерные наконечники для пипеток наконечники для пипеток Denville Scientific серологической пипеткой Corning серологической пипеткой Corning культурой

Ссылки

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145(1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

WT1
Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.