Методическая статья

ДНК-шторы проливают свет на сложные молекулярные системы во время гомологичной рекомбинации

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61320

⸱

23 июня 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

ДНК-шторы представляют собой новый метод визуализации сотен или даже тысяч ДНК-связывающих белков в режиме реального времени, когда они взаимодействуют с молекулами ДНК, выровненными на поверхности микрофлюидной камеры образца.

Аннотация

Гомологичная рекомбинация (HR) важна для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) и остановленных репликационных вилок у всех организмов. Дефекты HR тесно связаны с потерей целостности генома и онкогенной трансформацией в клетках человека. HR включает в себя скоординированные действия сложного набора белков, многие из которых остаются плохо изученными. Ключевым аспектом описанных здесь исследований является технология, называемая «ДНК-завесами», техника, которая позволяет собирать выровненные молекулы ДНК на поверхности микрофлюидной камеры для образцов. Затем их можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRFM). ДНК-шторы были впервые разработаны нашей лабораторией и обеспечивают прямой доступ к пространственно-временной информации в миллисекундном временном масштабе и с нанометровым разрешением, которое не может быть легко раскрыто с помощью других методологий. Основным преимуществом ДНК-штор является то, что они упрощают сбор статистически значимых данных из экспериментов с отдельными молекулами. Это исследование продолжает давать новое понимание того, как клетки регулируют и сохраняют целостность генома.

Введение

Поддержание целостности генома имеет решающее значение для правильного функционирования всех живых клеток1. Дефекты целостности генома могут привести к серьезным заболеваниям, включая различные виды рака и возрастные дегенеративные заболевания2. Гомологичная рекомбинация (HR) использует матрично-зависимый синтез ДНК для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК (DSB), одноцепочечных разрывов ДНК (ssDNA) и межцепочечных сшивокДНК 3. HR также необходим для восстановления заглохших и свернувших репликационных вилок 3,4. Кроме того, HR необходим для точной сегрегации хромосом во время мейоза 5,6.

HR включает в себя скоординированные действия сложного набора белков, многие из которых остаютсяплохо изученными. Примеры включают репликационный белок А (RPA), Rad51 и Rad54, среди многих других7. Реакции HR как в прокариотических, так и в эукариотических клетках включают промежуточный продукт ssDNA, который быстро покрывается ssDNA-связывающими белками (SSB у прокариот и RPA у эукариот)8. Эти белки защищают одноцеполевую ДНК от нуклеаз, устраняют вторичную структуру и способствуют привлечению нижестоящих факторов 8,9. Rad51 является членом высококонсервативного АТФ-зависимого семейства рекомбиназ ДНК Rad51/RecA, которые присутствуют во всех живыхорганизмах. Rad51 способствует инвазии нити ДНК гомологичного донора дцДНК. Учитывая его важность, Rad51 высоко регулируется, и дефекты в этих регуляторных процессах обычно связаны с потерей целостности генома и онкогенной трансформацией. Rad54 является членом семейства Swi2/Snf2 транслоказов дцДНК и ремоделеров хроматина10,11. Эти белки служат важными регуляторными факторами Rad51. Важно отметить, что Rad54 удаляет Rad51 из продукта инвазии дцДНК, а также необходим для предотвращения неправильного накопления Rad51 на хроматине11. Молекулярная активность белков, участвующих в ЧС, как в дрожжах, так и в бактериальных клетках, пролила свет на их функцию в ЧСС, но как именно их активность способствует ЧСС, остается плохо изученным.

ДНК-занавески стали уникальной платформой, обеспечивающей прямой доступ к молекулярным механизмам и макромолекулярной динамике, которые в противном случае остались бы недоступными13,14. Для приготовления ДНК-занавесок поверхность микрофлюидной камеры покрывается липидным бислоем, а молекулы ДНК привязываются к бислою через биотин-стрептавидиновую связь. Бислой делает поверхность инертной, имитируя естественные клеточные мембраны. Гидродинамическая сила выравнивает ДНК вдоль наноискусственных барьеров, позволяя визуализировать сотни молекул в одном поле зрения с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM). Барьеры создаются с помощью электронно-лучевой литографии, а вариации конструкции барьеров позволяют точно контролировать распределение и геометрию привязки ДНК. Эти подходы легко применимы как для одноцеклеоточной, так и для дцДНК 13,14,15,16,17,18. Пьедесталы также могут быть изготовлены с помощью наноконструкций (вместе с барьерами) для того, чтобы оба конца ДНК были привязаны к поверхности камеры образца таким образом, что можно проводить эксперименты в стационарном режиме в отсутствие буферного потока.

Зависящие от времени изменения в отдельных комплексах белок-нуклеиновые кислоты выявляются при просмотре видеозаписей в режиме реального времени и представляются в печатном виде с помощью кимографов, которые представляют изменение положения белков на ДНК с течением времени. Важным аспектом подхода ДНК-штор является то, что он не обязательно требует априорных моделей или предположений о молекулярных механизмах, поскольку поведение отдельных компонентов реакции можно наблюдать в режиме реального времени. Это позволяет непосредственно наблюдать за молекулярным поведением. В настоящем протоколе описывается, как получить ДНК-шторы с субстратами dsDNA, а также его применение для изучения промежуточных продуктов в гомологичной рекомбинации.

Протокол

1. Подготовка липидного запаса

  1. Растворите 1 г 18:1 (Δ9-цис) ФК, 100 мг 18:1 PEG2000 ПЭ и 5 мг биотинилового колпачка 18:1 ПЭ в 10 мл хлороформа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как ДОПК, так и ДППЭ хорошо охарактеризованы и (наряду с модификацией ПЭГ) отобраны за их способность сводить к минимуму неспецифическую адсорбцию на поверхности проточной ячейки. Растворенную смесь липидов можно аликвотировать и хранить при температуре -20 °C до 12 месяцев.
  2. Используйте хлороформ для очистки стеклянного шприца с органическим растворителем, затем перенесите 200 μL (10% от конечного желаемого объема) липидной мастер-смеси в стеклянный флакон.
  3. Испарите хлороформ из стеклянного флакона с помощью очень щадящей струи сжатого азота. Немного увеличьте давление ближе к концу выпаривания, чтобы убедиться, что все следы хлороформа удалены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоняйте и поворачивайте флакон во время процесса выпаривания, чтобы липиды высохли в виде равномерного слоя белой пленки на стене.
  4. Поместите флакон без крышки под вакуум на ночь.
  5. Добавьте 2 мл липидного буфера (10 мМ Tris-HCl [pH 8,0], 100 мМ NaCl) в высохшую липидную пленку и закройте флакон крышкой. Инкубировать при комнатной температуре (RT) не менее 1 ч и делать в вихревом состоянии до полного растворения.
  6. Переложите раствор в полистирольную трубку с круглым дном объемом 5 мл и нанесите на лед с помощью микронаконечника со следующими параметрами: амплитуда = 50, время обработки = 1,5 мин, пульс = 15 с, время перерыва = 2 мин. Раствор будет понятен после ультразвуковой обработки (общая энергия = 1,500-2,000 Дж).
  7. Отфильтруйте раствор через шприцевой фильтр из ПВДФ 0,22 мкм и храните запас липидов при температуре 4 °C до 1 месяца.

2. Подготовка субстрата дцДНК

  1. Нагрейте запас λ-ДНК (500 мкг/мл) до 65 °C.
  2. Приготовьте смесь для отжига/лигирования, содержащую: 1,6 пМ λ-ДНК, 100-кратный молярный избыток (160 пМ) каждого олигонуклеотида (BioL: 5'Phos-AGG TCG CCG CCC-3Bio и DigR: 5'Phos-GGG CGG CGA CCT-3Dig_N) и 60 мкл 10-кратного реакционного буфера T4-лигазы (в общем объеме 600 мкл).
    Примечание: Олигонуклеотиды BioL и DigR биотинилированы (Bio) и модифицированы дигоксигенином (Dig) соответственно. Биотинилирование позволяет прикреплять молекулы ДНК к биотинилированным липидам через стрептавидиновые связи. Модификация Dig обеспечивает двойное связывание за счет связывания анти-Dig антител, покрытых на пьедесталах, с группами Dig.
  3. Отжигите олигонуклеотиды до λ-ДНК cos-ends путем инкубации реакции при 65 °C в течение 10 минут, затем дайте ей медленно остыть до RT.
  4. Добавьте 5 μЛ Т4 ДНК-лигазы и инкубируйте при ЛТ в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы отжига и лигирования также могут быть выполнены в термическом амплификаторе.
  5. Осаждение λ-ДНК путем добавления 300 мкл раствора PEG-8000 (30% по объему PEG-8000 и 10 мМ MgCl2). Инкубировать при температуре 4 °C не менее 1 ч.
  6. Центрифугируйте при 14 000 x g в течение 5 минут при RT. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не повреждая гранулу. По желанию промойте гранулу 1x 500 μл охлажденного 70% этанола.
  7. Ресуспендируйте гранулу в 40 мкл TE буфера (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА [pH 8,0]).

3. Наноизготовление хромовых узоров

  1. Просверлите два отверстия в центре предметного стекла кварцевого микроскопа размером 1 x 3 дюйма (на расстоянии ~3 см друг от друга) с помощью алмазного сверла диаметром 1,4 мм на настольном сверлильном станке (геометрию положения сверления см. на рисунке 1 ).
  2. Очистите просверленные предметные стекла, погрузив их в 200 мл раствора пираньи (75% серной кислоты [97%] и 25% перекиси водорода). Выдерживать в течение 30 минут.
    ВНИМАНИЕ: Необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы избежать любого контакта с открытыми участками кожи. Готовьте раствор, очень медленно смешивая холодную перекись водорода с серной кислотой. Правильно утилизируйте отходы пираньи в специально отведенный контейнер для отходов.
  3. Промойте предметные стекла, погрузив в воду объемом 200 мл воды двойной дистилляции. Повторите 2 раза, чтобы удалить остатки пираний. Высушите предметные стекла слабой струей сжатого азота.
  4. С помощью копьеры (4 000 об/мин в течение 45 с, скорость нарастания 300 об/мин) нанесите на чистые предметные стекла фоторезист и проводящий полимер следующим образом:
    1. Покрывает предметные стекла слоем 3% (w/v) полиметилметакрилата (PMMA; 24,3 тыс. МВт; растворен в анизоле).
    2. Покрывает предметные стекла слоем 1,5% (w/v) полиметилметакрилата (PMMA; 495K MW; растворен в анизоле).
    3. Покрывает предметные стекла слоем антистатика для электронно-лучевой литографии.
  5. Написание индивидуальных шаблонов для барьеров и постаментов на предметных стеклах с покрытием с помощью электронно-лучевой литографии с помощью сканирующего электронного микроскопа, оснащенного программным обеспечением системы генерации наношаблонов.
  6. Проявите предметные стекла, предварительно смыв антистатик для электронно-лучевой литографии водой двойной дистилляции. Затем поместите их в пробирки объемом 50 мл, содержащие раствор для проявки (75% метилизобутилкетон [MIBK] и 25% изопропанол; хранить охлажденными при -20 °C) и обработать ультразвуком на ледяной бане на низкой мощности в течение 1 минуты.
  7. Проявляющий раствор смыть изопропанолом и обсушить щадящей струей сжатого азота.
  8. С помощью электронно-лучевого испарителя нанесите слой хрома толщиной 250 Å на узорчатую поверхность со скоростью 0,5 Å/с.
  9. Снимите хром и остатки ПММА с помощью ацетона из флакона с пульверизатором, после чего проведите ультразвуковую обработку предметных стекол в ацетоновой ванне в течение 10 минут. Еще раз умывайтесь ацетоном из пульверизатора.
  10. Чтобы предотвратить появление отложений от остатков ацетона, промойте предметные стекла изопропиловым спиртом и высушите их слабой струей сжатого азота.

4. Сборка проточной ячейки

  1. Поместите прямоугольный бумажный шаблон размером 35 мм x 5 мм (закрывающий хромированный узор, а также предварительно просверленные входные/выходные отверстия) на кварцевое стекло узорчатой стороной вверх ( Рисунок 1A).
  2. Наклейте кусок двустороннего скотча (толщиной 1 мм) на кварцевый предметный знак, закрывающий бумажный шаблон, затем с помощью лезвия бритвы вырежьте прямоугольный бумажный шаблон ( рисунок 1A).
  3. Наденьте стеклянный покровный лист на двустороннюю ленту и слегка надавите, чтобы приклеить покровное стекло к ленте ( Рисунок 1A). Пространство между покровным стеклом и предметным стеклом, запечатанное двусторонним скотчем, образует микрофлюидную камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы уплотнение между крышкой и слайдом было достаточно надежным, чтобы предотвратить утечку во время эксперимента.
  4. Поместите сэндвич с задвижкой между предметными стеклами и прикрепите зажимы для крепления со всех четырех сторон, чтобы равномерно распределить давление. Поместите сборку в вакуумную печь на 60 минут при температуре 135 °C, чтобы двусторонняя лента расплавилась и запечатала камеру.
  5. Выньте его из духовки, затем отпустите связующие зажимы и предметные стекла.
  6. Прикрепите микрофлюидные порты к предварительно просверленным входным/выходным отверстиям с помощью пистолета для горячего клея, поместив клеевую сборку на нагревательный блок (220 °C) на 1 минуту, сняв его и осторожно приложив мягкое давление, чтобы должным образом герметизировать микрофлюидные порты. Дайте клею полностью застыть, прежде чем продолжить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные проточные ячейки могут быть помещены в пробирки объемом 50 мл и храниться в вакууме.

5. Сборка шторы dsDNA

  1. Подсоедините входную/выходную трубку к микрофлюидным портам проточной ячейки и промойте камеру 20 мл воды двойной дистилляции с помощью двух шприцев объемом 10 мл.
  2. С помощью шприца объемом 10 мл, наполненного водой двойной дистилляции, подключенного к обеим сторонам проточной ячейки, приложите усилие, чтобы протолкнуть/протянуть воду между входным и выпускным шприцами. На этом этапе удаляются все пузырьки воздуха из проточной ячейки.
  3. Промойте камеру 3 мл липидного буфера (10 мМ Tris-HCl [pH 8.0], 100 мМ NaCl).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все соединения с проточными ячейками расположены по каплям, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в проточную ячейку.
  4. Смешайте 40 мкл раствора липосомы с 1 мл липидного буфера. Введите 300 мкл липидного раствора в проточную ячейку и инкубируйте в течение 5 минут. Повторите инъекцию и инкубацию 2 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чередуйте сторону входа/выхода для инъекции каждый раз, когда шприц подключается к проточной ячейке.
  5. Промойте камеру 3 мл липидного буфера и инкубируйте в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инкубационный период может варьироваться от 5 минут до 2 часов, в зависимости от графика экспериментов, без заметных различий в окончательной сборке штор.
  6. Смешайте 40 мкл 1 мг/мл стокового раствора антидигоксигенина с 200 мкл липидного буфера. Введите 100 μл раствора и инкубируйте в течение 10 минут. Повторите инъекцию и инкубацию 1 раз перед промыванием 3 мл липидного буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только для штор с двойным привязыванием дцДНК. Пропустите этот шаг для штор с однопривязанной дцДНК.
  7. Промойте камеру 3 мл буфера BSA (40 мМ Tris-HCl [pH 8,0], 2 мМ MgCl2, 1 mM DTT и 0,2 мг/мл BSA).
  8. Смешайте 10 мкл 1 мг/мл стокового раствора стрептавидина с 990 мкл буфера БСА. Вводите двумя отдельными инъекциями по 400 мкл с 10-минутной инкубацией после каждой инъекции.
  9. Промойте камеру 3 мл буфера BSA, чтобы удалить избыток стрептавидина.
  10. Разведите 25 нг субстрата дцДНК в 1 мл буфера BSA. Медленно вводите раствор ДНК по 200 мкл за один раз, после чего следует 5-минутная инкубация после каждой инъекции. Необходимое количество ДНК может быть оптимизировано для конкретных типов экспериментов.
  11. Установите проточную ячейку на предметный столик микроскопа и при необходимости отрегулируйте фокус.
  12. Подключите входной и выходной порты к системе впрыска пробы, состоящей из шприцевого насоса и реле высокого давления.
  13. Дважды привяжите ДНК к пьедесталам (длина троса 12 мкм), непрерывно промывая камеру буфером BSA со скоростью 0,8 мл/мин в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться отрегулировать скорость и время потока для оптимизации для различных длин двойного троса. Этот шаг нужен только для двойных привязных ДНК-штор. Пропустите этот шаг для штор с однопривязанной дцДНК.
  14. Теперь шторы готовы к экспериментам.

6. Переработка проточных ячеек

  1. Погрузите предметные стекла в этанол не менее чем на 30 минут, прежде чем использовать лезвие бритвы, чтобы осторожно удалить микрофлюидные порты и покровное стекло. Правильно утилизируйте покровное стекло и очистите остатки клея от микрофлюидных отверстий, чтобы их можно было использовать повторно. Очистите скребком остатки клея на предметном стекле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не поцарапать узорчатую область в центре предметного стекла.
  2. Тщательно промойте предметные стекла водой двойной дистилляции и погрузите в 2% щелочной жидкий кварцевый чистящий концентрат на ночь, помешивая.
  3. Предметные стекла тщательно промыть водой двойной дистилляции и погрузить в 2% щелочной жидкий раствор чистящего концентрата кварца на 1 ч при перемешивании при 80 °С, с последующей обработкой ультразвуком в течение 15 мин при 45 °С.
  4. Предметные стекла тщательно промыть водой двойной дистилляции и погрузить в 1 М NaOH на 30-60 минут, помешивая.
  5. Тщательно промойте предметные стекла двойной дистиллированной водой, затем погрузите в изопропиловый спирт и обрабатывайте ультразвуком на 15 минут при температуре 45 °C.
  6. Тщательно промойте горки этанолом и погрузите в этанол на 1 ч, помешивая.
  7. Поместите предметные стекла в вакуумную печь на 1 час для сушки при температуре 135 °C. Теперь предметные стекла готовы к повторной сборке в проточные ячейки.

Результаты

Выше описаны приготовление, сборка и визуализация одно- и двухпривязных занавесок дцДНК в контексте изучения белок-ДНК-взаимодействий в промежуточных продуктах репарации ДНК. На рисунке 1А показаны все компоненты в ячейке потока, расположенные слоями в порядке их сборки. На рисунке 1B изображена схема одно- или двухпривязной ДНК-завесы. Липидный бислой используется для пассивации поверхности проточной ячейки. ДНК-занавес состоит из параллельного массива молекул ДНК, привязанных на одном конце к липиду и выровненных на хромовом барьере, ориентированных перпендикулярно направлению потока. При двойных привязанных ДНК-занавесках другой конец ДНК привязан к пьедесталу посредством взаимодействия дигоксигенина и анти-дигоксигенина, так что визуализация может быть проведена в отсутствие потока, в то время как ДНК остается расширенной. дцДНК может быть окрашена флуоресцентным красителем YoYo1 и визуализирована с помощью микроскопии TIRF. На рисунке 2A показано репрезентативное широкоугольное изображение окрашенной YoYo1 завесы с двойным привязыванием ДНК.

Серии покадровых изображений, собранные в ходе экспериментов с ДНК-завесой, обычно анализируются путем создания кимографа, который отображает положение вдоль молекулы ДНК по вертикальной оси в зависимости от времени по горизонтальной оси для каждой молекулы ДНК, представляющей интерес в ImageJ. На рисунке 2B представлены репрезентативные кимографии, показывающие резекцию окрашенной YoYo1 односвязанной λ-ДНК (зеленой) с помощью дрожжевых резекционных аппаратов GFP-Sgs1 (не виден), Top3-Rmi1 и Dna2 в присутствии одноцепочечного ДНК-связывающего белка RPA-mCherry (пурпурный) и АТФ. Сигнал YoYo1 со временем теряется, так как дцДНК резецируется со свободного конца Sgs1-Dna2. Одновременно сигнал mCherry колокализуется с концами ДНК, на которых в результате резекции генерируется одноцепочная ДНК. Биофизически значимые характеристики резекции, такие как скорость и процессивность, могут быть извлечены путем количественной оценки наклонов траекторий потери сигнала YoYo1. На рисунке 2C,D показано распределение скоростей и процессивности, соответственно, резекции Sgs1-Dna2.

figure-results-1
Рисунок 1: Схемы сборки проточных ячеек и ДНК-занавесок. (A) Пошаговая иллюстрация сборки проточных ячеек. Сверху на кварцевое предметное стекло кладут двусторонний скотч, а с помощью бумажного шаблона из центра вырезают прямоугольный канал, который сверху запечатывают покровным листом для формирования камеры. (B) Схемы полностью собранных ДНК-штор. На средней панели представлена проточная ячейка с одним привязным привязным устройством, а на нижней — проточная ячейка с двойным привязным креплением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Визуализация и анализ одномолекулярной ДНК-завесы. (A) Репрезентативное широкоугольное изображение двухсвязной завесы λ-ДНК, окрашенной YoYo1 (зеленым). (B) Репрезентативные кимографы, показывающие резекцию окрашенной YoYo1 дцДНК (зеленая) в присутствии предварительно связанного GFP-Sgs1 (не видна) при преследовании Dna2, в присутствии RPA-mCherry (пурпурный) и 2 мМ АТФ. Распределение скоростей (C) и график процессивности (D) резекции дцДНК с помощью Sgs1-Dna2, полученные путем количественной оценки скорости и степени потери сигнала YoYo1 с течением времени. Панели (B), (C) и (D) адаптированы из Xue et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

ДНК-шторы зарекомендовали себя как универсальная платформа для изучения различных процессов репарации ДНК 13,14,15,16. Молекулы ДНК, которые остаются вытянутыми у поверхности на протяжении всего эксперимента либо за счет непрерывного буферного потока, либо за счет двойного привязывания к пьедесталу, позволяют с помощью TIRFM визуализировать взаимодействия белка и ДНК на промежуточных продуктах репарации на уровне одной молекулы. Этот метод обеспечивает повышение производительности экспериментов и предсказуемости, поскольку сотни молекул ДНК упорядоченно выровнены на наноискусственных барьерах, а не прикреплены к поверхности, что еще больше улучшает обработку больших наборов данных.

Тщательный анализ полученных серий изображений обеспечивает количественные измерения взаимодействий белка и ДНК (т.е. времени жизни связывания, положений, стехиометрии, кинетики диссоциации, скоростей транслокаций, процессивности моторных белков, а также колокализаций и взаимодействий между белками и/или ДНК). По сравнению с другими методами визуализации одиночных молекул, которые либо связывают молекулы ДНК непосредственно с поверхностью, либо сочетают конфокальную визуализацию с силовыми манипуляциями в коммерческих приборах, основным компромиссом между ДНК-завесами и более высокой пропускной способностью является создание методов, необходимых для первоначальной настройки 13,14,15,16. Однако, как только появится возможность собирать данные о сотнях молекул одновременно в одной проточной ячейке, это приведет к значительной экономии времени, затрачиваемого на сбор данных.

Как и во многих других методах визуализации с использованием одной молекулы, возможность подготовки чистой поверхности в значительной степени определяет способность пользователя надежно собирать завесы ДНК. В этом случае для очистки поверхностей необходимо не только начинать с чистого предметного стекла, но и следить за тем, чтобы при выполнении каких-либо жидкостных соединений в камеру не попадали микроскопические пузырьки воздуха. Во-первых, что касается чистоты слайдов, шагов, описанных выше в разделе 6, должно быть достаточно в качестве рутинного процесса очистки. Также рекомендуется использовать отфильтрованные растворы и буферы. Во-вторых, во избежание образования пузырьков во время присоединения проточной ячейки к буферной системе впрыска необходимо выполнять каплевидные соединения. Может быть полезно дегазировать воду двойной дистилляции, используемую для изготовления буферов. Также рекомендуется внимательно наблюдать за любым процессом инъекции, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков. Если микроскопический пузырь был введен до того, как он достигнет центральной области, это может быть устранено путем введения буфера из микрофлюидного порта на противоположной стороне, чтобы вытолкнуть пузырь обратно.

Еще одним важным моментом, который следует учитывать в любых экспериментах, основанных на флуоресценции, является соотношение сигнал/шум. Ключ к наблюдению за отдельными флуоресцентными белками (т.е. GFP) также находится на чистых поверхностях. После длительного использования белковые агрегаты обычно накапливаются на хромированных барьерах и пьедесталах. Поэтому, если перед добавлением флуоресцентных белков на барьерах наблюдается сильный флуоресцентный сигнал, рекомендуется обрабатывать предметные стекла погружением в раствор пираньи на 10 минут. Период времени остается коротким, чтобы избежать разрушения функций хрома. За мытьем «Пираньи» должна последовать регулярная процедура очистки.

Нанопроизводство с использованием электронно-лучевой литографии может быть сложной задачей из-за требований к оборудованию и средствам, а также существующего опыта в области материаловедения. В качестве альтернативы был разработан метод на основе УФ-литографии для получения хромовых элементов для ДНК-штор20. Кроме того, в комплект поставки этого протокола входит базовый шаблон для двойного связывания лямбда-ДНК на длине волны 12 мкм (см. дополнительную информацию). Некоторые аспекты конструкции этого шаблона могут быть скорректированы в соответствии с различными экспериментальными потребностями. К ним относятся расстояние между барьерами и пьедесталами, расстояние между соседними скважинами в барьере для контроля плотности ДНК, а также форма и размер пьедесталов для оптимизации эффективности двойного привязывания и минимизации неопределенности в длине двойного троса. Другие практические проблемы могут включать выбор стратегий флуоресцентного мечения белков, минимизацию смещения при ручном анализе данных и разработку скриптов для более оптимизированной обработки данных.

В то время как описанный здесь протокол включает субстраты дцДНК, ДНК-шторы на основе одноцепочечной ДНК также широко используются 13,14,15,16. При получении субстратов одноцепочечной ДНК используется репликация плазмиды одноцеклеточной ДНК М13 с биотинилированными праймерами13. Сборка занавески из одноцепочечной ДНК также требует использования мочевины и одноцепочечного белка RPA для устранения вторичной структуры и удлинения субстрата13 одноцепочной ДНК. Также может оказаться возможным расширить возможности ДНК за счет использования РНК или ДНК/РНК-гибридов для изучения белков, взаимодействующих с РНК. В настоящее время платформа ДНК-шторы может извлечь выгоду из автоматизации процесса сборки, как подробно описано в разделе 5, большая часть которого представляет собой повторяющиеся инъекции стандартного набора буферов. Это может привести к повышению эффективности одновременного проведения нескольких экспериментов. Кроме того, унифицированный и потенциально основанный на машинном обучении набор сценариев анализа еще больше ускорит обработку данных с минимальным смещением.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят бывших и нынешних сотрудников лаборатории Грина за разработку, оптимизацию и обсуждение протокола ДНК-занавесок, а также за комментарии к этой рукописи. Эта работа была поддержана грантами Национального научного фонда (MCB1154511 до E.C.G.) и Национальных институтов здравоохранения (R01CA217973 до E.C.G.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
программное обеспечение для системы генерации наношаблоновJC Nabity Lithography SystemsN/A NPGS 
Трубка PFA, натуральная наружный диаметр 1/16 x 0,020 дюйма IDIDEX1512L
Poly (метилметакрилат), тактический (24,3 тыс. МВт)Polymer Source Inc.P9790-MMA
Предметное стекло для кварцевого микроскопаG. Finkenbeiner Inc.Н/Д1" x 3" x 1 мм толщина
Сканирующий электронный микроскопFEIN/ANova Nano SEM 450
Скотч Двусторонний скотч, 3/4 x 300 дюймов3Мн/Д
СониксMisonixS-4000Для получения липидов
СоникБрэнсон1800Для ультразвуковой обработки слайдов
Стрептавидин из Streptomyces avidiniiSigma-AldrichS4762растворен в 1X PBS до конечной концентрации 1 мг/мл
серной кислотыAvantor - J.T.Baker9681-01
Шприцевой насосKD Scientific78-0200
Шприц, 500 & микро; L, Модель 750 RN SYR, Большой съемный NDL, 22 ga, 2 дюйма, тип точки 2Hamilton80830Reserve для использования только с липидами
T4 DNA Ligase (400 000 единиц/мл)NEBM0202S

Ссылки

  1. Kowalczykowski, S. C. An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 016410(2015).
  2. Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: globocan sources and methods. International Journal of Cancer. 144, 1941-1953 (2018).
  3. Li, X., Heyer, W. D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Research. 18, 99-113 (2008).
  4. Michel, B., Baoubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair. 6, 967-980 (2007).
  5. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63, 349-404 (1999).
  6. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  7. Mason, J. M., et al. RAD54 family translocases counter genotoxic effects of RAD51 in human tumor cells. Nucleic Acids Research. 43, 3180-3196 (2015).
  8. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annual Review of Biochemistry. 66, 61-92 (1997).
  9. Bianco, P. R. The tale of SSB. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 127, 111-118 (2017).
  10. Hopfner, K. P., Gerhold, C. B., Lakomek, K., Wollmann, P. Swi2/Snf2 remodelers: hybrid views on hybrid molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 22, 225-233 (2012).
  11. Shah, P. P., et al. Swi2/Snf2-related translocases prevent accumulation of toxic Rad51 complexes during mitotic growth. Molecular Cell. 39, 862-872 (2010).
  12. Wright, W. D., Heyer, W. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D loop formation. Molecular Cell. 53, 420-432 (2014).
  13. Ma, C. J., Steinfeld, J. B., Greene, E. C. Single-Stranded DNA Curtains for Studying Homologous Recombination. Methods in Enzymology. 582, 193-219 (2017).
  14. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160, 856-869 (2015).
  15. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural Molecular Biology. 16, 1056-1062 (2009).
  16. Kaniecki, K., De Tullio, L., Greene, E. C. A change of view: homologous recombination at single-molecule resolution. Nature Reviews Genetics. 19, 191-207 (2018).
  17. Redding, S., et al. Surveillance and Processing of Foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas System. Cell. 163, 854-865 (2015).
  18. Lee, J. Y. Base triplet stepping by the Rad51/RecA family of recombinases. Science. 349, 977-981 (2015).
  19. Xue, C., et al. Regulatory control of Sgs1 and Dna2 during eukaryotic DNA end resection. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (13), 6091-6100 (2019).
  20. Gallardo, I. F., Finkelstein, I. J. High-Throughput Universal DNA Curtain Arrays for Single-Molecule Fluorescence Imaging. Langmuir. 31 (37), 10310-10317 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи