Методическая статья

Переваривание целых глаз мыши для мульти-параметрического потока Цитометрического анализа моноядерных фагоцитов

DOI:

10.3791/61348

⸱

17 июня 2020 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет метод переваривания цельных глаз в одноклеточную суспензию с целью многотехатрического цитометрического анализа потока с целью выявления специфических глазных моноядерных фагоцитных популяций, включая моноциты, микроглии, макрофаги и дендритные клетки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Врожденная иммунная система играет важную роль в глазной патофизиологии, включая увеит, диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию. Врожденные иммунные клетки, в частности моноядерные фагоциты, выражают перекрывающиеся маркеры поверхности клеток, что делает идентификацию этих популяций сложной задачей. Цитометрия многотехатрийного потока позволяет проводить одновременный количественный анализ нескольких маркеров поверхности клеток, чтобы дифференцировать моноциты, макрофаги, микроглии и дендритные клетки в глазах мыши. Этот протокол описывает энуклеацию целых глаз мыши, рассечение глаз, пищеварение в одноклеточную подвеску и окрашивание одноклеточной суспензии для маркеров миелоидных клеток. Кроме того, мы объясняем правильные методы определения напряжения с помощью одного цветового управления и для разграничения положительных ворот с помощью флуоресценции минус один элемент управления. Основным ограничением цитометрии многотехатрийного потока является отсутствие архитектуры тканей. Это ограничение может быть преодолено с помощью мульти-параметра потока цитометрии отдельных глазных отсеков или бесплатного окрашивания иммунофлуоресценции. Тем не менее, иммунофлуоресценция ограничена отсутствием количественного анализа и сокращением количества флюорофоров на большинстве микроскопов. Мы описываем использование цитометрической цитометрии многопланетного потока для обеспечения высококоличего анализа моноядерных фагоцитов при лазерной хороидной неоваскуляризации. Кроме того, цитометрия многотравматического потока может быть использована для идентификации подмножества макрофагов, картирования судьбы и сортировки клеток для транскриптомических или протеомных исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Врожденная иммунная система включает в себя несколько типов клеток, которые стимулируют активацию дополнения и воспаление. Врожденные иммунные клетки включают естественные клетки убийцы (НК), тучные клетки, базофилы, эозинофилы, нейтрофилов и моноядерные фагоциты. Моноядерные фагоциты, которые состоят из моноцитов, макрофагов и дендритных клеток, были вовлечены в патофизиологию множественных офтальмологических состояний, включая увеит, диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию (AMD)1. В этом протоколе мы сосредоточимся на выявлении моноядерных фагоцитов с использованием многотеатрического цитометрического анализа потока в мышиной модели неоваскулярной AMD2. Этот протокол адаптируется для мышиных моделей диабетической ретинопатии и/или увеита, но более обширное рассечение глаз рекомендуется из-за системного характера этих заболеваний.

Моноядерные фагоциты выражают перекрывающиеся маркеры поверхности клеток. Долгосрочные ткани резидентов макрофагов и микроглии происходят из желточного мешка полученных эритромиелоидныхпрародителя 3, в то время как переработка макрофагов и дендритных клеток отличаются от костного мозга полученных макрофагов дендритных клетокпрародителя 4. Маркеры поверхности клеток мыши, общие для моноцитов, макрофагов и дендритных клеток включают CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17, и внутриклеточный маркер Iba18. Для того, чтобы преодолеть эту проблему, транскриптомный анализ макрофагов, моноцитов и дендритных клеток из нескольких тканей определяет CD64 как макрофаг-специфический маркер поверхностиклеток 6. Макрофаги были описаны в радужной оболочке глаза, хороид, цилиарного тела, и зрительного нерва в здоровыхглазах 3. Кроме того, дендритная идентификация клеток является более сложной; наиболее специфический метод дендритной идентификации клеток требует картирования судьбы с помощью мыши репортера9. Независимо от этой линии репортера, выражение CD11c и MHCII в сочетании с отсутствием CD64 может определить потенциальные дендритныеклетки 6,10. Дендритные клетки были выявлены в роговицы, конъюнктивы, радужной оболочки глаза, и хороид в нормальныхглазах 11. Микроглии являются специализированными макрофагами, расположенными в сетчатке, защищенными гемово-сетчаткой барьером и полученными из клеток-предшественников желточногомешка 12. В результате, микроглии сетчатки могут быть дифференцированы от моноцитов полученных макрофагов их тусклый уровень экспрессии CD4513 и высокие уровни Tmem119, который доступен в качестве потока цитометрииантитела 14. После активации микроглии, однако, CD45 может быть до регулируемых15 и Tmem119 может быть внизрегулируется 3, демонстрируя сложность биологии микроглии, и это, вероятно, имеет отношение как в AMD и его мыши модели. Наконец, моноциты можно разделить по крайней мере на два подтипа, включая классический и неклассический. Классические моноциты отображаютCCR2 и Ly6C высокой CX3CR1 низкой экспрессии, и неклассических моноцитов продемонстрировать CCR2-Ly6CнизкийCX3CR1высокие маркеры 5.

В связи с необходимостью количественного анализа экспрессии маркеров, т.е. высоких и низких/димовых уровней, цитометрия многотеатрийного потока является идеальным методом для дискриминации моноцитов, макрофагов, микроглий и дендритных клеток в глазу и других тканях. Дополнительные преимущества включают идентификацию суб популяций, возможность использования флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) для сортировки популяций клеток для транскриптомного или протеомного анализа, а также картирование судьбы. Основным недостатком цитометрии многотехатрийного потока является отсутствие архитектуры тканей. Это можно преодолеть путем офтальмологического вскрытия в различные глазные подкомпартии: роговицу, конъюнктиву, радужную оболочку, хрусталик, сетчатку и хороидно-склерический комплекс. Кроме того, может быть выполнена подтверждаемая иммунофлуоресценция, но ограниченная количеством маркеров и отсутствием надежной количественной оценки.

Геном широкий ассоциации исследования связаны несколько генов дополнения с AMD16. Активация дополнения приводит к выработке анафилактоксина, набору лейкоцитов и, как следствие, воспалению. В дополнение к рецептору недостаточно мышей, лазерная травма уменьшает моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированных хороидной неоваскуляризации (CNV)области 17. Аналогичным образом, C-C мотив хемокин рецептор 2 (CCR2) нокаут мыши, которая не хватает моноцитов набора в ткани, демонстрирует как снижение моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированной области CNV18. Эти данные связывают дополнение и моноядерные фагоциты с экспериментальным CNV и, возможно, неоваскулярной AMD. В поддержку этой ассоциации, дополнение рецепторов дисрегулируются на периферических моноцитов крови у пациентов с неоваскулярной AMD19,20. Эти данные свидетельствуют о сильной связи между AMD и моноядерными фагоцитами.

В этой рукописи мы будем использовать экспериментальную лазерную индуцированную модель CNV для характеристики моноядерных популяций фагоцитов в мышином глазу с использованием цитометрии многотактного потока. Лазерно-индуцированной CNV является стандартной моделью мыши неоваскулярной AMD, которая продемонстрировала эффективность текущей первой линии неоваскулярной терапии AMD21. Этот протокол будет описывать энуклеацию глаз мыши, рассечение глаз, пищеварение в одноклеточную подвеску, окрашивание антител, определение лазерных напряжений с использованием одного цветового контроля и стратегию фиксации с использованием флуоресценции минус один (FMO) управления. Для подробного описания лазерной индуцированной модели CNV, пожалуйста, смотрите предыдущую публикацию22. Используя этот протокол, мы определим микроглии, моноциты, дендритные клетки и популяции макрофагов. Кроме того, мы будем использовать MHCII и CD11c для дальнейшего определения подмножего макрофагов в лазерной индуцированной модели CNV.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета. C57BL/6 мышей были группы размещены на барьер объекта в Центре сравнительной медицины в Северо-Западном университете (Чикаго, Иллинойс). Все животные были размещены в 12/12 ч свет / темный цикл с бесплатным доступом к пище и воде.

1. Коллекция глазной ткани

  1. Пожертвование 10-12-недельный C57BL/6J мышей любого пола с использованием регулируемого администрирования двуокиси углерода, пока мышь не отвечает и больше не вдыхает. Выполните вывих шейки матки или другой утвержденный вторичный метод для обеспечения эвтаназии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Транскардиальная перфузия может быть выполнена для удаления циркулирующих лейкоцитов, которые не находятся в глазных тканях. В этом эксперименте системная перфузия не уменьшает количество микроглии, моноцитов, макрофагов или дендритных клеток, обнаруженных в необработанных или обработанных лазером цельных глазах. Таким образом, большинство из этих типов клеток расположены в офтальмологических тканях, и этот шаг является необязательным.
  2. Чтобы увядить глаза, нажмите вниз возле глазницы, поместив пару изогнутых типсов мягко под глазом, как он выделяется из гнезда. Pinch щипси закрыты под глазом, не сжимая фактический глаз. Выбить глаз из окружающей конъюнктивы (пожалуйста, см. предыдущую публикацию)23.
  3. Потяните глаз боковой, пока зрительный нерв является единственным оставшимся соединением, чтобы отделить глаз. Зрительный нерв часто разрывается с напряжением, но маленькие ножницы иногда необходимо сократить зрительный нерв. Поместите глаз в холодный 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) с кальцием и магнием в микроцентрифугной трубке 1,7 мл.

2. Переваривание глазной ткани

  1. Приготовьте буфер пищеварения, содержащий фермент пищеварения 0,1 мг/мл и 0,2 мг/мл DNase в холодном HBSS. Восстановить фермент пищеварения 5 мг в 2 мл стерильной воды на начальном этапе. Подготовка первоначального разбавления 10 мг/мл DNase в HBSS. На каждые 10 мл буфера пищеварения (достаточно для 3 животных) смешайте 9,4 мл холодного HBSS с 0,4 мл восстановленного фермента пищеварения и 0,2 мл разбавленного DNase I.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти концентрации были эмпирически определены в течение нескольких экспериментов, чтобы обеспечить оптимальный уровень окрашивания антител отдельных клеток, при одновременном снижении смертности клеток. Коллагеназа D была опробована в качестве альтернативы ферменту пищеварения с пониженной жизнеспособностью клеток и снижением CD45и клеток. Более подробную информацию о итеративном процессе оптимизации пищеварения можно найти в обсуждении.
  2. Под рассечением микроскопа при 10-х общем увеличении удалите оставшуюся конъюнктиву и зрительный нерв с помощью тонких типсов и пружинных ножниц в холодном HBSS.
  3. Переместите чистые глаза на сухое рассекаемое блюдо или небольшую лодку для взвешивания. Ввините 0.15-0.20 mL/eye буфера пищеварения через шприц, оснащенный иглой 30 G в стекловидную полость после того, как две перфорирующие раны сделаны в глазу через ось зрения и на 90 градусов от этой первой раны для регресса буфера пищеварения.
  4. Фарш цельные глаза с помощью пружинных ножниц и тонких типсов со всеми кусочками меньше, чем 0,5 мм х 0,5 мм. Диссоциативная ткань объектива с тупым механическим нарушением с помощью типсов, чтобы предотвратить засорение пипетки советы в последующих шагах. Для каждого образца, промыть типсы и ножницы каждый с 0,75 мл буфера пищеварения в небольшое блюдо. Используйте новое блюдо для каждого образца.
  5. Передача содержимого блюда в диссоциацию трубки на льду с помощью P1000 пипетки заботиться, чтобы не потерять материал в пипетке передачи. Промыть блюдо дополнительными 1,5 мл буфера пищеварения доведя общий объем в диссоциательной трубке до 3,25-3,50 мл.
  6. Поместите диссоциационную трубку, перевернутую на электронный диссоциатор, и запустите цикл "m_brain_03_01", состоящий из 1 мин однонаправленного вращения при 200 об/мин при комнатной температуре, что является предварительно загруженной программой. Убедитесь, что все ткани находится в нижней части диссоциации трубки в контакте с буфером пищеварения и ротором для этого и всех оставшихся шагов.
  7. Поместите диссоциацию трубки в трясущимся инкубаторе в течение 30 минут при 200 об/мин при 37 градусах Цельсия.
  8. Повторите шаги 2.6 и 2.7 один дополнительный раз. После второго 30 мин инкубации выполнить один окончательный механического пищеварения с использованием электронного диссоциатора, как в шаге 2.6.
  9. Остановите реакцию, добавив 10 мл буфера холодного потока и поместите трубки на лед.

3. Подготовка клеточной подвески

  1. Чтобы создать одноклеточную подвеску, залить остановленную реакцию пищеварения глаз через 40 мкм фильтр, размещенный на верхней части 50 мл конической центрифуги трубки. Используя поршень из шприца 2,5 мл, проталкивайте через фильтр оставшиеся кусочки непереваренной ткани глаза.
  2. Вымойте диссоциальную трубку с 10 мл буфера потока и промыть фильтр, прежде чем использовать тот же поршень снова пройти непереваренных частей ткани глаза через фильтр.
  3. Повторите шаг 3.2 с помощью 5 мл буфера потока.
  4. Вымойте диссоциальную трубку и фильтр с окончательным 10 мл буфера потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем реактора и буфера потока составляет около 38-40 мл для каждого образца.
  5. Центрифуга конической трубки при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Декант супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  6. Подготовка 1x облив решение, добавив 10x лисинг раствор стерильной воды. Разбейте гранулы, щелкивая трубку против другой трубки. Чтобы вылить красные кровяные тельца, добавьте 1 мл раствора 1x лиза на 30 с закрученной при комнатной температуре (RT).
  7. Остановите реакцию с 20 мл буфера потока.
  8. Центрифуга конической трубки при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Декант супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  9. Отмежеваться гранулы, щелкая трубку против другой трубки. Добавьте 5 мл холодного 1x HBSS на трубку.
  10. Центрифуга трубки при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспират супернатант.

4. Окрашивание клеточной суспензии для моноядерных фагоцитов

  1. Подготовь 0,5 мл живого/мертвого пятна на образец, разбавляя живой/мертвый краситель 1:5,000 в холодном HBSS.
  2. Добавить Live / Мертвые пятна на каждый образец с помощью P1000 пипетки убедившись, чтобы разобщить гранулы полностью. Передача образцов в 1,2 мл микро-titer труб.
  3. Возьмите небольшую алициту (10 МКЛ) для подсчета ячеек с помощью гемоцитометра или автоматической счетчика ячейки (см. 4.4). Инкубировать образцы с Live / Мертвые пятна в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
  4. Подсчитайте клетки, использующие Trypan blue, чтобы определить количество живых клеток на образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 2 глаза от 10-12-недельной мыши C57BL/6J содержат менее 2 х 106 живых клеток.
  5. Вымойте образцы, добавив 400 МКЛ буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  6. Повторное течение ячеек полностью в 500 йл буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  7. Блок до 5 х 106 живых клеток в 50 МКЛ блока Fc (1:50 разбавления в холодном буфере потока очищенных крыс анти-мышь CD16/CD32). Если более 5 х 106 живых клеток, увеличить объемы надлежащим образом.
  8. Добавьте блок Fc к грануле убедившись, что полностью разобщить образец. Инкубация в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия.
  9. Добавьте 50 МКЛ раствора окрашивания антител (см. таблицу 1 для выбора и количества каждого антитела, которое входит в раствор) на 5 х 106 живых клеток непосредственно к клеткам в блоке Fc и полностью перемешать. Инкубировать в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител зависит от конфигурации цитометра потока и должно быть титровано независимо для каждой лаборатории и инструмента. Смотрите таблицу 2 для конфигурации инструмента фильтров и зеркал. Чтобы титровать антитела, начните с рекомендации производителя и рассчитайте индекс окрашивания. Выполните тестовый запуск различных концентраций антител (как выше, так и ниже рекомендации производителя) и выберите самую низкую концентрацию антител, где поддерживается индекс окрашивания. Кроме того, убедитесь, что положительное окрашивание, которое является менее ярким, чем одноцветный контроль. Используйте необлитаемые клетки, чтобы убедиться, что отрицательно окрашенные клетки находятся в масштабе и имеют пик на уровне или менее 1 х 102. Используйте флуоресценцию минус один контроль для определения положительно окрашенных клеток.
  10. Вымойте образцы, добавив 700 МКЛ буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  11. Опционально, после окрашивания антител, образцы могут быть исправлены с 500 йл 2% параформальдегида в буфере потока. Исправить образцы в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем выполните одну стирку, как описано в 4.10. Храните фиксированные образцы при 4 градусах Цельсия. Граф бисер должен быть добавлен в день сбора данных цитометрии потока. Фиксированные образцы следует запускать на цитометре потока в течение 1-2 дней.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является коррозионным и опасно для здоровья.
  12. Снова вымойте образцы, используя 500 МКЛ буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать половину супернатанта, не нарушая клеточной гранулы.
  13. Resuspend гранулы и передачи на 96 хорошо, U-дно анализ пластины. Центрифуга пластины при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Чтобы вы декантировать супернатант, переверните пластину и в одном сильном встряхивании выбить жидкость в раковину бассейна, не нарушая гранулы.
  14. В новой трубке микро-рейтеров 1,2 мл, поместите 50 МКЛ хорошо вихревых бусин.
  15. Resuspend гранулы в 96 пластины хорошо в 200 йл холодного потока буфера. Добавить клеточной смеси на верхней части бисера от предыдущего шага. Запуск на поток цитометра в общем объеме 250 йл / микро-титер трубки.

5. Сбор данных о цитометрии потока

  1. Включите и подготовьте поток цитометра. Инструкции, перечисленные здесь для модифицированных четыре лазерных цитометра (Таблица 2).
  2. Вы запустите тестовый образец, который включает в себя небольшую алицита из каждого образца, чтобы убедиться, что все ячейки находятся в масштабе для каждого детектора. Отрегулируйте напряжение так, чтобы все ячейки были в масштабе.
  3. Вы запустите одиночные элементы управления цветом (SCC) для каждого фторфора, используемого в окрашивание коктейль (Таблица 3). Поместите микро-трубку titer в большую полистироловую трубку объемом 5 мл для размещения на стадии цитометра потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корневые флюорофоры, такие как BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) и Alexa700 не требуют того же антитела, что и коктейль (т.е. CD19 PE для CD64 PE). Тем не менее, тандем флюорофоры, как PE-CF594, PE-Cy7, или APC-Cy7 требуют того же антитела для SCC, как коктейль из-за потенциальной диссоциации конъюгированных фторфоров.
    1. Создайте SCC для BV421, добавив 2 капли компенсационных бусинок в 1,2 мл тюбика вместе с 1 йл хомяка антимошашки CD11c BV421. Компенсационные бусины используются потому, что CD11c BV421 является подтипом IgG lambda, а не каппа, как описано в 5.3.3. Инкубация в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Добавьте 0,2 мл буфера потока.
    2. Создайте SCC для живого/мертвого красителя, добавив одну каплю положительных окрашивающих бусин (зеленая шапочка) из реактивных бусин амина, а затем 1 йл живого/мертвого красителя. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Добавьте одну каплю отрицательных бусин (белая шапочка) из амина реактивных бусин. Добавьте 0,2 мл буфера потока.
    3. Создайте оставшиеся SCCs, добавив одну каплю положительных шариков окрашивания (зеленая шапочка) из анти-крысы и анти-хомяка Ig kappa бисера набор, а затем количество антител, перечисленных (Таблица 3) в 1,2 мл титр трубки. Инкубировать в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию. Добавьте одну каплю отрицательных бусин (белая шапочка) из анти-крысы и анти-хомяка Ig kappa бисера набор. Добавьте 0,2 мл буфера потока.
    4. Vortex все смеси бисера полностью. Храните SCC при 4 градусах Цельсия в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SCC для флуоресцентных мышей репортер не окрашенных клеток.
    5. При запуске SCC установите напряжение таким образом, что образец SCC имеет пик больше, чем любая флуоресценция для образца клеток в том же канале детектора. Кроме того, напряжение должно быть установлено таким образом, чтобы любой SCC имеет по крайней мере 0,5 Лог разница между пиком гистограммы в канале интереса по сравнению с любым другим каналом (Рисунок 1).
  4. Вы запустите образцы на "Низкий" сохраняя события / второй ниже 4000. Если скорость потока не может быть снижена надлежащим образом, разбавьте образцы дополнительным буфером холодного потока. Замечите добавленный объем, так как это будет необходимо для расчета счета (см. репрезентативные результаты).
  5. Соберите не менее 3 х 106 событий на выборку. Это может быть выше, чем количество клеток из-за пигментных гранул и мусора подсчета, как события на цитометре.
  6. Запись флуоресценции Минус один (FMO) для каждого флюорофора, кроме Live / Dead для надлежащей стратегии gating в разделе 6.4. FMO является образцом, который был окрашен со всеми флюорофорами, кроме одного.
  7. Очистите и выключите цитометр потока в соответствии с инструкциями производителя или предприятия.

6. Аннотация данных цитометрии потока

  1. Откройте новый лист с помощью программного обеспечения для анализа. Импорт файлов FCS из цитометра для всех образцов и одноцветных элементов управления.
  2. Используйте SCC для создания матрицы компенсации.
  3. Примените матрицу компенсации к окрашенным образцам и FMOs.
  4. Используйте FMOs для определения положительного окрашивания, чтобы нарисовать ворота.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показаны некомпенсированные гистограммы частоты для SCC и клетки для красного лазера: Alexa647, Alexa700 и APC-Cy7. На рисунке 1A,пурпурная линия изображала пик SCC для Alexa647, в то время как циановая линия показала предназначенную разницу в 0,5 журнала. Обратите внимание, что пик в Alexa700 и APC-Cy7 был слева (менее яркий) голубой линии. Также обратите внимание, что все клетки были слева от пурпурной линии. Любые ячейки справа от пика SCC не был...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цитометрия многотехатрийного потока позволяет количественно провести количественный анализ нескольких типов клеток в сложной ткани. В этом докладе мы описываем цитометрическое обнаружение потока моноядерных популяций фагоцитов, включая моноциты, дендритные клетки и подмножества макрофагов, после лазерной травмы глаза мыши. Liyanage и др. Недавно сообщили о подобной стратегии гэтинга для обнаружения нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, ДК, макрофагов, проникновения макрофагов имоноцитов 27. Наша с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JAL была поддержана грантом NIH K08EY030923; CMC была поддержана грантом K01 (5K01AR060169) от Национального института артрита и болезней опорно-двигательного мозга и новым исследовательским грантом (637405) от Исследовательского альянса волчанки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужные пробирки 0,6 млFisher Scientific05-408-120
1,7 мл микроцентрифужные пробиркиCostar3620
10 мл пипеткиFisher Scientific431031
15 мл коническиеThermoFisher339650
1x HBSS, 500 млGibco14025-092
2,5 мл шприцHenke Sass Wolf7886-1
20% раствор параформальдегидаЭлектронная микроскопия Sciences15713-S
25 мл пипеткиFisher Scientific431032
игла 30 г Exel26437
3 мл шприц с люэровским замкомFisher Scientific14955457
41 x 41 x 8 мм полистирольная весовая чашкаFisher Scientific08-732-112
Конические бусины 50 млFalcon352070
96-луночные, U-образная пробирная пластина без крышкиFalcon353910
Аминные реактивные бусиныThermoFisherA10628
Аналитическое программное обеспечениеFlowJov 10
Набор бусин против крыс и хомяков Ig каппа набор BDBiosciences552845
C57BL/6J мышиJackson Laboratory664
Счетчик клетокInvitrogenAMQAX1000
Счетчик клетокInvitrogenC10283
Компенсационные бусиныThermoFisher01-1111-42
Подсчет бусинThermoFisher01-1234-42
Изогнутые щипцыFisher Scientific16-100-123
Фермент пищеваренияSigma Aldrich5401020001
Препарирующий микроскопNational Optical and Scientific Instruments, Inc.DC3-420T
Диссоциационные трубкиMiltenyi Biotec130-096-334
DNaseRoche10104159001
Электронный диссоциаторMiltenyi Biotec130-095-937
FACS Diva программное обеспечениеBD Biosciences
Fc block, крыса антимышиный CD16/CD32BD Biosciences553142
Тонкие щипцыIntegra Miltex17035X
Проточный буферMiltenyi Biotec130-091-221
Проточный цитометрBD Biosciences
Проточные трубкиFalcon352008
Хомяк антимышиный CD11c BV421BD Biosciences562782
Ведро для льдаFisher Scientific07-210-123
Живой/мертвый красительThermoFisher65-0866-14
Лизирующий раствор, 10x растворBD Biosciences555899
Микротитр пробирки и штативыFisher Scientific02-681-380
Мышиный антимышь CD64 PE BioLegend139304
Мышиный антимышь NK1.1 PECF594BD Biosciences562864
Наконечники для пипеток P1000Denville ScientificP2404
P1000 пипеткиGilsonFA10006M
P2 пипеткиeppendorf22491806
P2 пипеткиGilsonFA10001M
P20 пипеткиGilsonFA10003M
P200 наконечники для пипетокDenville ScientificP2401
Пипеттор P200ЖильсонFA10005M
Пипет человекFisher ScientificFB14955202
Крыса антимышиный B220 PECF594BD Biosciences562313
Крыса антимышиный CD11b APC-Cy7BD Biosciences557657
Крыса антимышиный CD19 AlexaFluor 700BD Biosciences557958
Крыса антимышиный CD19 PEBD Biosciences553786
Крыса антимышиный CD4 PECF594BD Biosciences562314
Крыса антимышиный CD45 FITCThermoFisher11-0451-82
Крыса антимышиный CD45 PE-Cy7BD Biosciences552848
Крыса антимышиный CD8 PECF594BD Biosciences562315
Крыса антимышиный Ly6CBD Biosciences
Rat anti-mouse Ly6G PECF594BD Biosciences562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700BioLegend107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594BD Biosciences562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647BD Biosciences564178
Shakeking incubatorLabnet311DS
Пружинные ножницыFine Science Tools15024-10
Стерильное клеточное ситечко, нейлоновая сетка 40 ммFisher Scientific22363547
Стерильная вода, 500 млGibcoA12873-01
Качающееся ведро центрифугаeppendorf5910 R
Трипан синий, 0,4% растворGibco15250061
561085

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099(2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935(2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313(2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636(2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FMO

Похожие статьи