Методическая статья

Тканеспецифические инструменты РНК-интерференции для идентификации компонентов для системной сигнализации стресса

DOI:

10.3791/61357

⸱

16 мая 2020 г.

 , 
1School of Molecular and Cell Biology & Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддержание протеостаза организма требует координации реакций контроля качества белка, таких как экспрессия шаперонов от одной ткани к другой. Здесь мы предоставляем инструменты, используемые у C. elegans , которые позволяют контролировать способность протеостаза в конкретных тканях и определять межклеточные сигнальные реакции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последнее десятилетие произошел революционный рост знаний о регуляции процессов контроля качества белка, что обнажило важность межклеточных сигнальных процессов в регуляции клеточного неавтономного протеостаза. Недавние исследования в настоящее время начинают раскрывать сигнальные компоненты и пути, которые координируют контроль качества белка от одной ткани к другой. Поэтому важно определить механизмы и компоненты клеточно-неавтономной сети протеостаза (ПН) и ее значение для старения, реакций на стресс и заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белка. В лабораторных условиях мы используем генетический нокдаун тканеспецифической РНК-интерференции в сочетании со стресс-репортерами и тканеспецифическими датчиками протеостаза, чтобы изучить это. Мы описываем методологии изучения и идентификации компонентов клеточно-неавтономной ПН, которые могут действовать в тканях, воспринимающих стрессовое состояние, и в реагирующих клетках, активируя защитный ответ. Сначала мы опишем, как генерировать шпилечные конструкции РНК-интерференции для конститутивного генетического нокдауна в конкретных тканях и как выполнять тканеспецифичный генетический нокдаун путем кормления РНК-интерференцией на различных этапах жизни. Стресс-репортеры и поведенческие анализы функционируют как ценные данные, которые позволяют быстро проводить скрининг генов и состояний, модифицирующих системные стрессовые сигнальные процессы. Наконец, сенсоры протеостаза, экспрессируемые в различных тканях, используются для определения изменений тканеспецифической способности ПН на разных стадиях развития и старения. Таким образом, эти инструменты должны помочь уточнить и позволить контролировать способность ПН в конкретных тканях, а также помочь идентифицировать компоненты, которые функционируют в различных тканях для опосредования клеточно-неавтономной ПН в организме.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточный протеостаз контролируется сложной сетью компонентов контроля качества белка, таких как молекулярные шапероны, стрессовые реакции и механизмы деградации, включая убиквитиновую протеасомную систему (UPS) и аутофагию 1,2. Активация путей реакции на стресс, таких как опосредованная HSF-1 реакция на тепловой шок (HSR), развернутая белковая реакция эндоплазматического ретикулума (UPRER) и митохондрий (UPRmito), жизненно важна для клеточной адаптации и выживания во время вызовов окружающей среды или болезни неправильного сворачивания белка, которые приводят к токсичной агрегации белков 1,2,3,4,5, 6.

Клеточный протеостаз координируется дополнительным слоем у многоклеточных организмов, таких как C. elegans, который требует координации клеточных реакций на стресс в различных тканях для активации защитных компонентов контроля качества белка, таких как молекулярныешапероны. В последнее десятилетие наблюдалась клеточная неавтономная активация «клеточных» путей реакции на стресс для реакции на тепловой шок (HSR), UPRER и UPRmito, а также трансцеллюлярной шапероновой сигнализации (TCS)3,4,7,8,9,10 . В каждом случае нервная система, а также сигналы из кишечника играют решающую роль в контроле активации шаперонов в тканях, чтобы защитить от токсических последствий острых и хронических стрессов неправильного сворачивания белка 3,5,9,11. Эта передача от нейронов к кишечнику и другим клеткам на периферии может быть достигнута с помощью нейротрансмиттеров, как в случае с UPRER и HSR 6,8,11. В одной из форм клеточной неавтономной стрессовой сигнализации, TCS, которая активируется повышенной экспрессией HSP-90 в нейронах, секретируемые иммунные пептиды играют роль в активации экспрессии шаперона HSP-90 от нейронов к мышцам. При другой форме ТКС снижение экспрессии основного молекулярного шаперона hsp-90 в кишечнике приводит к увеличению экспрессии индуцируемого теплом hsp-70 при разрешающей температуре в мышце стенки тела 5,10. В данном конкретном случае, однако, специфические сигнальные молекулы, активированные в кишечнике, воспринимающем стресс, и реагирующие мышечные клетки неизвестны.

Таким образом, для того, чтобы определить, как экспрессия шаперонов активируется от одной ткани к другой, необходим подход, позволяющий контролировать емкость сети протеостаза (ПН) и активацию реакции на стресс на тканеспецифическом уровне. Чтобы исследовать, какой путь реакции на стресс активируется в отдельных тканях, можно использовать доступный набор транскрипционных шаперонов, слитых с флуоресцентными белковыми метками (см. также Таблицу 3). К ним относятся флуоресцентно помеченные транскрипционные репортеры hsp-90, hsp-70 и hsp-16.2, которые указывают на индукцию HSR, hsp-4, указывающий на активациюUPR ER, и hsp-6, указывающийна MITO UPR. Комбинация этих репортеров с тканеспецифическим стрессовым состоянием позволяет получить мощное считывание, которое точно определит отдельные ткани, реагирующие на дисбаланс PN в дистальной ткани-«отправителе», воспринимающей стресс. Чтобы вызвать стрессовое состояние или дисбаланс ПН в определенной ткани, могут быть использованы различные подходы. Например, один из таких подходов заключается в эктопической экспрессии активированной формы фактора стрессовой транскрипции (например, xbp-1s), а другой подход заключается в снижении уровней экспрессии существенного молекулярного шаперона (например, hsp-90) с использованием тканеспецифичных промоторов 8,10. Для истощения компонентов PN только в одном типе клеток полезным инструментом является тканеспецифический нокдаун с помощью РНК-интерференции.

У C. elegans РНК-интерференция, однако, является системной; двухцепочечная РНК в окружающей среде может проникать и распространяться по всему животному, подавляя целевой ген12,13. Это системное распространение проглоченной дцРНК опосредовано белками SID (дефектные системные РНК), такими как белки SID-1 и SID-2, которые являются транспортерами дцРНК, а также SID-5, который колокализуется с поздними белками эндосом и участвует в экспорте проглоченной дцРНК 14,15,16. SID-1 является многоходовым трансмембранным белком во всех клетках, кроме нейронов, и необходим для экспорта дцРНК, а также для импорта в клетки17. Экспрессия SID-2 ограничена кишечником, где он функционирует как эндоцитарный рецептор для поглощения дцРНК из просвета кишечника в цитоплазму кишечных клеток16. У нейронов отсутствует ответ на системную РНК-интерференцию, что коррелирует со сниженной экспрессией трансмембранного белка SID-1 в нейронах, что необходимо для импорта дцРНК 15,18. Таким образом, для того, чтобы тканеспецифическая РНК-интерференция была эффективна только в одном типе клеток, необходимо предотвратить системное распространение дцРНК. Это может быть достигнуто путем использования РНК-резистентного мутанта sid-1(pk3321), который предотвращает высвобождение и поглощение дцРНК через ткани15. Экспрессия тканеспецифической конструкции РНК-интерференции шпилеки в этом мутанте или эктопическая экспрессия SID-1 в конкретной ткани может затем дополнить функцию мутантного sid-1 и обеспечить тканеспецифическую РНК-интерференцию19.

Так как же дцРНК поглощается кишечником мутанта с потерей функции sid-1 и как она может затем достичь нейронов или мышечных клеток, которые эктопически экспрессируют конструкцию SID-1? В одной из современных моделей, объясняющих этот механизм, эндоцитозированная дцРНК проникает в цитоплазму кишечника через SID-2, а затем экспортируется в псевдоцелому с помощью другого независимого от SID-1 механизма, включающего SID-5 и трансцитоз17. Таким образом, поскольку SID-1 необходим для импорта дцРНК17, только клетки, экспрессирующие дикий тип SID-1, смогут поглощать дцРНК, высвобождаемую из кишечника, в псевдоцелом.

Здесь мы демонстрируем использование набора инструментов, которые позволяют создавать тканеспецифическую РНК-интерференцию. Мы используем пример молекулярного шаперона Hsp90 для описания построения РНК-интерференции, которая может быть полезна для конститутивного подавления экспрессии генов в конкретной ткани10. Описанный подход может быть использован для любого гена-мишени, представляющего интерес. Реакцию других тканей на дисбаланс протеостаза, вызванный тканеспецифичной РНК-90 hsp-90 , можно исследовать путем мониторинга экспрессии флуоресцентно помеченных стресс-репортеров в других тканях. В качестве второго метода для тканеспецифичной РНК-интерференции мы демонстрируем, как мутантная система sid-1 может быть адаптирована для питания РНК-экспрессирующих бактерий, а не для экспрессии шпилечной РНК-интерференции. Это может быть полезно при проведении скрининга кандидата или полногеномной РНК-интерференции для определения компонентов, необходимых для тканеспецифического ответа. Аналогичным образом, дефекты развития, связанные с истощением жизненно важного компонента PN, потребуют РНК-опосредованного нокдауна в определенных тканях на более поздних стадиях развития. Мы демонстрируем, как система комплементации SID-1 может быть использована для скрининга РНК-интерференции кандидата на тканеспецифичные модификаторы TCS. В этом примере мы стремимся идентифицировать сигнальные компоненты, которые при нокдауне в «воспринимающей стресс» ткани-отправителе (кишечнике) и ткани, вызывающей стресс (мышце), приводят к изменению экспрессии флуоресцентно помеченного репортера hsp-70 в мышечных клетках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Тканеспецифическая РНК-интерференция двумя способами: шпилечная РНК-интерференция и тканеспецифическая комплементация SID-1

  1. Генерация шпилечных конструкций РНК-интерференции для тканеспецифической экспрессии у мутантов sid-1
    1. Амплифицируйте последовательность гена-мишени (например, последовательность hsp-90 , выделенную из клона РНК-интерференции hsp-90 из библиотеки РНК-интерференцииAhringer 20) с помощью ПЦР. Поместите непалиндромную последовательность на 3'-конец последовательности hsp-90 , то есть сайт SfiI (ATCTA)21.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для клонирования hsp-90 с последовательностью SfiI (подчеркнуто) используются следующие праймеры:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      AS-HSP90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
    2. Субклонируйте амплифицированную последовательность в вектор коммерческого набора для клонирования (например, TOPO pCR BluntII).
    3. Выделите инвертированную последовательность hsp-90 из клона hsp-90 RNAi (библиотека Ahringer RNAi)20 путем рестрикционного расщепления с использованием сайтов рестрикции XbaI и PstI и поместите ее ниже последовательности hsp-90-SfiI в векторе (из шага 1.1.1), в результате чего получится конструкция шпильки hsp-90 (рис. 1).
    4. Субклонировать конструкцию шпильки в входной вектор Gateway pDONR221 и объединить его с входными клонами Gateway, содержащими тканеспецифичные промоторы для любой экспрессии в нейронах (rgef-1p); в кишечнике (vha-6p); или мышца стенки тела (UNC-54P) и UNC-54 3'UTR (или любой другой 3'UTR по выбору) в реакции Gateway, как описано в протоколе поставщика.
    5. Линеаризовать полученные шпильковые РНК-интерференции (рис. 1) с использованием уникального сайта рестрикции за пределами кодирующей последовательности и микроинъекции в виде сложного массива в концентрации 1 нг/мкл шпилечной РНК-интерференции, смешать с 100 нг/мкл N2 Bristol genoom DNA (расщепленной с ScaI) в штамм C. elegans, экспрессирующий репортер hsp-70p::RFP (штамм AM722) и скрещивающийся с генетическим фоном sid-1 (pk3321) мутанты (штамм NL3321). Протокол о том, как выполнять микроинжекцию сложных массивов, см.в пункте 22.
    6. В качестве отрицательного контроля используйте пустые векторные конструкции шпилек, экспрессирующие непалиндромную последовательность, содержащую SfiI (GGCCATCTAGGCC), под контролем тканеспецифического промотора.
    7. Используйте повышенную экспрессию hsp-70p::RFP репортера в качестве считывания для оценки положительных трансформантов, экспрессирующих РНК-шпильку hsp-90 (рис. 3). Для более общего подхода к проверке тканеспецифичного нокдауна любого интересующего гена измерьте уровни мРНК всего животного с помощью qRT-PCR интересующего гена.
    8. Интегрируйте внехромосомный массив полученного штамма, экспрессирующего специфичную для кишечника конструкцию шпильки hsp-90 (PVH2; см. табл. 1) с помощью гамма-облучения. Для интеграции экстрахромосомных массивов в геном см.22.
  2. Тканеспецифическая экспрессия SID-1 для обеспечения тканеспецифической РНК-интерференции путем кормления бактерий, экспрессирующих дцРНК
    1. Субклонировать геномную ДНК sid-1 из вектора TU867 (unc-119p::SID-1)19 в вектор входа Gateway pDONR221. Праймеры для клонирования ДНК sid-1 можно найти в19. Объедините конструкцию sid-1 pDONR221 с входными клонами Gateway, содержащими специфичные для мышц (myo-3p) или кишечника (vha-6p) промоторы, и unc-54 3'UTR (или любой другой 3'UTR по выбору) в реакции Gateway, как описано ранее в 1.1.4.
    2. Микроинъекции полученных конструкций vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR или myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR в концентрации 30 нг/мкл вместе с красным флуоресцентным маркером коинъекции глотки (например, myo-2p::RFP; 5 нг/мкл) в мутанты sid-1(pk3321 ).
    3. Интегрируйте внехромосомные, специфичные для кишечника или мышц матрицы sid-1 в геном, как описано впункте 22. В данном случае это привело к появлению штаммов PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) и PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; СИД-1(ПК3321).
    4. Для нейрон-специфичной экспрессии sid-1 у мутанта sid-1(pk3321) используйте штамм TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321), который был ранее сгенерирован Calixto et al.19.
    5. Как упоминалось в пункте 1.1.7, обеспечить тканеспецифический нокдаун интересующего гена путем измерения уровней мРНК желаемого гена-мишени с помощью количественной ОТ-ПЦР. В качестве альтернативы можно подтвердить чувствительность тканеспецифической РНК-интерференции с помощью флуоресцентного белка (например, GFP или RFP), экспрессируемого в той же ткани, и лечить червей GFP или RFP RNAi. Подвергайте нематод воздействию GFP/RFP RNAi в виде синхронизированных личинок стадии L1 и выращивайте их на РНК-интерференцах бактерий до 1-го дня взрослой жизни (см. рис. 2). В нашем случае мы использовали штаммы, экспрессирующие SID-1 в нейронах, мышцах или кишечнике, и скрещивались в штаммы, экспрессирующие HSP-90::RFP в нейронах (AM987), в кишечнике (AM986) и в мышцах (AM988).

2. Использование репортеров о стрессе и датчиков протеостаза для мониторинга клеточного автономного и клеточного неавтономного протеостаза

ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга емкости ПН в конкретных тканях используйте тканеспецифические датчики протеостаза (такие как штаммы, экспрессирующие Q44 в кишечнике или Q35 в мышцах – см. Таблицу 3) и репортеры стресса (такие как термоиндуцируемый репортер hsp-70p::mCherry ; Таблица 3).

  1. Генетический скрещивание мутантного аллеля sid-1 (pk3321) в сенсорный штамм протеостаза и подтверждение присутствия sid-1 (pk3321) путем кормления РНК-интерференцией
    1. Генетически скрещивать штамм датчика протеостаза/репортера стресса в генетический фон мутантного штамма sid-1 (pk3321). Чтобы установить генетические скрещивания между различными трансгенными штаммами, пожалуйста, следуйте23 для получения подробного протокола.
      Примечание: мутанты sid-1(pk3321) устойчивы к скармливанию РНК-интерференции, и, следовательно, лечение эмбрионов РНК-интерференцией против основного гена (такого как elt-2 или hsp-90) приведет только к остановке развития или летальности личинок у штаммов гетерозиготного или дикого типа гена sid-1 .
    2. Пусть 10 гравидных гермафродитов откладывают яйца на пластинах РНК-интерференции против elt-2 или hsp-90 и контролируют (пустой вектор; EV) РНК-интерференционные пластины при 20 °C. Удалите матерей через 1 - 2 ч. Используйте N2 Bristol и мутанта sid-1(pk3321) в качестве контроля.
    3. Наблюдайте за развитием личинок на пластинах РНК-интерференции в течение следующих 2-3 дней. ЭЛТ-2 РНК-интерференция приводит к аресту личинок L1, в то время как РНК-интерференция hsp-90 приводит к аресту личинок L3 в N2 Бристоле. Мутанты sid-1 не будут затронуты лечением РНК-интерференцией и разовьются в взрослых особей.
      Примечание: Гомозигота C. elegans по sid-1 (pk3321) будет демонстрировать однородную популяцию, развивающуюся во взрослом возрасте. Гетерозиготы будут проявляться в смешанных популяциях некоторых животных, демонстрирующих остановку личинок, и некоторых животных, развивающихся во взрослых особей.
  2. Подтверждение наличия sid-1(pk3321) методом генотипирования
    1. Соберите 15-20 червей выбранного штамма-кандидата F2 в ПЦР-пробирку, содержащую 15 мкл буфера для лизиса червей (табл. 2).
    2. Поместите трубку при температуре -80 °C не менее чем на 10 минут или на ночь.
    3. Инкубируйте пробирку в ПЦР-аппарате по следующей программе:
    4. 65 °C в течение 60 мин (лизовый червь); 95 °C в течение 15 мин (инактивировать протеиназу К); держать при температуре 4 °C.
    5. Используйте 2 мкл лизата червя в качестве «матрицы» для проведения ПЦР-реакции для генотипирования, используя следующие праймеры для sid-1: sid-1 forw: 5'-agctgtacttgtattcg-3' и sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
    6. Используйте следующую программу для генотипирования ПЦР: 1 цикл при 95 °C в течение 3 мин; затем 30 циклов при температуре 95 °C в течение 10, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с; 1 цикл при 72 °C в течение 10 минут, держать при 4 °C.
    7. Очистите продукт ПЦР ~650.о. с помощью набора для очистки ПЦР (Таблица материалов) и секвенируйте продукт ПЦР sid-1 для идентификации мутации точки G-to-A аллеля sid-1 (pk3321). Альтернативно, точечная мутация G-to-A создает сайт рестрикции ApoI, который может быть использован на продукте ПЦР для генотипирования, как описано впункте 24.
  3. Использование iQ44::YFP в качестве датчика протеостаза для кишечника
    1. Синхронизируйте C. elegans , экспрессирующих Q44::YFP в кишечнике (штамм OG412) или перешедших на мутантный фон sid-1(pk3321) путем отбеливания, следуя протоколу, описанному впункте 25. Планшет синхронизировал личинки L1 с 9-сантиметровой нематодой-агаровой средой роста (NGM)-агаровой пластиной, содержащей бактерии OP50, и выращивали до стадии L4 при 20 °C.
    2. Соберите животных L4, смыв червей с тарелки с помощью 5 мл буфера M9. Перенесите буфер M9, содержащий червей L4, в пробирку объемом 15 мл с помощью стеклянной пипетки или пипетки из силиконизированного пластика и центрифугируйте при 1000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре, чтобы аккуратно гранулировать червей. Осторожно удалите надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы гранулы червя не были потревожены.
    3. Критический этап: Для переноса или удаления нематод используйте стеклянную пипетку или пластиковый наконечник для пипетки, обработанный силиконизирующим агентом (например, SigmaCote) в соответствии с инструкциями производителя. Это предотвращает прилипание червей к пластиковой поверхности наконечника для дозатора.
    4. Повторите шаг 2.3.2 еще три раза, чтобы смыть все бактерии OP50 с червей.
    5. Возьмите гранулу червя в 5 мл буфера M9 и подсчитайте количество червей, присутствующих в 10 μл.
    6. Планшет L4 животных на 6 см NGM агаровых планшетов, содержащих пустые векторные контрольные (EV) или hsp-90 RNAi бактерии с плотностью 10 червей на пластину (готовят 5 планшетов на временную точку и биологическую репликацию) и инкубируют в течение 24 -48 часов при 20 °C.
    7. Через 24 часа (=День 1 для взрослых) и 48 часов (=День 2 для взрослых) подсчитайте количество очагов Q44 в кишечнике нематод, демонстрирующих агрегаты. Наберите в общей сложности 30-50 нематод на одну биологическую реплику.

3. Тканеспецифический скрининг кандидатной РНК-интерференции на модификаторы клеточного неавтономного протеостаза

Примечание: Для скрининга тканеспецифической РНК-интерференции мы использовали штамм PVH172, позволяющий получать кишечно-специфичную РНК-интерференцию путем кормления РНК-интерференционных бактерий, и штамм PVH171, допускающий мышечно-специфическую РНК-интерференцию (генотип см. в таблице 1).

  1. Подготовка пластин-кандидатов на РНК-интерференцию
    1. Готовят агаровые пластины 6 см NGM с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, 12,5 мкг/мл тетрациклина и 1 мМ ИПТГ по стандартным методам25.
    2. Используйте библиотеку Ahringer RNAi для получения клонов-кандидатов РНК-интерференции для скрининга РНК-интерференции20.
    3. Инокулируйте 3 мл LB-амперной среды (50 мкг/мл ампициллина в LB-среде) в пробирку объемом 15 мл с помощью требуемого клонирования РНК-интерференции с помощью пластикового наконечника для дозатора. Выращивайте при 37 °C в течение ночи с перемешиванием.
    4. На следующий день добавьте изопропил-b-D-тиогалактопиранозид (IPTG) (из 1 М бульона) до конечной концентрации 1 мМ в бактериальной культуре на ночь.
    5. Перемешивайте культуры в течение еще 3 ч при 37 °C.
    6. Нанесите 300 мкл культуры бактериальной РНК-интерференции на агаровый планшет NGM диаметром 6 см с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, 12,5 мкг/мл тетрациклина и 1 мМ ИПТГ. Дайте плитам высохнуть на скамейке в течение 2 суток при комнатной температуре, накрыв алюминиевой фольгой для защиты от света. После высыхания пластины РНК-интерференции можно хранить в коробке при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  2. Синхронизация C. elegans и лечение РНК-интерференционными бактериями
    1. Чтобы синхронизировать штаммы червей, выберите 15 взрослых особей на пластинах РНК-интерференции и дайте отложить яйца в течение 1 ч. Затем выньте взрослых особей из тарелки.
    2. Критический шаг: В этом случае следует избегать синхронизации путем отбеливания, потому что это может вызвать репортера hsp-70p::RFP , так как это стрессовое состояние для C. elegans.
    3. Выберите синхронизированные личинки стадии L4 и перенесите их на свежую пластину РНК-интерференции.
    4. Позвольте нематодам расти на соответствующей РНК-интерференции в течение двух поколений, чтобы обеспечить эффективное поглощение дцРНК, обеспечивая поддержание температуры на уровне 20 °C.
    5. Для визуализации и количественного определения флуоресценции hsp-70p::RFP используйте день 1 для взрослых.
  3. Подготовка предметных стекол для микроскопа
    1. Приготовьте предметные стекла микроскопа, поместив ~250 μL 2% раствора агарозы (в буфере M9) на предметное стекло микроскопа и поместите второе предметное стекло сверху, чтобы получить плоский диск.
    2. Поместите 5 мкл 5 мл 5 мМ раствора левамизола (в буфере M9) на установленную агарозную подушечку и перенесите 5 взрослых червей Day 1 в каплю левамизола. Оставьте нематод парализовать на 5 минут.
    3. Как только C. elegans будет парализован, осторожно выровняйте его с помощью платиновой проволоки и удалите излишки левамизола с помощью лабораторной салфетки перед добавлением покровного стекла.
    4. Критический шаг: Обязательно сделайте снимки червей в течение 30 минут после подготовки предметного стекла микроскопа. Парализованные нематоды на предметном стекле микроскопа могут высыхать и лопаться, что может поставить под угрозу измерения флуоресценции.
  4. Настройки микроскопа и анализ изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения получаются с помощью конфокального микроскопа, оснащенного камерой EM-CCD и программным обеспечением для автоматизации микроскопических изображений и анализа изображений.
    1. Получение изображений с 10-кратным увеличением с помощью лазера с длиной волны 561 нм для возбуждения флуоресценции RFP. Убедитесь, что все изображения получены с использованием одинаковых настроек мощности лазера, размера точечного отверстия и усиления флуоресценции, чтобы можно было сравнивать.
    2. Сохраните все изображения в формате TIFF.
    3. Выполнение анализа изображений с помощью ImageJ. Измерьте интенсивность флуоресценции в каждом изображении в пикселях на единицу площади, вычитая фоновую флуоресценцию. Нормализуйте интенсивность флуоресценции для каждого изображения в соответствии с областью изображения, а также длину червей.
    4. Измерение средней интенсивности с помощью функции «Анализ» | Измерить в ImageJ. Нормализуйте полученное значение интенсивности по области изображения, разделив интенсивность на площадь.
    5. Чтобы нормализовать интенсивность по длине червя, измерьте червя, проведя линию вдоль длины червя в ImageJ и используя Analyze | Измерьте. Причина нормализации интенсивности флуоресценции в зависимости от длины червя заключается в том, что черви могут различаться по размеру, в зависимости от гена, который сбивается РНК-интерференцией, и это может повлиять на среднюю интенсивность.
    6. Нормализуйте измеренную интенсивность флуоресценции для необработанных контрольных значений (т.е. трансгенного C. elegans, выращенные на контрольных (EV) РНК-интерференцированных пластинах). Объедините нормализованные значения для сравнения средних интенсивностей флуоресценции для каждого условия РНК-интерференции. Стремитесь получить изображение 20 червей для каждой биологической реплики и соберите не менее 3 изображений биологических реплик.
    7. Вычислите P-значения средних значений интенсивности флуоресценции с помощью t-критерия Стьюдента и выполните коррекцию для множественного тестирования с использованием метода Бенджамини-Хохберга, используя коэффициент ложного обнаружения 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тканеспецифическая РНК-интерференция двумя способами: экспрессия шпилечных конструкций или тканеспецифическая комплементация SID-1
Экспрессия тканеспецифичных конструкций РНК-интерференции шпилек позволяет осуществлять конститутивный нокдаун гена на протяжении всего развития. Однако иногда это может быть непрактично, когда исследуемый ген необходим для органогенеза этой конкретной ткани, такой как elt-2 , который необходим для развития кишечника26. Тканеспецифическая э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанные здесь методы демонстрируют использование инструментов, которые позволяют тканеспецифичный нокдаун компонентов PN конститутивным и временным образом. Ранее мы идентифицировали TCS, клеточный неавтономный механизм реакции на стресс, который индуцируется тканеспецифичным изменением уровня экспрессии Hsp9010. Тканеспецифический нокдаун hsp-90 за счет экспрессии РНК-интерференции шпильки приводит к тому, что клетки неавтономно активируют экспрессию з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Ричарда И. Моримото за предоставление штамма AM722. Некоторые штаммы C. elegans, использованные в этом исследовании, были предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis, который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры NIH (P40 OD010440). P.v.O.-H. финансировался за счет грантов NC3Rs (NC/P001203/1) и премии Wellcome Trust Seed Award (200698/Z/16/Z). J.M. был поддержан партнерством MRC DiMeN по подготовке докторантов (MR/N013840/1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АмпициллинMerckA0166-5GПротокол Раздел 3.1.
ДНК Чистый и Концентратор-500Zymo ResearchD4031Протокол Раздел 2.2.
IPTG Изопропил-&бета;-D-тиогалактозидMerck367-93-1Протокол Раздел 3.1.
Комплект для клонирования многосайтового шлюзаThermo Fisher12537100Протокол Раздел 1.2.
SigmaCoteMerckSL2-25mLПротокол Раздел 2.3.
ТетрациклинMerckT7660-5GПротокол Раздел 3.1.
Набор для клонирования ПЦР Zero Blunt TOPOThermo FisherK280002Протокол Раздел 1.1.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 76, 91-99 (2011).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 421-435 (2019).
  3. Imanikia, S., Özbey, N. P., Krueger, C., Casanueva, M. O., Taylor, R. C. Neuronal XBP-1 Activates Intestinal Lysosomes to Improve Proteostasis in C. elegans. Current Biology. 29, 2322-2338 (2019).
  4. Berendzen, K. M., et al. Neuroendocrine Coordination of Mitochondrial Stress Signaling and Proteostasis. Cell. 166, 1553-1563 (2016).
  5. O'Brien, D., et al. A PQM-1-Mediated Response Triggers Transcellular Chaperone Signaling and Regulates Organismal Proteostasis. Cell Reports. 23, 3905-3919 (2018).
  6. Tatum, M. C., et al. Neuronal Serotonin Release Triggers the Heat Shock Response in C. elegans in the Absence of Temperature Increase. Current Biology. 25, 163-174 (2015).
  7. Miles, J., Scherz-Shouval, R., van Oosten-Hawle, P. Expanding the Organismal Proteostasis Network: Linking Systemic Stress Signaling with the Innate Immune Response. Trends in Biochemical Sciences. 44, 927-942 (2019).
  8. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 Is a Cell-Nonautonomous Regulator of Stress Resistance and Longevity. Cell. 153, 1435-1447 (2013).
  9. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  10. van Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of Organismal Proteostasis by Transcellular Chaperone Signaling. Cell. 153, 1366-1378 (2013).
  11. Frakes, A. E., et al. Four glial cells regulate ER stress resistance and longevity via neuropeptide signaling in C. elegans. Science. 367, 436-440 (2020).
  12. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  13. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  14. Hinas, A., Wright, A. J., Hunter, C. P. SID-5 is an endosome-associated protein required for efficient systemic RNAi in C. elegans. Current Biology. 22, 1938-1943 (2012).
  15. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
  16. McEwan, D. L., Weisman, A. S., Hunter, C. P. Uptake of extracellular double-stranded RNA by SID-2. Molecular Cell. 47, 746-754 (2012).
  17. Whangbo, J. S., Weisman, A. S., Chae, J., Hunter, C. P. SID-1 Domains Important for dsRNA Import in Caenorhabditis elegans. G3 GenesGenomesGenetics. 7, 3887-3899 (2017).
  18. Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. Science. 301, 1545-1547 (2003).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7, 554-559 (2010).
  20. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  21. Lee, Y. S., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods (San Diego CA). 30, 322-329 (2003).
  22. Evans, T. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  23. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  24. Lim, M. A., et al. Reduced Activity of AMP-Activated Protein Kinase Protects against Genetic Models of Motor Neuron Disease. Journal of Neuroscience. 32, 1123-1141 (2012).
  25. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  26. Hawkins, M. G., McGhee, J. D. elt-2, a second GATA factor from the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 270, 14666-14671 (1995).
  27. Bharadwaj, S., Ali, A., Ovsenek, N. Multiple components of the HSP90 chaperone complex function in regulation of heat shock factor 1 In vivo. Molecular and Cellular Biology. 19, 8033-8041 (1999).
  28. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9, 1003466(2013).
  29. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14914-14919 (2009).
  30. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 10417-10422 (2002).
  31. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine Proteins at the Pathogenic Threshold Display Neuron-Specific Aggregation in a Pan-Neuronal Caenorhabditis elegans Model. Journal of Neuroscience. 26, 7597-7606 (2006).
  32. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin Signaling and the Heat Shock Response Modulate Protein Homeostasis in the Caenorhabditis elegans Intestine during Infection. Journal of Biological Chemistry. 283, 194-201 (2008).
  33. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. , e52321(2015).
  34. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400, 166-173 (2007).
  35. Zou, L., et al. Construction of a germline-specific RNAi tool in C. elegans. Scientific Reports. 9, 1-10 (2019).
  36. Silva-García, C. G., et al. Single-Copy Knock-In Loci for Defined Gene Expression in Caenorhabditis elegans. G3 Bethesda Md. 9, 2195-2198 (2019).
  37. Chang, J. T., Kumsta, C., Hellman, A. B., Adams, L. M., Hansen, M. Spatiotemporal regulation of autophagy during Caenorhabditis elegans aging. eLife. 6, 18459(2017).
  38. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7, 473-478 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи