Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование подвижности жгутиков у кишечной палочки путем применения трех установленных методов в серии

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61364

⸱

10 мая 2020 г.

 , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

В этой статье

Краткое содержание

Многие бактерии используют подвижность, управляемую жгутиками, чтобы ориентироваться в окружающей среде и колонизировать благоприятное окружение как индивидуально, так и коллективно. Здесь показано использование трех установленных методов, которые используют подвижность в качестве инструмента выбора для выявления компонентов / путей, способствующих плаванию и роевой подвижности.

Аннотация

Подвижность имеет решающее значение для выживания и успеха многих видов бактерий. Существует множество методологий для использования подвижности для понимания сигнальных путей, выяснения функции и сборки жгутиков, а также для изучения и понимания моделей движения. Здесь мы демонстрируем сочетание трех из этих методологий. Подвижность в мягком агарове является самой старой, предлагая сильный отбор для выделения мутаций супрессора усиления функции у штаммов с нарушениями подвижности, где подвижность восстанавливается с помощью второй мутации. Метод клеточного троса, впервые использованный для демонстрации вращательной природы жгутикового двигателя, может быть использован для оценки влияния сигнальных эффекторов на скорость двигателя и его способность переключать направление вращения. Анализ «пересечения границы» является более недавним, где плавающие бактерии могут быть подготовлены к переходу в коллективное движение в качестве роя. В сочетании эти протоколы представляют собой систематический и мощный подход к выявлению компонентов механизмов подвижности и характеристике их роли в различных аспектах плавания и роения. Они могут быть легко адаптированы для изучения подвижности у других видов бактерий.

Введение

Бактерии используют множество придатков для перемещения и рассеивания в своих экологических нишах1. Подвижность, управляемая жгутителями, является самой быстрой из них, способствуя колонизации благоприятных мест в ответ на сигналы окружающей среды и внося значительный вклад в патогенную способность некоторых видов2,3. Жгутиковые бактерии могут плавать индивидуально в объемной жидкости или роиться как коллектив над полутвердой поверхностью4. Внеклеточные жгутики прикрепляются и приводятся в движение роторными двигателями, встроенными в мембрану, которые используют мощность ионных градиентов для создания крутящегомомента,который вызывает вращение1,2,4,5,6,7,8. В E. coli,чьи двигатели работают с постоянным крутящим моментом9,мощность двигателя может быть классифицирована с точки зрения скорости вращения и переключения ротора между направлениями против часовой стрелки (CCW) и по часовой стрелке (CW). Вращение КНО способствует образованию когерентного жгутикового пучка, который продвигает ячейку вперед (бег), в то время как переходный переключатель в направлении вращения (CW) заставляет пучок разбираться частично или полностьюна 10,а клетка переориентировать свое направление плавания (кувыркаться). Кишечно-кишечное кишечное правило бегает в течение секунды и кувыркается в течение десятой доли секунды. Частота переключения ротора или «кувыркающееся смещение» контролируется сигнальной системой хемотаксиса, в которой трансмембранные хеморецепторы обнаруживают внешние химические сигналы и передают их через фосфорелай жгутиковый двигатель для продления пробегов в ответ на аттрактанты или подавления их в ответ на токсичные химические вещества11,12. Подвижность плавания анализируется в 0,3% мягкого агара.

Во время роения бактерии перемещаются по полутвердой поверхности в виде плотного коллектива, где стаи бактерий текут в непрерывном вихревом движении2,13,14,15. Рои E. coli демонстрируют измененную хемосенсорную физиологию (более низкое смещение падения), более высокие скорости и более высокую толерантность к противомикробным препаратам над клетками, плавающими в объемной жидкости16,17. Рои различаются в своем развертывании множества стратегий, которые помогают движению, включая производство поверхностно-активных добавок, гиперфлагелляцию и удлинение клеток2. Роение дает бактериям конкурентное преимущество как в экологических, так и в клинических условиях18,19,20. Существует две категории роящихся бактерий: умеренные рои, которые могут роиться только на средах, затвердевшие с 0,5-0,8% агара, и надежные рои, которые могут перемещаться по более высоким концентрациям агара21.

Существует множество анализов, чтобы исследовать подвижность плавания и ее регулирование. При нарушении мутаций или условий окружающей среды подвижность сама по себе предлагает сильный выбор для выявления мутаций-супрессоров усиления функции. Эти супрессоры могут быть подлинными ревертантами исходной мутации или псевдо-ревертантами, где вторая мутация восстанавливает функциональность. Такие мутанты могут быть идентифицированы путем секвенирования всего генома (WGS). Альтернативой непредвзятому выбору супрессора является предвзятая стратегия целенаправленного мутагенеза (например, мутагенез ПЦР). Эти методологии часто проливает свет на функцию или экологическую регуляцию аппарата моторики. Если цель состоит в том, чтобы изучить двигательную функцию, то восстановление подвижности дикого типа, измеренное в мягком агари, не обязательно может указывать на восстановление двигательной мощности дикого типа. Анализ клеточного привязки, в котором клетки прикрепляются к стеклянной поверхности одним жгутиком и впоследствии контролируется вращение тела клетки, может быть начальным анализом выбора для оценки двигательного поведения. Хотя в настоящее время доступны более сложные методологии для мониторинга свойств двигателя, требуемая высокоскоростная настройка камер и применение пакетов программного обеспечения для анализа движения ограничивают их широкое использование22,23,24,25. Анализ клеточного привязки требует только, чтобы жгутики были сстрижены, что позволяет прикрепить короткие нити к стеклянному слайду с последующей видеозаписью вращения тела клетки. Хотя зарегистрированные скорости двигателя низки в этом анализе из-за высокой нагрузки, которую тело клетки оказывает на жгутик, этот анализ, тем не менее, способствовал ценному пониманию хемотаксических реакций26,27,28,29и остается действительным инструментом исследования, как обсуждается ниже.

Роевая подвижность ставит перед исследователями другой набор проблем. Выбор супрессоров усиления функции работает только в роях, которые производят обильные поверхностно-активные вещества и роя легко13. Поверхностно-активные непроизводители, такие как E. coli, привередливы в отношении выбора агара, состава среды и влажности окружающей среды2,13,14,21. После того, как условия роения установлены, анализ пересечения границы17 является полезной методологией для опроса о способности роя ориентироваться в новых/суровых условиях. Хотя протоколы, представленные ниже, относятся к E. coli,они могут быть легко адаптированы для применения у других видов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выделение мутантов-супрессоров в штаммах с дефицитом подвижности

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод в качестве широкого «универсального» для определения общего характера дефекта моторики.

  1. Приготовление мягких агаровых пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий агар, также называемый моторильно-или плавательным агарем, представляет собой агар низкого процента (~0,2-0,35% мас./об.), долгое время используемый для анализа хемотаксиса31,32.
    1. Добавьте 3 г бактоагара (0,3% мас./об.) и 20 г LB в колбу с круглым дном 2 л. Добавьте в колбу 1 л ddH2O (двойная дистиллированная вода) и равномерно перемешайте суспензию с помощью стержня перемешивания и магнитной перемешивающей пластины.
    2. Автоклав в течение 20 мин при 121 °C.
    3. Дайте остыть с мягким перемешиванием, используя стержень / пластину, как указано выше. Когда температура достигнет приблизительно 50 °C, налейте 25 мл в стерильные чашки Петри (100 мм х 15 мм) и дайте расплавленной агаровой крышке на место в течение не менее 1 ч для использования в течение 16 ч.
  2. Подготовка культуры, посев и выделение мутантов-супрессоров
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечная палочка, привитая в центре богатых питательными веществами сред, затвердеющих с мягким агару, потребляет питательные вещества локально, создавая градиент питательных веществ, за которым они следуют. По мере того, как они движутся наружу, появляются определенные «кольца»(рисунок 1A),которые связаны с конкретными химиоатрактантами, на которые реагируют бактерии. Дефекты либо в системе хемотаксиса, либо в структурных компонентах жгутикового двигателя могут поставить под угрозу производительность этого анализа. Часто мутанты с преимуществом подвижности возникают во время скрининга, и их можно увидеть выходящими из одиночных или из нескольких точек по периферии кольца, откуда они «вспыхивают»(рисунок 1С). Можно заметить, что самый внешний край плавательного фронта легко контрастирует с неколонизированным девственным мягким агаром.
    1. Выращивать в течение ночи культуры желаемого штамма с дефицитом подвижности в 5 мл бульона Леннокса (LB; 10 г / л триптона, 5 г / л дрожжевого экстракта и 5 г / л NaCl, таблица материалов)при 30 °C с горизонтальным встряхиванием (220 р.п.m.). На следующий день субкультуру (1:100 разведения) в свежем LB, растущую в тех же условиях до экспоненциальной фазы (OD600 0,6).
    2. Инокулируйте 6 мкл культуры в центр пластины мягкого агара (1.1) с помощью пипетки, проталкивая нагруженный стерильный наконечник в агар, чтобы мягко вытеснить содержимое. Перенос до 30 °C и инкубирование(рисунок 1B)до тех пор, пока не будут очевидны «вспышки» подвижности, исходящие из точки прививки или периферии колец подвижности, обычно через 24-36 ч(рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализах подвижности инокулируют штамм дикого типа вместе с мутантными изолятами для сравнения. Этот штамм дикого типа покажет характерные концентрические хемотактические кольца(рисунок 1А)и заполнит пластину в течение 8-10 ч.
    3. Используйте стерильную проволочную петлю, чтобы поднять клетки из области «вспышки» и процедить для очистки отдельных колоний на жесткой агаревой пластине LB (LB, приготовленный, как указано выше, затвердеть с 15 г / л бакто-агара).
    4. Выберите одиночные колонии из пластины полосы, используя стерильную проволочную петлю, и повторно очистите, расклеивая отдельные колонии, чтобы обеспечить изоляцию «чистого» изоляционного изолята колонии.
  3. Подтверждение и характеристика мутантов-супрессоров
    1. Подтвердите, что изолированные мутанты-супрессоры восстановили подвижность. Подготовьте мягкие агагаровые пластины (1.1) и культуры для интересующих штаммов (как в 1.2.1), включая штамм дикого типа и стартовый штамм с дефицитом подвижности для сравнения.
    2. Инокулируют пластины (как в 1.2.2) и инкубируют при 30 °С в течение 8-10 ч.
    3. Запишите диаметр самого внешнего кольца (края круга) и сравните, чтобы установить, какой из изолятов существенно восстановил подвижность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется фотографировать пластины на протяжении всего времени эксперимента. Для достижения наилучших результатов используют устройство30«ведро света», где над источником света установлена цифровая камера для лучшего освещения, чтобы измерить диаметр плавательной колонии и отличить ее от неколонизированного агара.
    4. Субъект проверяет изоляты в WGS по мере необходимости, что позволяет обеспечить достаточный «охват последовательности» для положительной идентификации мутаций, которые восстановили функцию дикого типа.

2. Количественная оценка двигательного поведения жгутиков с помощью клеточного троса

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод, когда нормальное поведение при падении (хемотаксис) кажется скомпрометированным.

  1. Приготовление культуры и стригущий жгутики
    1. Подготовьте экспоненциальную фазовую культуру интересующего штамма, как описано на этапе 1.2.1.
    2. Гранула 10 мл клеток центрифугированием при 2000 х г в течение 3 мин перед повторным суспендированием в 10 мл фильтруемого стерилизованного буфера подвижности (МБ; 10 мМ буфера фосфата калия [0,0935 М К2HPO4,0,0065 М KH2PO4,рН 7,0], 0,1 мМ ЭДТА [рН 7,0], 10 мМ NaCl, 75 мМ KCl).
      ПРИМЕЧАНИЕ: MB поддерживает подвижность, но не поддерживает рост бактерий
    3. Повторите шаг 2.1.2 еще два раза, прежде чем повторно использовать конечную гранулу в 1 мл МБ.
    4. Переложите клеточную суспензию в шприц 1 мл и прикрепите к концу иглу 23G. Соберите идентичный шприц/игольчатый аппарат и прикрепите их вместе через 6 дюймов полиэтиленовой трубки (внутренний диаметр 0,58 мм), плотно обтянутой над каждым наконечником иглы.
    5. Срежь жгутики (они хрупкие и легко ломаются), осторожно передавая клеточную подвеску вперед и назад от одного шприца к другому 50x, с 1-минутными паузами между каждыми 10 проходами.
    6. Центрифугируют срезанные ячейки при 2000 х г в течение 3 мин и повторно суспендируют в конечном объеме 500 мкл МБ.
  2. Подготовка слайдов и клеточный трос
    1. Подготовьте камеру фиксации клеток, укладывая крышку 18 мм x 18 мм на стеклянный слайд микроскопа 3 дюйма x 1 дюйм x 1 мм, разделенный двусторонней лентой(рисунок S1).
    2. Промывайте камеру 0,01% (мас./об.) раствором полилизина, прикладывая к верхней части камеры. Наклоните нижний край (крышка вровень с замыкание с замыкание с загузкой микроскопа) на стеклоочиститель (папиросную бумагу), чтобы помочь провести раствор через камеру(рисунок S1). Затем инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. Промыть камеру три раза с 40 мкл МБ, используя, как описано в шаге 2.2.2
    4. Добавьте 40 мкл суспензии со среженной клетки (подготовленной выше) в верхнюю часть камеры и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы ячейки могли прикрепиться к крышке.
    5. Осторожно промывайте камеру 40 мкл МБ, как в 2.2.3, чтобы удалить неприкрепленные ячейки.
  3. Регистрация и количественная оценка вращения клеток
    1. Перенесите слайд микроскопа, загруженный привязанными клетками, на ступень микроскопа.
    2. Используя фазоконтрастную микроскопию и 100-кратный объектив, сканируйте популяцию на наличие клеток, которые зафиксированы на месте и вращаются по одной оси, то есть плавное вращение в фиксированной точке, а не под углом, под которым клетка движется в фокус и выходит из него(Видео 1).
    3. Используйте коммерческий микроскоп и связанную с ним камеру. Откройте соответствующее программное обеспечение, убедитесь, что интересующе ячейки находятся в фокусе, и нажмите «Получение видео», чтобы записать вращение ячейки в течение одной минуты (со скоростью 10 кадров в секунду или выше).
    4. При воспроизведении видео количественно оцените количество полных оборотов в минуту и количество раз, когда ячейка меняет направление (частоту переключения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорости вращения и частота переключения могут быть слишком быстрыми, чтобы их можно было измерить на глаз, поэтому рекомендуется использовать программное обеспечение для видео, которое предлагает медленное / тонкое воспроизведение, или использует автоматизированную программную систему для количественной оценки паттерноввращения 33. Альтернативой может быть увеличение вязкости МБ с использованием метилцеллюлозы (или аналогичного агента), чтобы помочь замедлить и разрешить вращение более быстрых бактерий или компенсировать использование камер с низкой частотой кадров.
    5. Повторите шаг 2.3.2 с биологическими репликами для составления представления интересуемой популяции.

3. Подготовка роев в пограничном анализе

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод для оценки влияния мутации или состояния на групповую подвижность. Роевой агар относится к агару, где процент обычно выше, чем у мягкого агара. В мягком агари (0,3 %) клетки плавают индивидуально внутри агарова. В роевом агаре (0,5% и выше) клетки движутся группой по поверхности. В то время как роевые пластины должны использоваться, как подробно описано здесь, плавательные пластины имеют более длительный срок хранения и могут использоваться в течение нескольких дней. Мы лично предпочитаем использовать через 1-2 дня.

  1. Приготовление роевого агара
    1. Добавьте 5 г агара Эйкена (0,5% мас./об.) и 20 г LB в колбу с круглым дном 2 л. Добавьте в колбу 1 л ddH2O и равномерно перемешайте суспензию с помощью стержня перемешивания и магнитной перемешивающей пластины.
    2. Автоклав в течение 20 мин при 121 °C.
    3. Дайте остыть с мягким перемешиванием, чтобы избежать пузырьков воздуха с помощью стержня / пластины, как указано выше. При приблизительно 50 °C добавляют стерилизованную фильтром глюкозу для конечной концентрации 0,5 %.
    4. В стерильные чашки Петри насыпать 25 мл (100 мм х 15 мм) и дать установить комнатную температуру не менее 14 ч и не более 20 ч. Не храните для будущего использования.
  2. Инокуляция и инкубация роевых пластин
    1. Инокулируют 6 мкл средне экспоненциальной культуры (приготовленной как в 1,2) путем пятнистости поверх агара.
    2. Оставьте крышку на 5-10 минут и замените, когда инокулят высохнет на поверхности агара.
    3. Инкубировать при 30 °C в течение 8 ч. Избегайте соблазна осмотреть прогресс роя, сняв крышку, так как это будет способствовать высыханию агара и ухудшит роение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться в зависимости от фенотипа штамма. Некоторые изолированные мутации могут препятствовать роевой способности и потребуют снижения процента агара или более длительного периода инкубации.
  3. Подготовка пробирных листов для пересечения границ
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе используется модифицированная чашка Петри, где пластиковое деление (граница) создает две камеры, а не одну(рисунок 2A). Каждая камера может быть подготовлена независимо от другой, предлагая различные условия для роения, прежде чем «соединить» их. В зависимости от экспериментальной конструкции, первая камера (обозначенная левой) может быть приготовлена либо с плавательным агаром (0,3% мас./об.), либо с роевым агаром (0,5% мас./об.), откуда бактерии могут мигрировать через границу в правую камеру, содержащую роевой агар +/- любую необходимую добавку или вызов (например, антибиотики). Миграцию на любом агарове обычно измеряют/сравнивают путем регистрации самого широкого диаметра бактериальной колонизации (от края до края) от исходной точки инокуляции.
    1. При необходимости приготовьте плавательный агар, как описано в 1.1.
    2. Приготовьте роевой агар, как описано в 3.1.
    3. Налейте ~30 мл роевого агара (с желаемым дополнением, если требуется) в правую камеру двухкамерной чашки Петри (100 мм х 15 мм), до такой степени, что она находится на одном уровне с пластиковым разделителем между камерами, но не переливается в левую(рисунок 2B).
    4. После того, как агар затвердеет, заполните левую камеру ~30 мл плавательного или роевого агара, снова до точки соприкосновения с пластиковым водоразделом(рисунок 2С). Перед тем, как он схлестнет, используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы осторожно перетащить агар через границу, чтобы соединить две стороны с помощью агарового моста высотой ~ 1 мм, который охватывает всю длину водораздела(рисунок 2D).
    5. Дайте пластине высохнуть при комнатной температуре (3,1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный метод создания моста заключается в том, чтобы дать агару левой камеры высохнуть, а затем медленно пипетку ~100 мкл расплавленного роевого агара вдоль пластикового разделителя для моста двух камер (3.4). Инокулируют пластины в левой камере, как описано выше, для плавания (1.2.2) или роя (3.2) агара перед инкубацией при 30 °C в течение 12-16 ч или до тех пор, пока рои не достигнут достаточного прогресса над правой камерой, чтобы можно было сравнивать интересующие штаммы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение псевдо-ревертантов в штамме E. coli, подвижность которого нарушается высокими уровнями сигнальной молекулы c-di-GMP, была подробно описана в недавней работе нашей лаборатории34. Этот штамм (JP1442) содержит две мутации: ΔyhjH и ΔycgR. YhjH является наиболее активной фосфодиэстеразой, которая разлагает c-di-GMP в E. coli. Отсутствие YhjH приводит к повышению уровня c-di-GMP и угнетению моторики. YcgR является c-di-GMP эффектором. В комплексе с c-di-GMP ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Выделение и характеристика мутаций супрессоров успешно способствовали выявлению ключевых компонентов системы хемотаксиса35,36,37,а также самого моторного механизма38,39,40. При использовании Протокола 1 важно включить несколько независимых реплик, чтобы обеспечить выделение большого спектра возможных мутаций, которые могли бы компенсиро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения GM118085 и частично Фондом Роберта Уэлча (грант F-1811 R.M.H.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты
Бакто обезвоженный агарFisher ScientificDF0140-15-4
ЭДТА Динатриевая соль, дигидратFisher Scientific02-002-786
Эйкен агар EikenChemical Co. ЯпонияE-MJ00Незаменимый для роения кишечной палочки
Глюкоза D (+)Fisher Scientific
LB (Lennox) БульонFisher ScientificBP1427-500
Раствор поли-L-лизина (0,1%)Sigma-AldrichP8920
Хлорид калия (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Одноосновной фосфат калия (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Двухосновной фосфат калия (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materials and Equipment
Программное обеспечение для визуализации микроскопа CellSense (V. 1.6)OlympusИли аналогичное программное обеспечение для используемого микроскопа
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided TapeFisher50-285-28
Предметные стекла для микроскопа матовые 3x1x1 ммFisher12-550-343
Olympus BX53 Микроскоп OlympusBX53Можно использовать любой вертикальный или инвертированный фазовый микроскоп
Чашки Петри (диаметр 100 мм)FB0875712Fisher ScientificДля анализов мягкого агара
Полиэтиленовый небулайзер Капиллярная трубка (0,58 мм x 99 мм 3,0 м)Perkin Elmer
Круглая чашка Петри с 2 отделениямиVWR89200-944Для анализа при пересечении границы
Безопасные иглы для подкожных инъекций (23G)Fisher Scientific14-826A
Стерильный шприц - 1 млFisher Scientific14-955-450
Task/Tissue салфеткиFisher scientific06-666Или эквивалентные одноразовые салфетки
VWR микропокровное стекло 18x18 ммVWR48366205
камера XM10 OlympusXM10или аналогичная камера для микроскопа
410955000Научный 9908265

Ссылки

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396(2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644(2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143(2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329(2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338(2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Исследование подвижности жгутиков у кишечной палочки путем применения трех установленных методов в серии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.