Методическая статья

Live-Cell Forward генетический подход к выявлению и изоляции развития мутантов в Chlamydia trachomatis

DOI:

10.3791/61365

⸱

10 июня 2020 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует флуоресцентные промоутер-репортеры, живая микроскопия клеток, и индивидуальное включение экстракции в направленном вперед генетический подход для выявления и изоляции развития мутантов Chlamydia trachomatis.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутриклеточный бактериальный патоген Chlamydia trachomatis проходит цикл развития, состоящий из двух морфологически дискретных форм развития. Невоспроизводимое элементарное тело (EB) инициирует заражение хозяина. Оказавшись внутри, EB дифференцирует в тело срешы (RB). ЗАТЕМ RB проходит несколько раундов репликации, прежде чем дифференцировать обратно в инфекционную форму EB. Этот цикл имеет важное значение для выживания хламидий, так как неспособность переключаться между типами клеток предотвращает вторжение или репликацию хозяина.

Ограничения в генетических методах из-за обязательного внутриклеточного характера хламидиоза препятствовали идентификации молекулярных механизмов, участвующих в развитии клеточного типа. Мы разработали новую двойную систему плазмидного промоутера-репортера, которая в сочетании с 7-клеточной микроскопией позволяет осуществлять визуализацию переключения типа клеток в режиме реального времени. Для выявления генов, участвующих в регуляции развития клеточного типа, живая система промоутера-репортера была использована для развития передового генетического подхода путем объединения химического мутагенеза двойного штамма репортера, визуализации и отслеживания хламидиоза с измененной кинетикой развития, за которой последовала клональная изоляция мутантов. Этот передний генетический рабочий процесс является гибким инструментом, который может быть изменен для направленного допроса в широкий спектр генетических путей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlamydia trachomatis (Ctr) является обязательным внутриклеточным патогеном, который прогрессирует через двухфазный цикл развития, который необходим для его выживания и распространения1. Этот цикл состоит из двух форм развития, элементарного тела (EB) и тела сгностика (RB). EB является репликация некомпетентным, но посредни в средствах клеточного вторжения через эффектор индуцированного эндоцитоза2. Оказавшись в хосте, EB созревает до репликационого RB. РБ проводит несколько раундов репликации до преобразования обратно в EB для того, чтобы инициировать последующие раунды инфекции.

Ограниченный спектр генетических инструментов ограничил большинство хламидийных исследований биохимическими исследованиями или использованием суррогатных систем. Как следствие, выяснение регуляции генов и контроля цикла развития было трудно3,4. Одной из наиболее важных проблем в хламидийной области является временное отслеживание хламидийного цикла развития с высоким разрешением и выявление белков, участвующих в его регулировании. Выражение гена во время цикла развития хламидий традиционно выполняется разрушительными методами «конечной точки», включая RNAseq, qPCR и фиксированную клеточную микроскопию5,,6. Хотя эти методы предоставили бесценную информацию, используемые методы являются трудоемкими и имеют низкое временное разрешение5,6.

В течение последнего десятилетия, генетические манипуляции Ctr прогрессировала с введением плазмидной трансформации и методы для мутагенеза7,8,9. Для этого исследования была разработана плазмидная система для мониторинга развития хламидий в отдельных включениях в режиме реального времени в течение инфекции. Хламидиальный трансформант был создан, что выразил как РБ и EB ячейки типа конкретных промоутер-репортер. RB конкретных репортер был построен путем слияния промоутер раннего гена РБ euo вверх по течению флуоресцентного белка клевера. EUO является транскрипционного регулятора, который подавляет подмножество поздних ЕБ связанных генов10. Промоутер hctB, который кодирует гистоноподобный белок, участвующий в конденсации Э.Б. нуклеоида, был клонирован непосредственно вверх по течению mKate2 (RFP) для создания специального репортераEB 11. Основой для hctBвыпускного-mKate2/euoprom-Clover был p2TK2SW27. Промоутеры HCTB и euo были усилены геномной ДНК Ctr-L2. Каждая последовательность промоутеров состояла из 100 базовых пар вверх по течению от прогнозируемого места начала транскрипции для указанного хламидиального гена плюс первые 30 нуклеотида (10 аминокислот) соответствующего ORF. Флуоресцентные варианты FP были коммерчески получены как Ctr codon оптимизированные блокы гена и клонированы в кадре с первыми 30 нуклеотидами каждого хламидиального гена и промотора. Терминатор incD был клонирован непосредственно вниз по течению от mKate2. Второй промоутер-репортер был вставлен вниз по течению от incD терминатора. Ген резистентности ампициллина(bla)в p2TK2SW2 был заменен геном аада (Сопротивление Spectinomycin) от pBam4. Это привело к окончательной конструкции p2TK2-hctBвыпускного вечера-mKate2/euoprom-Clover(рисунок 1A),которая была преобразована в Ctr-L27. Это РБ / EB репортер штамм позволил для наблюдения цикла развития в рамках одного включения с использованием живоклеточной микроскопии (Рисунок 1B,C).

Используя наш промоутер-репортер построить в сочетании с химическим мутагенезом, протокол был разработан для отслеживания и изоляции отдельных клонов, которые выставлены отклонения развития от мутагенизированных популяций Ctr serovar L2. Этот протокол позволяет осуществлять прямой мониторинг отдельных хламидийных включений, отслеживать профили экспрессии генов с течением времени, выявлять хламидидиальные клоны, выражаюющие измененную модель экспрессии генов развития, и клональную изоляцию хламидиоза от отдельных включений.

Хотя этот протокол был создан специально для выявления генов, участвующих в развитии хламидий, он может быть легко адаптирован для допроса любого количества хламидийных генетических путей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все скрипты Python, используемые в этом протоколе, доступны на Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Мутагениз Репортер Хламидиоз

ПРИМЕЧАНИЕ: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs были непосредственно мутагенизованы с использованием этилового метана (EMS) в axenic media CIP-1, поскольку это средство поддерживает обмен EB и поддержание инфекционной способностиЕБ 12.

  1. Оттепель хламидиальный запас на льду, содержащий 3 х 107 EBs преобразованы с p2TK2-hctBвыпускного вечера-mKate2/euoprom-Clover репортер плазмид и гранулы на йgt;14,000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хламидиоз организмов, используемых для этих экспериментов были 30% плотности ренографина очищены и заморожены при -80 градусов в 1x сахарозы-фосфат-глютамат буфер (SPG).
  2. Отбросьте супернатант и переотверните гранулы EB в 100 мл буфера CIP-1 с звуковой на льду при 10% мощности в течение 10 с. Разделите 100 МЛ eb подвески на два 50 l aliquots для мутагенизированных и макет обработанных образцов.
  3. Приготовьте 20 мг/мл раствора EMS-CIP-1 в отдельной трубке микроцентрифуги 1,5 мл. Для этого добавьте 6,8 МЛ EMS в общем объеме 375 МЛ.
  4. Добавьте 50 МЛ раствора EMS-CIP-1 в один из хламидиальных аликоктов для мутагенеза и 50 МЛ CIP-1 только к другому хламидиаю аликоту для макета мутагенеза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация EMS составляет 10 мг/мл. Хламидиальный титр, концентрация EMS и время воздействия, используемое в этом протоколе, приводят примерно к 60-80% снижению инфекционного потомства. Этот уровень сокращения соответствует 5-20 поражениям ДНК на хламидийный геном8.
  5. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре. Мутагенизированные ЭБ будут использоваться непосредственно для заражения монослой в разделе 2.
    ВНИМАНИЕ: EMS является известным канцерогеном. Все оборудование и материалы, которые вступают в контакт с EMS должны быть пропитаны в 1 M NaOH за 24 ч до удаления, перчатки должны быть использованы в любое время во время протокола и очистки материалов EMS.

2. Изображение мутанта Ctr

  1. Культура клеток-хозяев для визуализации и изоляции мутагенизированного Ctr
    1. Семя 6 хорошо стекла нижней пластины с 6 х 105 Cos-7 клеток (ATCC) на хорошо в 2 мл полного носителя (RPMI-1640 дополнен 10% плода бычьей сыворотки и 10 мг / мЛ гентамицин). Используйте эту стеклянную нижнюю пластину для изображения мутагенизированной Ctr.
    2. Семя 24 хорошо полистирол пластины с 1 х 105 Cos-7 клетки (ATCC) на хорошо в 1 мл полной связи. Используйте эту полистирол пластины для повторного заражения изолированных хламидиоз интересов.
    3. Инкубировать обе пластины при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию примерно на 18 ч. Как только клетки достигают слияния, замените средства массовой информации полными носителями, дополненными 1 мкг/мл циклохексимида и инкубировать в одночасье.
  2. Заражение культуры ячейки хозяина мутагенизированным Ctr
    1. Заразить 5 колодцев стеклянной нижней пластины с 6 х 105 мутагенизированных EBs в 1,5 м/хорошо ледяной HBSS. Это приведет к МВД в размере 0,3, как 70% смертности, как ожидается, из-за мутагенеза.
    2. Заразите оставшуюся скважину с помощью макета mutagenized EBs 2х 10 5 в 1,5 м/хорошо ледяной HBSS. Без мутагенеза, ожидать меньше смертности, таким образом, одна треть инокулум используется для достижения МВД в размере 0,3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MOI 0,3 гарантирует, что клетки-хозяина инфицированы одним ЕБ и позволяет достаточное разделение между инфицированными клетками для клональной изоляции.
    3. Обузуте пластину в течение 15 мин, с качалкой, при 37 градусов по Цельсию.
    4. Вымойте инфицированные клетки-хозяина с предварительно нагревается (37 кк/ С) HBSS, содержащих 1 мг / мЛ гепарин следуют сразу же HBSS полоскания. Повторите промывание гепарина, немедленно промыть 2x с HBSS, чтобы обеспечить гепарин удаляется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гепарин ингибирует и может обратить вспять ранние электростатические взаимодействия между клеткой-хозяином и EBs13. Гепарин моет удалить ЭБ, которые еще не вошли в клетки-хозяина, синхронизации инфекции. При стирке клетки делают это осторожно, чтобы предотвратить вытеснение клеток с поверхности колодцев. HBSS и гепарин решения содержат остаточные EMS и должны быть помещены в стакан, содержащий 1 M NaOH на 24 ч до удаления.
    5. Замените HBSS с 4 мл/хорошо предварительно обтеплученных (37 градусов по Цельсию) средств массовой информации (полный медиа, 1 мкг/мл циклохексимид, 20 мМ HEPES и не фенол красный).
    6. Заполните межплеоченные пространства с предварительно нагревается (37 градусов по Цельсию) deionized H2O, чтобы помочь в контроле температуры и уменьшить испарение. Инкубировать пластину при 37 кк инкубатор с 5% CO2 на 10 ч.
  3. Настройка микроскопа и визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многоцветная многопозиционная автоматизированная флуоресцентная визуализация живых клеток используется для сбора временных изображений для выявления хламидийных мутантов, которые отличаются в динамике экспрессии гена развития. В этом протоколе используется пакет программного обеспечения с открытым исходным кодом «Manager» для автоматизированного управления микроскопом14.
    1. Начните установку микроскопа 10 ч после инфекции. Установите микроскоп этап инкубатора до 5% CO2, 37 градусов по Цельсию. Поместите зараженную 6 скважин стекла нижней пластины в стадию инкубатора и вставьте образец термистора в interwell H2O.
    2. Калибровать этап XY с помощью плагина High Content Screening(HCS). Нажмите Плагины Инструменты приобретения Генератор сайта HCS в программном обеспечении для управления микроскопом «Manager»(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
    3. Выберите шаблон 6-хорошо пластины и создайте список позиций изображений, состоящий из 12 полей зрения (FOV) на скважину в плагине HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Откройте список позиций stage и вручную сосредоточьтесь и установите исходное положение для каждого FOV с помощью плагина Stage Control(JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Отрегулируйте координаты XY любого FOV, который имеет недостающие клетки или не содержит единого монослойного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за времени, которое требуется для каждого изображения, чтобы быть захвачены, максимальное количество 72 FOV может быть принято в 30 мин интервал.
    4. Используйте 20-х объектив для визуализации. Это увеличение позволяет изображениям 8 включений в FOV, обеспечивая при этом желаемое разрешение.
    5. Сохранить список позиций, как это будет использоваться для поиска включений, представляющих интерес после анализа данных(JoVE61365_screenfile7).
    6. Используйте опцию Auto Focus в программном обеспечении для визуализации, чтобы установить фокус для автоматизированной визуализации(JoVE61365_screenfile8).
    7. Используйте следующие выделения и значения для получения наиболее согласованных результатов фокусировки с помощью автофокуса на основе изображений в «Manager». В окне свойств Autofocus выберите OughtaFocus из высадивого меню и используйте следующие настройки. OughtaFocus-SearchRange_м: 350, OughtaFocus-Tolerance_м: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff (%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff (%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Да, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшение окна автоматического фокусировки изображения за счет уменьшения фактора урожая позволяет более последовательной автоматической фокусировки. Выбор Yes для OughtaFocus-ShowImages позволяет пользователю просматривать изображение автофокуса.
    8. Захват кинетики цикла развития путем изображения в течение 24 ч с интервалами времени 30 мин(JoVE61365_screenfile9). Изображение между 12-36 HPI гарантирует, что Хламидиоз завершает цикл развития, но не lyse клетки-хозяина.
    9. Изображение сотовых монослой с 250 мс воздействия на 4% и 18% интенсивности в каналах GFP и RFP, соответственно(JoVE61365_screenfile10). Обнаружить сигнал Clover (GFP) путем возбуждения на 470 нм с 514/30 нм фильтр выбросов диапазона. Обнаружить сигнал mKate2 (RFP) путем возбуждения на 595 нм и с 641/75 нм фильтра выбросов диапазона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизация интенсивности возбуждения имеет решающее значение для минимизации флюорофор фотоблего и фототоксичность хламидиоза. Минимальная интенсивность возбуждения для создания разрешенного изображения с воздействием 200-300 мс должна быть эмпирически определена в экспериментальных исследованиях.
    10. Захват нескольких ломтиков с диапазоном фокусировки, которая заканчивается по обе стороны от среза фокуса. В этом эксперименте, при 20-кратное увеличение, это было достигнуто с 4 ломтиками на 10 мкм шаги(JoVE61365_screenfile11).
    11. Выберите Относительное q для изображения нескольких срезов в окне приобретения. В качестве отправной точки для следующего интервала времени в варианте «относительное» используется местоположение плоскости , сохраненное в списке положения изображения. Ввод соответствующих значений для каналов флуоресценции(JoVE61365_screenfile12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система фокусировки на основе изображения несовершенна, и в течение 24-часового периода визуализации это приводит к дрейфу фокуса. Было установлено, что, захватив 3-4 - координационных плоскостей для каждой точки времени в фокусе изображение было сохранено. Для устранения различий в фокусных плоскостях между флуоресцентными каналами изображения и каналом DIC необходимо смещение. Эмпирическая решимость этого сбавок будет необходима.
    12. Сохранить изображения, выбрав корневой каталог и назвав эксперимент. Используйте опцию файла стека изображений «Manager» для сохранения изображений в виде файлов tiff стека(JoVE61365_screenfile13).
    13. Запишите экспериментальные детали в поле Комментарии о приобретениях в окне Multi-D Acquisition(JoVE61365_screenfile13). т.е., Ну A1: Необработанный контроль. Ну A2-3 и B1-3: EMS мутантов. Изображение: 12-36HPI. Начните приобретение изображения с 12 HPI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании «Manager» оставьте программу, экспериментальную установку и микроскопное оборудование, работающую после завершения эксперимента. После завершения анализа мутагенизированной популяции участки изображений будут вновь рассмотрены для изоляции включения.

3. Выявление и изоляция мутагенизированного хламидиоза с измененными фенотипами развития

  1. Создание стека изображений в фокусе
    1. Извлеките наиболее фокусное изображение из стеков с помощью сохраненных данных изображений, которые содержат 4 срезов на временной момент. Используйте опцию измерения куртоза(Анализ Мера) в ImageJ / FIJI автоматически определить наиболее в фокусе ломтик (самый высокий счет куртоза) и создать новый стек изображений только с этими в фокусе изображения. Скрипт Python включен в качестве дополнительного файла(Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)для автоматизации этого процесса.
  2. Количественная экспрессия флуоресценции в отдельных включениях
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки кинетики выражения двух репортеров использовать приложение для анализа изображений с открытым исходным кодом ImageJ/FIJI и плагин Trackmate15. Trackmate определяет "пятна" (соответствующие включениям в этом случае) и следует за ними через временный стек изображения записи X, Y местоположение и интенсивность сигнала для каждого включения с течением времени(JoVE61365_screenfile14). Эта информация сохраняется в виде файла CSV и будет импортирована в пользовательский ноутбук Python для анализа.
    1. Откройте в фокусе стек изображения в ImageJ/FIJI с помощью биоформатных импортеров, нажав на плагины Био-форматы Биоформатные импортеры. Выберите Hyperstack и Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
    2. Вычесть фон изображения, нажав на процесс Вычесть фон, используя радиус Rolling ball 50,0 пикселей и повысить контраст изображения до 0,3% для насыщенных пикселей(Процесс Улучшение контрастности). Умножьте значения изображения на 10.0(Процесс Математика Умножьте)(JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
    3. В Trackmate(Плагины Отслеживание Trackmate), выберите предполагаемый диаметр капли 48 пикселей (эмпирически определяется на основе размера включения в конце изображения). Производить не-фрагментированные инклюзивные треки, выбрав максимальное расстояние Linking и максимальную дистанцию закрытия разрыва 8,0 пикселей и максимальный разрыв кадра Gap 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения способности Trackmate для идентификации и отслеживания включений в течение всего цикла создается отдельный канал изображения, добавляя euoprom и hctBвыпускной каналы вместе, используя функцию математики изображения в ImageJ/FIJI. Этот канал затем используется Trackmate для идентификации и отслеживания включений с течением времени. Флуоресцентные значения каналов euoprom и hctBprom затем записываются в каналах 2 и 3.
    4. Запись треков, которые отвечают минимальной непрерывной продолжительности: Продолжительность трека: 20(JoVE61365_screenfile26). Проанализируйте треки и сохраните пятна в статистике треков в виде файла CSV(JoVE61365_screenfile27).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс был автоматизирован с помощью пользовательского скрипта Python, который предоставляется в дополнительных данных(TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
  3. Определить пути включения с измененными профилями развития
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выявления включений, содержащих Chlamydia с измененными профилями развития, каждый трек включения был визуализированы с помощью ноутбука Python. Эти визуализации позволяют идентифицировать включения с кинетической генерации генов профилей, которые отличаются от макета обработанной популяции. Ноутбук Python, используемый для идентификации включений с измененным программированием развития, содержится в дополнительных данных (EMS_Screen-Маркдаун).
    1. Импортируйте данные отслеживания включения из Пятен в статистике треков CSV файлы в кадр данных Pandas с помощью ячейки импорта в EMS_Screen-Markdown Python ноутбук.
    2. Базовый уровень корректирует каждый трек, вычитая минимальное значение каждого трека из остальных значений трека с помощью базовых вычитающихся ячеек. Сохраните полученные значения в виде файла маринованных с помощью ячейки Сохранить как маринованные. Это навсегда сохранит значения канала после вычитания базового уровня для последующего поиска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая вычитание устанавливает начальную флуоресцентную интенсивность каждого включения к нулю.
    3. Устранить следы от включений вблизи краев FOV с помощью ячейки Фильтр Edges, как их флуоресцентные профили не могут быть полностью захвачены; эти следы могут привести к ложноположительных профилей развития.
    4. Калибровка кадра(totalFrames)значения от изображения к времени(startTime, интервал)значения с time-lapse калибровочной ячейкой с использованием экспериментального времени начала и интервала времени изображения. Исключите частичное включение считывает, отфильтровывая следы, которые не распространяются в течение последних 20 ч эксперимента (16-36 HPI) с помощью ячейки фильтра длительности трека.
    5. Отдельные треки в отдельные кадры данных экспериментальным состоянием с клеткой назначения лечения. Фильтр для включений, которые демонстрируют достаточный рост с помощью фильтра для ячейки роста. В ячейке Фильтр для роста эмпирически установите порог интенсивности флуоресценции для канала euoprom, изменив значения в течение последних двух строк кода. Это будет отфильтровысый хламидиоз, который не растет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при установке пороговых фильтров, если фильтр слишком низок, в результате участков рассеяния будет шумно, но если фильтрация установлена слишком высоко важные мутанты могут быть устранены.
    6. Рассчитайте процентную смертность, вызванную EMS, разделив количество мутагенизированных треков/хорошо на количество макет-обработанных треков/хорошо. Умножьте количество макет-обработанных треков на первоначальный коэффициент разбавления 3, чтобы вычислить количество макет обработанных треков / хорошо. Используйте треки включения графа и рассчитайте клетки смертности процента для выполнения этой задачи.
    7. Рассчитайте время полумемиалального выражения для ранних и поздних репортеров для каждого трека с помощью ячейки Calculate. Эти значения будут использоваться для сравнения мутагенизированных и макетов популяций для выявления мутантов развития.
    8. В клетке Half-Max Plot используйте пакет построения bokeh, чтобы визуализировать время до полуместа выражения каждого промоутера, график времени выпускного вечера эуодо полумамалеального выражения против того, что из выпускного вечера hctB. Определите включения из популяции мутантов, которые выходят за пределы макета обработанного облака рассеяния, используя интерактивный исследователь id-track bokeh. Обратите внимание на FOV и XY координаты включений интересов(рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите включений кандидатов, которые визуально выходят за пределы облака управления, поскольку проверка и статистическая оценка каждого клона будут выполняться впоследствии.
    9. В анимированных Участок ячейки визуализировать изменения в промоутер выражения кинетики динамически во времени, график выражения интенсивности euoвыпускного вечера против выпускного вечера HCTBс помощью инструмента построения Участок16. Функция рассеяния Plotly используется для анимации экспрессии гена с течением времени (Видео 1).
    10. Визуализируйте снимок с плотоястного графика в ячейке Inclusion Locator, прокладывая эвовыпускной и hctBвыпускной бал в определенный момент времени (т.е. 28 HPI) с помощью пакета bokeh(рисунок 3). Определите включения из популяции мутантов, описанные в шаге 3.3.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ должен быть выполнен быстро (Зтт;4 ч), так как включения все еще расширяются и начнут лисе-клетки хозяина 48 ч после заражения.
  4. Изолировать мутантов развития от включения интересов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изоляции хламидиоза от включений, которые были определены для отображения измененной регуляции генов микроманипулятор с капиллярными иглами был использован. Ну ID, FOV и X, Y координаты включений, представляющих интерес были определены с помощью визуализации данных в разделе 3.3.
    1. Подготовка капиллярных игл, удерживая центр капиллярной трубки в пламени и потянув оба конца капиллярной трубки, пока он не отделился. Создайте отверстие в вытягиваемой капиллярной игле путем ломать вытягиваемый кончик на скольжении микроскопа. Чтобы сломать иглу, поместите закрытый наконечник на матовый размер микроскопа слайд под углом и применить давление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики капиллярной трубки были 1,0 мм O.D., 0,5 мм I.D.
    2. Убедитесь, что отверстие иглы примерно размером с включение под микроскопом, 20x цели.
    3. Прекулл 25-30 капиллярных игл для изоляции кандидатов включений (одна игла за включение).
    4. Заполните микроинкектор с минеральным маслом, гарантируя, что нет пузырьков воздуха присутствуют.
    5. Прикрепите стеклянную капиллярную иглу к микроинжектору и изгоните масло к кончику иглы, выталкивая любые пузырьки воздуха. Поместите капиллярную иглу в полные средства массовой информации и привлечь средства массовой информации на полпути. Заполнение капиллярной иглы средствами предотвращения загрязнения масла в скважине.
    6. Используя список сохраненных позиций в «Manager» с шага 2.3.5, мигрировать в колодец и FOV включения интереса, указанного в блокноте визуализации Python.
    7. Используйте джойстик микроманипулатора для локализации капиллярной иглы к координатам XY включения интереса.
    8. Используйте 595 нм возбуждения канала для визуализации EBs для извлечения и фазы / DIC белый световой канал для визуализации иглы. Маневр капиллярной иглы для включения, разрыв включения, а затем обратить EBs в капиллярной иглы с помощью микроинкектора.
    9. Изгоните EBs из капиллярной иглы в единый колодец подготовленной 24 хорошо полистироловой пластины, подготовленной в шаге 2.1.2. Снимите капиллярную иглу и замените свежей капиллярной иглой для следующего включения. Повторите раздел 3.4 для всех кандидатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расширения и для обеспечения достаточно высокого титера для повторного изображения, инкубировать мутант изоляты в 5% CO2, 37 КК инкубатора до тех пор, пока большинство клеток-хозяев инфицированы (1 неделя). Скважины должны внимательно контролироваться, поскольку различные изоляты могут демонстрировать различные темпы роста.
  5. Урожай мутантов изолятов
    1. На льду, нарушить зараженный монослой, соскоб с 1 ML микропипетт отзыв. Перенесите средства массовой информации, клеточный мусор, и выпустила Хламидиоз в 1,5 мл микроцентрифуги трубки.
    2. Пеллет Chlamydia центробежием в течение 30 мин при 4 градусах x gЦельсия, Удалите супернатант и реuspend гранулы в 75 мл льда холодной 1x SPG. Aliquot в три 1,5 мл винт-крышка микроцентрифуги труб. Хранить при -80 градусов по Цельсию.

4. Проверка фенотипов мутантов изолируют

  1. Культура клеток-хозяев для изображений мутагенизированных изолятов
    1. Семя 96 хорошо стекла нижней пластины с 1,6 х 104 Cos-7 клетки (ATCC) на хорошо в 100 МЛ полных средств массовой информации. Инкубировать при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию. Клетки должны достичь слияния примерно в 24 ч. После слияния клеток замените средства массовой информации полными носителями, дополненными 1 мкг/мл циклохексимида, инкубировать в одночасье.
  2. Инфекционная клетка с изолятами кандидата для фенотипической проверки
    1. Оттепель мутантов клонов и дикого типа хламидиоза на льду.
    2. В подготовленной 96 скважинной пластине выполните двукратное серийное разбавление мутантных изолятов, используя одну колонку на изоляцию (11 столбцов). Начните с первоначального разбавления 1:20 в 100 мл HBSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Серийное разбавление хламидиоза выполняется для обеспечения того, чтобы образцы мутантов были изображены на МОИ и lt; 1.
    3. Заразить оставшуюся (12-ю) колонну диким типом Хламидиоза в МВД No0,5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дикий хламидиоз используется в качестве контроля для сравнения с мутагенизированными изолятами.
    4. Инкубация в течение 15 мин качания при 37 градусов по Цельсию.
    5. Вымойте инфицированные клетки-хозяина с предварительно разогевшей (37 градусов по Цельсию) HBSS с 1 мг/мЛ гепарина и HBSS, как указано в разделе 2.2.
    6. Замените 200 мл на колодец предварительно обогновенной (37 градусов по Цельсию) носителяей миок.
    7. Заполните межвелл пространства с предварительно нагревается (37 градусов по Цельсию) deionized H2O.
    8. Инкубировать при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию на 10 ч.
  3. Настройка микроскопа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 2.3 для установки микроскопа, этот раздел будет содержать только необходимые изменения настройки.
    1. Выберите шаблон 96 хорошо пластины из плагина HCS.
    2. Эмпирически определяющие скважины, соответствующие МВД, 1 для каждого мутантного изолята. Выражение клевера под контролем euo промоутер наблюдается на й 10 HPI делает раннюю визуализацию включений возможно (Рисунок 1B).
    3. Выберите три скважины на мутантный изолят, которые соответствуют MOI й lt; 1 и создайте список позиций изображений, состоящий из двух FOV на скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только 72 изображения могут быть приняты в интервале времени из-за аппаратных ограничений, это приравнивается к трем разбавления (колодцы) на штамм с использованием двух сайтов изображений на скважину, если 12 образцов изображены.
    4. Запишите цикл развития каждого мутантного изолята на 36 ч при интервалах 30 мин, начиная с 12 HPI.
    5. Запишите экспериментальные детали в поле Комментарии к приобретениям. т.е., Ну ABC1: дикий контроль. Ну ABC2: Мутант штамм 1, ABC3: Мутант штамм 2, и т.д. ... Изображение: 12-48 HPI.
    6. Начните приобретение изображения с 12 HPI.

5. Анализ данных для проверки изоляции

  1. Создание в фокусе стеков изображений и количественное выражение флуоресценции в отдельных включениях
    1. Создавайте флуоресцентные следы интенсивности для каждого включения, указанные в разделе 3.1 - 3.2.
  2. Проверить Ctr мутагенизированных изолятов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки измененных профилей развития мутантных изолятов их профили выражения сравниваются с профилем выражения дикого типа с помощью ноутбука Python. Ноутбук Python, используемый для проверки клонов-мутантов с измененным программированием развития, содержится в дополнительных данных(clone_check-Markdown).
    1. Импорт и фильтрация данных о следах включения в ноутбуке clone_check-Markdown Python, как это делается в разделе 3.3.
    2. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение (STD) от следов каждой популяции изолята и дикого контроля с помощью расчетной средней и ЗППП-клетки.
    3. С Графиком Iso против WT участок ячейки средняя и стандартная ошибка среднего (SEM) каждого клона мутанта против контроля wildtype для определения, если мутант выражения кинетики расходятся с образцом дикого типа (Рисунок 4).
    4. Определите, является ли изолированная популяция мутантов клональной, спланируя следы мутантов и сравнивая их с следами включения дикого типа, используя участок рассеяния, как это делается в разделе 3.3 (шаги 3.3.7-3.3.10)(Рисунок 2, Рисунок 3). Если изоляция является смешанной популяцией, участок покажет одну популяцию, наложенную с диким типом, и вторую отдельную популяцию за пределами облака рассеяния дикого типа. Если популяция выглядит смешанной, мутант может быть повторно изолирован с помощью первоначальной процедуры, описанной в разделе 3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения того, статистически ли профиль развития изоляции отличается от дикого типа, кривые для каждого изолята следует сравнивать с диким типом с помощью ANOVA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прямой МУТагенез EMS нашего промоутера-репортера хламидиального штамма привел к снижению инфекционности на 75%. Используя описанный протокол изображения живых клеток, 600 включений были изображены и отслеживаются в течение 24 ч периода. Флуоресцентное выражение кинетики обоих репортеров в каждом включении было визуализирован с помощью пользовательских скриптов ноутбука Python. Были реализованы два подхода к визуализации для определения кандидата мутагенизации хламидиоза для изоляции. Первая методология (шаг 3.3....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рассечение механизмов, контролирующих цикл развития хламидий, было затруднено ограничениями имеющихся в настоящее время генетических инструментов. Используя наш промоутер-репортер Chlamydia в сочетании с живой клеткой автоматизированной микроскопии, система была построена, которая позволяет мониторинга развития клеточного типа в отдельных включений в течение 24 ч периода. Эта система, в сочетании с химическим мутагенезом и прямой изоляции включения создал метод быстро и клонально выбрать хламидиоз, выра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-ра Андерса Омсленда из Университета штата Вашингтон за поставку CIP-1 axenic средств массовой информации. Эта работа была поддержана грантом NIH R01AI130072, R21AI135691 и R21AI113617. Дополнительная поддержка была оказана стартап-фондами из Университета Айдахо и Центра моделирования комплексных взаимодействий через их грант NIH P20GM104420.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночные полистирольные планшетыCorning3524Выращивание клеточных культур для повторного заражения изолятов
6-луночные стеклянные донные пластиныCellvisP06-1.5H-NВыращивание клеточных культур для визуализации
96-луночных стеклянных донных пластин Nunc165305Выращивание клеточных культур для визуализации
Bold line CO2 UnitOKO LabsCO2 UNIT BLStage инкубатор для контроля CO2
Bold Line T UnitOKO LabsH301-T-UNIT-BL-PLUSStage инкубационный регулятор температуры
Капиллярные трубки из боросиликатного стеклаSutter InstrumentB1005010Капиллярные трубки
Полосовой фильтр излучения BrightLine (514/30 нм)SemrockFF01-514/30-25Флюоэсцентный фильтр куб
Полосовой фильтр BrightLine (641/75 нм)SemrockFF02-641/ 75-25Флюоэстный фильтрующий куб
CellTram VarioEppendorf5196000030микроинъектор
Chlamydia trachmatis serovar L2ATCCVR-577Chlamydia trachomatis
CIP-1 фильтрующий материалВ домеNAAxenic фильтрующий материал. IPB с добавлением 1% FBS, 25 μ М-аминокислоты, 0,5
мМ G6P, 1,0 мМ АТФ, 0,5 мМ DTT и 50 μ M GTP, UTP и
CTP. (Omsland, A. 2012) собственного производства.
Cos-7 cells (ATCC)ATCCCRL-1651Африканская зеленая мартышка Клетка почки (клетки хозяина)
CycloheximideMP Biomedicals194527Ингибитор роста клеток
хозяина Этилметансульфонат, 99%Acros OrganicsAC205260100мутаген
Fetal PlexGemini Bio-Products100-602Добавка для основных питательных сред
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/FijiNAПрограммное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом. https://imagej.net/Fiji
Инкубатор Galaxy 170 S CO2EppendorfCO1700100XИнкубационные блоки клеточных культур
(флуоресцентные варианты FP: Clover и mKate2)Интегрированные DNA TechnologiesNAgblock ORF из Ctr оптимизированных вариантов FP для клонирования в p2TK2SW2
Гентамицин 10 мг/млGibco15710-064Антибиотик для питательных сред
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)Corning21-020-CMКлетки хозяина промывают
гепарин натрийAmersham Life Science16920ингибирует и обращает вспять ранние электростатические взаимодействия между клеткой-хозяином и EB
HEPES 1MGE Life SciencesSH30237.01pH буфер для питательных сред
InjectManEppendorf5179 000.018Микроманипулятор
Jupyter Notebookhttps://jupyter.org/NAВизуализация кривых включений. https://jupyter.org/
Lambda 10-3Sutter InstrumentLB10-3Управление колесом фильтра
Oko TouchOKO LabsOko TouchИнтерфейс для управления Bold line T и CO2
Unit Prior XY stagePreviousH107Моторизованный предметный столик для микроскопа XY
PrismR Центрифуга PrismRLabnetC2500-RМикроцентрифуга с регулируемой температурой
Problot Печь для гибридизацииLabnetH1200AКачающийся инкубатор для заражения хламидиозом
Proscan IIПриорH30V4XYZ микроскоп Контроль предметного столика
Очиститель класса 2 Шкаф биобезопасностиLabconco362804Работа с культивированием клеток
RPMI-1640 (без фенола красного)Gibco11835-030Основная питательная среда для визуализации
RPMI-1640 (феноловый красный)GE Life SciencesSH30027.01Базовая среда
для выращивания ОСЦИЛ светодиоды возбуждения светодиоды (470 нм, 595 нм)scopeLEDF140Возбуждающий свет
Звуковой дисмембранор Модель 500Fisher Scientific15-338-550Ультразвуковая система, суспензия хламидийных гранул
Stage инкубаторOKO LabsH301-K-FRAMEКластерная луночная пластина инкубационная камера
сахароза-фосфат-глутаматный буфер 1X (SPG)В домеNAХламидийный буфер для хранения. (10 мМ фосфат натрия [8 мМ K 2HPO 4, 2 мМ KH 2PO 4], 220 мМ сахароза, 0,50 мМ L-глутаминовая кислота; pH 7,4)
Колбы T-75Thermo Scientific156499Выращивание клеточных культур
TE 300 Инвертированный микроскопNikon16724
Микроскоп THOR LEDThor LabsLEDD1BБелый свет
TrypsinCorning25-052-CIВыбивает клетки хозяина из колбы для посева в планшеты
Zyla sCMOSAndorZYLA-5.5-USB3камера визуализации
&микро; Manager 2.0gammahttps://github.com/micro-manager/micro-managerNAПрограммный комплекс автоматизированного управления микроскопом с открытым исходным кодом

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
  2. Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
  3. Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
  4. Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
  5. Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).
  6. Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  7. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  8. Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  9. Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817(2016).
  10. Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
  11. Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
  12. Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
  13. Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
  14. Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
  15. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  16. Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
  17. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  18. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
  19. Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
  20. Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи