Method Article

Методы микроинъекции эмбрионов для эффективного сайт-специфического мутагенеза при Culex quinquefasciatus

DOI:

10.3791/61375

⸱

May 24th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology and Plant Patholog, Auburn University, 3Tata Institute for Genetics and Society, University of California, San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает процедуры микроинъекции для эмбрионов Culex quinquefasciatus, которые оптимизированы для работы с инструментами редактирования генов CRISPR / Cas9. Этот метод может эффективно генерировать специфические для сайта, наследственные мутации зародышевой линии, которые могут быть использованы для создания генетических технологий у этого недостаточно изученного переносчика болезней.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culex quinquefasciatus является переносчиком разнообразного спектра трансмиссивных заболеваний, таких как птичья малярия, вирус Западного Нила (ВЗН), японский энцефалит, восточный конский энцефалит, лимфатический филяриоз и энцефалит Сент-Луиса. Примечательно, что птичья малярия сыграла важную роль в исчезновении многочисленных эндемичных островных видов птиц, в то время как ВЗН стала важным трансмиссивным заболеванием в Соединенных Штатах. Чтобы получить дальнейшее представление о биологии C. quinquefasciatus и расширить их набор инструментов генетического контроля, нам необходимо разработать более эффективные и доступные методы геномной инженерии у этого вида. Тем не менее, некоторые биологические признаки, уникальные для комаров Culex, особенно их яичные плоты, затруднили выполнение процедур микроинъекции, необходимых для геномной инженерии. Для решения этих проблем мы разработали оптимизированный протокол микроинъекции эмбриона, который фокусируется на смягчении технических препятствий, связанных с уникальными характеристиками комаров Culex. Эти процедуры демонстрируют оптимизированные методы сбора яиц, разделения плотов и других процедур обработки, необходимых для успешной микроинъекции C. quinquefasciatus. В сочетании с технологией редактирования генома CRISPR / Cas9 эти процедуры позволяют нам достигать специфических для сайта, эффективных и наследственных мутаций зародышевой линии, которые необходимы для выполнения передовой геномной инженерии и разработки технологий генетического контроля в этом важном, но в настоящее время недостаточно изученном переносчике болезни.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. quinquefasciatus,широко известный как южный домашний комар, является компетентным переносчиком многочисленных патогенов, включая вирус Западного Нила (ВЗН), японский энцефалит, энцефалит Сент-Луиса и восточный конский энцефалит. В частности, с тех пор, как ВЗН была впервые обнаружена в Нью-Йорке в 1999 году, ВЗН стала основным трансмиссивным заболеванием на всей континентальной части Соединенных Штатов (США), где зарегистрировано более 50 000 случаев заболевания людей, в результате чего в период с 1999 по 2018 год погибло около 2 300 человек1, а также более 4 500 зарегистрированных случаев заболевания лошадей в период с 2008 по 2019год2. Кроме того, по меньшей мере 23 вида птиц, обнаруженных в Северной Америке, подверглись воздействию инфекций ВЗН, причем по меньшей мере 12 видов классифицированы как невосполнимые в результате ВЗН3. Влияние ВЗН на популяции людей, лошадей и птиц обусловлено оппортунистическим пищевым поведением его переносчиков. Как правило, птицы являются основными хозяевами для ВЗН, а люди и лошади являются случайными или тупиковыми хозяевами. Некоторые патогены, переносимые C. quinquefasciatus, заражают только птиц, таких как паразит птичьей малярии, Plasmodium relictum. На Гавайях C. quinquefasciatus является основным переносчиком птичьей малярии и вызвал вымирание многих местных видов птиц4,5.

Для борьбы с болезнями, передаваемыми C. quinquefasciatus,исследователи и агентства по борьбе с переносчиками использовали широко установленные инструменты борьбы с популяцией комаров, такие как применение инсектицидов6,однако эти методы являются дорогостоящими, не видоспецифичными и имеют ограниченную эффективность, поскольку устойчивость к инсектицидам высока во многих популяциях C. quinquefasciatus 6,7,8,9. Другие методы контроля, такие как стратегии контроля популяции на основе Wolbachia,были разработаны в последние годы10,11,но затраты на приспособленность, связанные с инфекцией Wolbachia, ограничивают осуществимость этого подхода для этого вектора12. Существуют также генетически обоснованные методы борьбы, которые были разработаны у других видов комаров, таких как Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 и Anopheles stephensi16,включая развитие устойчивых к патогенам комаров17,18,19,которые также могут быть разработаны для C. quinquefasciatus, если необходимые инструменты геномной инженерии разработан для этого вида. Однако биология C. quinquefasciatus сильно отличается от других комаров-переносчиков Aedes и Anopheles, что затрудняет разработку подобных генетических технологий в этом векторе. С появлением технологий геномной инженерии на основе CRISPR точная геномная инженерия становится все более тривиальной, доступной и адаптируемой и, следовательно, привела к разработке новых генетических инструментов для широкого спектра видов.

Для генерации мутаций с помощью технологий на основе CRISPR смесь белка Cas9 и синтетической направляющей РНК (sgRNA), комплементарной к желаемым локам, микроинъектируется в эмбрионы до бластодермной стадии. Поскольку самки C. quinquefasciatus откладывают яйца группами, прикрепленными в плавающую плотовую структуру(рисунок 1),в отличие от яйцекладущих отдельных яиц, черта комаров Aedes и Anopheles, микроинъекции эмбрионов у этого вида становятся все более сложными. Личинки кулекса также выходят с передней стороны каждого яйца, которая находится в контакте с поверхностьюводы (рисунок 1),поэтому у этого вида важны манипуляции с ориентацией яиц. Здесь мы опишем подробный протокол, предназначенный для микроинъекции белка Cas9 и sgRNA в эмбрионы C. quinquefasciatus. Этот протокол был разработан для учета признаков, уникальных для биологии Culex, чтобы улучшить выживаемость эмбрионов и частоту мутаций генома с помощью определенных шагов, которые являются ключевыми для своевременного сбора яйцеклеток и выживания яйцеклеток.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выращивание колонии C. quinquefasciatus

  1. Установите несколько колоний взрослых особей C. quinquefasciatus в клетках общежития.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии были предоставлены доктором Лорой Харрингтон из Корнелльского университета20. Подробные протоколы выращивания комаров Culex можно найти в другой литературе21.
    1. Поддерживайте комаров при температуре 25 ± 1 ° C при влажности 30% с циклом 12:12 ч день:ночь.
    2. Обеспечьте 20% раствор сахара ad libitum, введя контейнер с сахарным раствором с фитилем в клетку или насытив ватные шарики сахарным раствором и поместив его в клетку.
  2. Позвольте комарам спариваться в течение как минимум 3 дней до кормления кровью(рисунок 2A).

2. Коллекция эмбрионов C. quinquefasciatus до бластодермной стадии

  1. Через 3-6 дней после эклозии обеспечьте самкам 1-2 мл цитированной бычьей крови через синтетическую мембрану и нагретой примерно до 40 °C в системе кроветворения(рисунок 2B). Существуют также альтернативные протоколы кровососоделья, которые могут быть использованы для комаров Culex (например, см. ссылку21).
    ПРИМЕЧАНИЕ: C. quinquefasciatus известен предпочтением птичьей крови. Некоторые лаборатории используют анестезируемую живую кровь птиц или птиц для источника кровяной муки21,22,23. Тем не менее, колонии могут быть обучены / отобраны для питания бычим кровью или мелкими грызунами, если эта особенность отбирается для нескольких поколений.
    1. Дайте самкам отдохнуть в течение как минимум 3 дней после кормления кровью, чтобы пройти оогенез и созревание яйцеклеток, прежде чем индуцировать яйцекладку для экспериментов с микроинъекцией.
  2. В день эмбриональных микроинъекций создайте чашечку яйцекладки с органически настоянным яйцекладкой водой. Яйцекладку воды следует делать путем ферментации фекалий кролика (50 г/л), разложения травы (4,5 г/л) или рыбьей пищи (25 г/л) в воде в течение 5 и болеедней 24,25.
  3. Поместите чашку яйцекладки в клетку и поместите всю клетку в темное место(рисунок 2C).
  4. Через каждые 30 минут проверяйте чашку на наличие яичных плотов.
    1. Если яичные плоты присутствуют, соберите плоты, зачерпнув их кистью и поместите на влажную фильтровальную бумагу(рисунок 2D, E).

3. Выравнивание эмбрионов C. quinquefasciatus до бластодермной стадии

  1. Отделите яйца от плотов, надавливая на плот и дразнив яйца по отдельности, используя кисть с тонким наконечником и щипцы(рисунок 2E).
  2. Выровняйте отдельные яйца на тонкой полоске двусторонней липкой ленты, помещенной поперек верхней части стеклянного слайда(рисунок 2F).
  3. Выравнивая, постарайтесь указать на передовую сторону каждого яйца в одном направлении для облегчения доступа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный метод выравнивания яйцеклеток без двусторонней липкой ленты можно найти в ранее опубликованном протоколе микроинъекции эмбриона Nasonia vitripennis 26.
  4. Накройте яйца смесью галогенуглеродного масла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Галогенуглеродную смесь можно приготовить заранее, осторожно смешав два галогенуглеродных реагента и воду (9:1:20, галогенуглерод 700: галогенуглерод 27: Сверхчистая вода), а затем инкубируя смесь в течение ночи при 25οС для облегчения насыщения галогенуглеродным маслом водой.

4. Подготовка иглы к микроинъекциям

  1. Сгенерируйте иглы из алюмосиликатного капиллярного стекла с помощью стеклянного съемника микропипетки.
    1. Поместите алюмосиликатное капиллярное стекло в съемник иглы в соответствии с инструкциями из руководства пользователя иглоутолителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть использованы кварцевые и боросиликатные капиллярные иглы, но для этого эксперимента алюмосиликат является предпочтительным из-за его относительной доступности и долговечности.
    2. Установите для установки значения «Тепло» на 516, «Скорость» на 100, «Задержка» на 70, «Потяните» на 97 и «Давление» на 500 на съемнике иглы.
    3. Активируйте съемник иглы в соответствии с инструкциями съемника и повторите по мере необходимости дополнительные иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса инъекции иглы часто засоряются или случайно ломаются, поэтому настоятельно рекомендуется вытягивать дополнительные иглы для одного эксперимента.
  2. Скосните наконечник иглы, осторожно коснувшись кончика вытянутой иглы на вращающейся алмазной абразивной пластине в течение примерно 10 с под углом 50°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скос иглы открывает ее, чтобы позволить жидкости протекать, а также создать более острый наконечник для более легкого проникновения в эмбрион. Пример правильной иглы можно увидеть в предыдущей статье26.
  3. Храните вытащенные и скошенные иглы, встраивая их в линии глины моделира в чашке Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить наилучшее качество наконечников игл, иглы должны быть свежевытянуты и скошены как можно ближе ко времени инъекции.

5. Загрузка инъекционной смеси

  1. Готовят инъекционную смесь, состоящую из реагентов модификации генома (например, 200 нг/мкл sgRNA и 200 нг/мкл смеси Cas9), или предпочтительные инъекционные растворы и держат ее на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эту смесь можно приготовить в ожидании откладывания яиц. Более подробную информацию о производстве Cas9 и sgRNA и подготовке к микроинъекции можно найти в предыдущих публикациях27,28,29,30.
  2. Загрузите 2 мкл инъекционной смеси в инъекционную иглу с помощью наконечника микрозагрузчика.

6. Настройка микроинъекции

  1. Поместите заполненную инъекционную иглу в микроманипулятор, установленный связанным с электронным микроинжектором.
  2. Поместите стеклянный слайд, содержащий выровненные яйца, на ступень составного микроскопа.
  3. Используя микроманипулятор и составной микроскоп, выровняйте иглу, чтобы нацелиться на задний конец эмбриона под углом 25-35°.

7. Микроинъекцияэмбриона (рисунок 2G)

  1. Осторожно вводят иглу в эмбрион и вводят смесь в количестве около 10% от объема эмбриона (700-800 пл в зависимости от размера яйцеклеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При инъекции яйцеклетка должна слегка набухать, однако, если введено слишком много жидкости, яйцеклетки могут лопнуть, или цитоплазматическая жидкость может просочиться.
  2. Вводите около 20 яйцеклеток за раз, затем остановитесь и выполните процедуры восстановления эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции существует высокая вероятность того, что иглы либо засорятся, либо сломаются. Если возникает засорение, которое может быть определено по отсутствию инъекционной жидкости, протекающей через иглу, попробуйте либо очистить иглу с функцией очистки на электронном микроинжекторе, либо попытаться повторно скошить иглу. Если ни один из этапов не работает, быстро перейдите на новую иглу, гарантируя, что подготовленные яйца остаются увлажненными.

8. Восстановление и вылупление эмбрионов

  1. Оставьте яйца нетронутыми не менее 5 минут. В течение 20 минут после инъекции осторожно удалите галогенуглеродное масло, слегка почисвив щеткой чистой кистью(рисунок 2H).
  2. Осторожно поднимите яйца с помощью кисти и поместите их в чашку с двойной дистилляциейводы (рисунок 2I). Позаботьтесь о том, чтобы яйца держались на поверхности воды.
  3. Проверяйте яйца ежедневно в течение 7 дней для вылупления(рисунок 2J).
  4. Соблюдайте обычные процедуры выращивания личинок21.

9. Скрининг на модификацию генома

  1. Скрининг введенных комаров на наличие мутантных фенотипов с помощью стереоскопа(рисунок 2K).
    1. Проверка мутаций, которые не имеют легко узнаваемого фенотипа, путем амплификации ПЦР, анализа эндонуклеазы T7 I и секвенирования путем субклонированияцелевой области 31.
  2. Установите дополнительные скрещивания между введенными людьми для обнаружения наследственных мутаций в зародышевой линии.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ранее опубликованных экспериментах этот метод был использован для успешной генерации соматических и зародышевых мутаций гена, критического для развития пигментации темных глаз, белого цвета (CPIJ005542)30 (табл. 1). Соматические мутации, сгенерированные CRISPR/Cas9, были оценены путем скрининга на потерю пигментации в глазах на стадии куколки у введенных лиц (G0). Соматические мутации обычно присутствовали в виде мозаичных фенотипов, где некоторые, но не все клетки имеют мутантный фенотип. Например, соматические мутации белого гена привели к смеси омматидий с фенотипами, у которого отсутствует пигментация, и с пигментным фенотипом30. Однако, когда произошла мутация зародышевой линии белого гена, следующее поколение (G1)унаследовало полный фенотип белоглазого цвета. Частота мутаций зародышевой линии определялась путем скрещивания мозаичной особи G0 и оценки для полностью белоглазого потомства (G1). Эти эксперименты привели к выживаемости эмбрионов от 64% до 82%, а также к частоте соматического мутагенеза от 37% до 57% и частоте мутагенеза зародышевой линии >61%(таблица 1). При мультиплексировке sgRNAs для нацеливания на несколько локусов в одном гене частота мутагенеза соматической и зародышевой линии увеличилась до 86%(таблица 1). Кроме того, на протяжении многих поколений жизнеспособные гомозиготные запасы белых мутантов успешно хранились в лаборатории.

figure-results-1
Рисунок 1: C. quinquefasciatus яичный плот и морфология одного яйца.
Дорсальный(A),боковой(B)и вентральный(C)виды яичных плотов C quinquefasciatus. Самки C. quinquefasciatus откладывают яйца с более луковичной передней стороной, касающейся поверхности воды, в то время как более заостренной сдней стороны от поверхности воды(D). А- передний; P- сподней части Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Временная шкала для создания мутантов C. quinquefasciatus путем микроинъекции.
Хронология подготовки колонии C. quinquefasciatus и сбора эмбрионов для микроинъекции(A-D). Собранные яйца затем отделяют(E),выравнивая в той же ориентации и покрываемые галогенуглеродным маслом(F). Затем яйца вводят(G)и дают отдохнуть минимум 5 минут перед удалением галогенуглеродного масла(H). Затем яйца переносятся в источник чистой воды(I)для вылупления(J)и проверяются на наличие мутантных фенотипов(K). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ВыживаниеСоматический мозаицизм (G0)Мутагенез зародышевой линии (G1)
sgRNA#injected♂♀Всего (%)♂♀Всего (%)МутантыG1 (%)
wsgRNA-150152035(70)7(47)13(65)20(57)128(69)
wsgRNA-25093241(82)3(33)12(38)15(37)51(61)
wsgRNA-350171532(64)7(41)8(53)15(47)157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-25071623(46)5(71)12(75)17(74)123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-35013922(44)10(77)6(67)16(73)72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-350171027(54)13(76)8(80)21(78)101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-350111021(42)9(82)9(90)18(86)149(86)

Таблица 1: Выживаемость и частота мутаций эмбрионов, вводимых одиночными и мультиплексными гРНК, нацеленными на белый цвет. Таблица перепечатывается с разрешения от30

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В связи с недавними усилиями по созданию генетически модифицированных инструментов для борьбы с переносчиками комаров возникла необходимость в разработке и оптимизации протоколов микроинъекции эмбрионов для распространенных переносчиков болезней комаров. Хотя методы были разработаны для комаров Aedes и Anopheles, протокол, разработанный специально для Culex, был минимально изучен. В целом протоколы инъекций эмбрионов комаров можно разделить на 3 общих этапа: 1) сбор и подготовка эмбриона, 2) инъекция эмбриона и 3) восстановление после инъекции. Чтобы успешно генерировать мутантов, все три шага должны быть оптимизированы для целевых видов. Этот модифицированный протокол микроинъекции эмбриона является специфическим для успешной геномной инженерии комаров Culex.

Максимизация сбора эмбрионов является распространенным узким местом в протоколах микроинъекции эмбрионов. Чтобы увеличить количество яиц, собранных за короткий промежуток времени, комаров ограничили от субстрата яйцекладки в течение 2-3 дней после приема пищи с кровью. Важно отметить, что C. quinquefasciatus, как правило, предпочитает источники крови птиц, а не источники млекопитающих или мембранное питание кровью млекопитающих. Тем не менее, многие исследователи испытывают трудности с приобретением надежного источника живых птиц или птичьей крови для кормления кровью, поэтому лабораторные запасы могут быть адаптированы для питания более доступными источниками крови. Также важно использовать богатую питательными веществами воду для яйцекладки субстрата, поскольку она обеспечивает сигналы яйцекладки для C. quinquefasciatus и большинства других векторов Culex. Существует множество методов получения богатой питательными веществами воды, которые, возможно, потребуется оптимизировать между лабораториями, чтобы обеспечить наличие соответствующего количества яиц для микроинъекции. Например, в то время как этот метод был наиболее успешным с фекалиями кроликов, ферментированными в деионизированной воде в течение 5 или более дней, другие исследователи имеют больший успех с травяной или рыбной пищей в качестве источника питательных веществ, а некоторые даже с дистиллированной водой21.

Поскольку комары Culex откладывают группы яиц на плотах, собрать яйца довольно просто. Яйца можно просто собрать, зачерпнуть весь плот кистью. Разделение яйцеклеток является более сложным, но необходимым для успешной инъекции. Яйца можно осторожно отделить от плота, применяя мягкое давление вниз между яйцами кистью или щипцами. С некоторой практикой несколько пользователей смогли надежно отделить одно яйцо от яичных плотов. После разделения каждого яйца яйца выравниваются в одинаковой ориентации на двусторонней липкой ленте, которая стабилизирует яйца во время микроинъекции. Яйца вводятся в конический задний конец, а добавление галоуглеродного масла сохраняет яйца влажными во время манипуляции.

Чтобы ограничить повреждение эмбриона во время микроинъекции, инъекционные иглы должны быть соответствующей прочности и скошены под соответствующим углом. Алюмосиликатные иглы, скошенные в течение 10 секунд под углом 50°, имели наилучшие результаты, но боросиликатные и кварцевые иглы также могут работать, даже если они могут быть менее прочными и более дорогими. Кроме того, правильная скос игла облегчает лучшее протекание смесей Cas9 и sgRNA и создает более острую точку для более легкого проникновения в эмбрион. Во многих случаях скос также является эффективным способом быстрого исправления забитых игл вместо того, чтобы тратить время и усилия на замену забитых игл.

После инъекции яйца должны оставаться нетронутыми в течение не менее 5 минут, а галогенуглеродное масло удаляется сразу после этого, аккуратно смахивая его чистой кистью. После удаления галоуглеродного масла введенные яйца могут быть помещены в воду для вылупления, что обычно происходит в течение 3 дней после инъекции. При наличии практики и достаточного количества яиц этот протокол может достичь последовательных соматических и зародышевых мутаций у C. quinquefasciatus и является достаточно универсальным, чтобы его можно было легко адаптировать к другим комарам Culex.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана стартовыми фондами UCSD, направленными в O.S.A.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Прозрачный пластиковый стаканчик для пэт на 9 унцийKaratC-KC9Insect Raising and Egg Collection
Капиллярная трубка из алюмосиликатного стекла 1 мм (внешний диаметр) X 0,58 мм (внутренний диаметр)Sutter InstrumentsBF100-58-10Также можно использовать микроинъекции, боросиликатные и кварцевые иглы, но мы предпочли алюмосиликатную
сыворотку Blood Colorado Serum Company31025Колонии потребовалось несколько поколений, чтобы приспособиться к этому источнику крови. Другие источники крови, вероятно, столь же уместны. Ознакомьтесь с протокольными примечаниями по выбору источника крови.
BugdormBugdorm4F2222Клетка для разведения насекомых
Cas9 Белок с NLSPNABioCP01Микроинъекционный
микроскопOlympus BX41Микроинъекция, для инъекции эмбриона
Алмазная абразивная пластина (размеры наконечников от 0,7 ед. до 2,0 мкм)Sutter Instruments104EМикроинъекция, для использования со скосом
Дистиллированная ДНКаза/РНКаза ВодаInvitrogen10977-015Микроинъекция
Двусторонняя лентаСкотчB084NVQGXDМикроинъекция, выравнивание эмбриона
Femtojet 4x или 4i программируемый микроинъекторEppendorfМикроинъекция
Femtotips Наконечники микрозагрузчикаFisher ScientificE5242956003Микроинъекция
Фильтровальная бумагаВатман1001-090Микроинъекция, сбор эмбрионов
Кисть с тонким наконечникомZEM2595Микровпрыск, выравнивание эмбрионов
Галокарбоновое масло 27Sigma-AldrichH8773Микровпрыск, выравнивание эмбрионов
Галокарбоновое масло 700Sigma-AldrichH8898Микроинъекция, выравнивание эмбрионов
HemotekHemotekPS5Line Maintenance
Микроэлектродный скосSutter InstrumentsBV10Микроинъекция, игла для снятия фаски
МикропипеткаPuller Sutter InstrumentsP-1000 или P-2000Микроинъекция, вытягивание иглы
Микроскоп СлайдыFisherbrand12-550-A3Микроинъекция, выравнивание эмбриона
Невысыхающая Пластилина для лепки JoviB0025Z71IMМикроинъекция, игла
хранение Стерео микроскопOlympusSZ51Microinjection, для выравнивания эмбриона
SugarDomino20% раствор сахара для взрослого источника сахара.
T7 Эндонуклеаза INEBM0302Приготовление микроинъекционных материалов
TOPO TA Клонирование Набор для клонированияThermoFischer ScientificK451020Приготовление микроинъекционных материалов
Ультратонкие щипцынаконечника Fisher Scientific16-100-121Микроинъекция, выравнивание эмбриона

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).">Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
  2. https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).">APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
  3. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).">Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
  4. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).">van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
  5. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).">Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).
  6. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).">Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).
  7. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).">Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
  8. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).">Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
  9. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).">Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).
  10. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).">Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).
  11. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).">Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).
  12. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).">Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
  13. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).">Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).
  14. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).">Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).
  15. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).">Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  16. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).">Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  17. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).">Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  18. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).">Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).
  19. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).">Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).
  20. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).">Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).
  21. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).">Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).
  22. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).">Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).
  23. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).">Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).
  24. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).">Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
  25. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).">Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
  26. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).">Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).
  27. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).">Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
  28. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).">Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  29. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).">Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
  30. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).">Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
  31. https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).">New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryo MicroinjectionCulex QuinquefasciatusEgg Raft SeparationCRISPR Cas9Germline MutagenesisNeedle PreparationHalocarbon OilMicromanipulator UseSomatic MutationsEgg Collection

Related Articles