Методическая статья

Метод количественного определения микроРНК в почке мышиной модели с ишемическим повреждением почек

DOI:

10.3791/61378

⸱

11 сентября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье представлен протокол детектирования экспрессии микроРНК в почках мышиной модели с острым повреждением почек с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. В этом протоколе особое внимание уделяется мышиной модели ишемического повреждения почек и тщательному извлечению образцов микроРНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МикроРНК (микроРНК) участвуют в различных болезненных состояниях и являются эффективными биомаркерами для ранней диагностики заболеваний и лечения у мышей. Тем не менее, стандартные протоколы очистки микроРНК и обнаружения их экспрессии в почках мышей с острым повреждением почек (ОПП) не были хорошо установлены. В этом исследовании был разработан эффективный и простой протокол очистки и количественного определения микроРНК в почках мышиной модели ОПП, индуцированной ишемией-реперфузией почек, с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR). Этот протокол включает в себя пять этапов: 1) индукция ОПП путем ишемии-реперфузии почек, 2) забор почек, 3) очистка общей РНК, включая микроРНК, из почек, 4) синтез кДНК путем обратной транскрипции микроРНК и 5) кОТ-ПЦР для определения экспрессии микроРНК. Используя этот протокол, можно создать модель ишемии-реперфузионного повреждения почек при легких и тяжелых формах ОПП. Кроме того, при правильном соблюдении процедуры можно получить согласованную модель ОПП с минимальными индивидуальными различиями. Этот анализ qRT-PCR показывает очень широкий динамический диапазон и позволяет различать зрелые микроРНК, которые могут быть точно количественно определены с высокой специфичностью. Этот протокол может быть использован для изучения профиля экспрессии микроРНК в почках ОПП.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ) почек представляет собой один из основных факторов риска развития острого повреждения почек (ОПП)1. ОПП играет значительную роль в прогнозе для пациентов, но специфические методы лечения и ранние диагностические биомаркеры не были установлены.

МикроРНК (микроРНК) — это короткие, некодирующие РНК, содержащие примерно 18–25 оснований. МикроРНК стабильны в жидкостях организма, и их последовательности высоко консервативны среди животных2. МикроРНК регулируют экспрессию нескольких белков через тысячи мишеней, тем самым влияя на различные сигнальные пути 2,3,4,5,6,7,8. В последние годы сообщалось, что микроРНК участвуют в различных заболеваниях и являются эффективными биомаркерами для ранней диагностики ряда заболеваний.

Общая цель этого протокола заключается в успешной очистке и обнаружении микроРНК в почках мышиной модели ОПП, индуцированной IRI. Данная модель ИРИ является широко используемой моделью ОПП и фиброза почек. К преимуществам модели IRI можно отнести возможность визуального подтверждения того, была ли достигнута ишемия-реперфузия, и определения точного времени начала ОПП. Тем не менее, длительность зажима, достаточная для того, чтобы вызвать широкое повреждение канальцев, связана с высокой смертностью, в то время как короткая продолжительность зажима не вызывает повреждения канальцев, что приводит к большому разбросу прогрессирования повреждения канальцев в этой экспериментальной модели. По сравнению с моделью двустороннего зажима, правая ткань нефрэктомии, собранная в односторонней модели IRI почки, действует как контроль и обеспечивает почечную недостаточность.

Образец почки разминают с помощью стеклянного гомогенизатора, в котором разделяют белки и нуклеиновые кислоты, а также разделяют ДНК и РНК9. Общую РНК, включая микроРНК, выделяют из образца почки с помощью спиновой колонки9 на основе кремнеземной мембраны. В дальнейшем проводят синтез кДНК (обратную транскрипцию) из общей РНК с использованием поли(А)полимеразы и олиго-dT праймеров10. Наконец, экспрессию микроРНК определяют методом qRT-PCR с использованием интеркаляционного красителя10. qRT-PCR позволяет более точно количественно оценить экспрессию генов по сравнению с ПЦР объемов амплификации в конечных точках. qRT-PCR измеряет высокие концентрации и характеризуется широким динамическим диапазоном, что позволяет проводить точную количественную оценку, зависящую от количества циклов. В предыдущих исследованиях сообщалось, что для эффективной очистки и обнаружения микроРНК в тканях можно использовать простые процессы 8,9,10. Описанные в данном протоколе методы синтеза кДНК (обратная транскрипция) и детектирования экспрессии микроРНК с помощью количественной ОТ-ПЦР с использованием интеркаляционного красителя, как сообщается, демонстрируют высокую точность и чувствительность10.

Кроме того, этот протокол прост и позволяет получать стабильные результаты между лабораториями. Поэтому этот протокол полезен в исследованиях, требующих высокоточного и чувствительного обнаружения микроРНК в почках ОПП мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы экспериментов на животных были одобрены комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнены в соответствии с рекомендациями по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства по лабораторным животным Медицинского университета Джичи.

1. Модель IRI

ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за гипотермией, увлажнением кишечника и глубиной анестезии на протяжении всей процедуры.

  1. Подготовьте следующие предметы: центрифужную пробирку объемом 50 мл с ватой, пропитанной изофлураном, нагретую хирургическую прокладку, чашку Петри с фосфатно-соевым буфером (PBS), хирургические ножницы и щипцы. Поддерживайте PBS на уровне 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель IRI была создана с использованием самцов мышей C57BL/6 (9 недель; 20–25 г), содержащихся в помещении с контролируемой температурой, влажностью и 12-часовым циклом света и темноты.
  2. Обезболивайте животное изофлураном: индукционная концентрация 3–5%, поддерживающая концентрация 2–3%, концентрация при пережатии 1–1,5%. Подтвердите глубину обезболивания потерей рефлексов. Преимущество ингаляционной анестезии заключается в том, что время можно регулировать. Процедура может занять значительное количество времени из-за отшелушивания тканей, окружающих почку. Однако недостатком ингаляционной анестезии является то, что температура тела имеет тенденцию к снижению. На протяжении всей процедуры избегайте излишней анестезии.
  3. Закрепите мышь под наркозом на нагретой хирургической прокладке на спине, удалите волосы вокруг области разреза и опрыскайте кожу живота мыши 70% этанолом.
  4. Сделайте разрез по средней линии на коже живота, мышцах и перитонеальной оболочке с помощью ножниц и щипцов.
  5. С помощью ватного тампона, смоченного в PBS, аккуратно надавите на кишечник в сторону левой стороны экстрабрюшной полости, обнажая правую почку и мочеточник. Длительное время процедуры может привести к послеоперационному повреждению кишечника. Таким образом, лучше оперировать без удаления кишечника из брюшной полости, когда можно получить поле зрения. Избегайте пересыхания кишечника. Сухие тампоны или марля могут вызвать повреждение кишечника.
  6. Подтяните правый мочеточник с помощью угловых щипцов. Дважды перевязать правый мочеточник с помощью шелковых швов 4/0. Разрежьте между швами, оставив шов, который находится ближе к почке, дольше.
  7. Аккуратно придерживайте оставшийся шов, не вытягивая слишком сильно, и тупо рассеките соединительную ткань и жир вдоль почки. Проведение операции сзади снижает риск повреждения печени.
    1. Определите кровеносный сосуд, отличный от почечных артерий и вен, который снабжает кровью правую почку, а затем перевязайте или клипируйте его. Когда правая почка достаточно отделена, перевяжите правую почечную артерию и вену с помощью шелкового шва 4/0. Вместо наложения швов используйте кровоостанавливающий зажим.
    2. С помощью ватного тампона, смоченного в PBS, аккуратно протолкните кишечник в сторону правой стороны экстрабрюшной полости, чтобы обнажить левую почку, а затем накройте кишечник увлажненной простыней, чтобы предотвратить ее пересыхание. Рассеките соединительную ткань и жир вокруг левой почки.
  8. Определите кровеносный сосуд, отличный от почечных артерий и вен, который снабжает кровью левую почку, а затем перевязайте или обрежьте его. Зажмите почечную артерию и почечную вену, чтобы вызвать ишемию левой почки. Расположите кровоостанавливающий зажим примерно в 1 см от почки, чтобы избежать повреждения почечной паренхимы. Успешная ишемия может быть визуально подтверждена постепенным равномерным потемнением почки.
  9. Вернуть кишечник в брюшную полость, стараясь не допускать кишечного закручивания; Временно закройте кожу живота и наложите простыню для поддержания влажной среды. Максимально уменьшите концентрацию ингаляционного наркоза и старайтесь держать животное в тепле. Время зажима составляет 25–45 минут. Более длительное время пережатия приводит к более серьезному повреждению почек, но также увеличивает долгосрочную смертность. Скорректируйте, проанализировав результаты патологоанатомического исследования.
  10. Снимите зажим после того, как период ишемии завершится. Следите за тем, чтобы кровоток, реперфузия и цвет почек улучшились. Убедитесь, что кишечник не перекручен, прежде чем закрывать кожу живота. Закапывайте PBS внутрибрюшинно в качестве объемной добавки до того, как живот будет закрыт в два слоя. Закройте кожу живота с помощью нейлоновых швов 4-0. При более длительных периодах удаления почек возможность кишечных спаек может быть снижена путем раздельного закрытия брюшной стенки и брюшины.
  11. Чтобы свести к минимуму риск послеоперационной инфекции, нанесите антисептик (например, раствор йода/спирта) на операционную область.

2. Забор образцов почек

ПРИМЕЧАНИЕ: Это видео имеет время зажима 45 минут, сбор почек через 24 часа.

  1. Обезболить животное 5% изофлураном и подтвердить глубину обезболивания потерей рефлексов.
  2. Сделайте разрез по средней линии на коже живота, мышцах и перитонеальной оболочке с помощью ножниц и щипцов. Соберите кровь из нижней полой вены, проколотой иглой 27 G.
  3. Сделайте разрез по средней линии в грудной стенке и введите иглу 23 G в левый желудочек. Подтвердите обратный поток. Сделайте разрез в печени и введите 20 мл PBS. По мере того, как кровь оттекает, печень меняет цвет с красного на розовый, подтверждая, что было слито достаточное количество крови.
  4. Удалите левую почку с помощью щипцов и ножниц и промойте ее PBS в чашке Петри. Удалите почечную фасцию с помощью щипцов, стараясь не пересушить почку.
  5. Разрежьте почку пополам и используйте одну половину для гистопатологии, а другую половину для следующего этапа. Избегайте почечной лоханки и заготавливайте 30 мг почки. Перед использованием храните при температуре −80 °C.

3. Очистка микроРНК из образцов почек

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь образцы почек весом 30 мг гомогенизируются с помощью стеклянного гомогенизатора и системы измельчения биополимеров в микроцентрифужной спиновой колонне. Затем микроРНК из образца почки выделяют с помощью спиновой колонки на основе кремнеземной мембраны.

  1. Подготовьте следующие изделия: микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл, 100% этанол, хлороформ, стеклянный гомогенизатор, лед, систему измельчения биополимеров в микроцентрифужной спиновой колонне9, спиновые колонки9 на основе кремнеземных мембран, лизисный реагент на основе фенола/гуанидина, промывочный буфер, содержащий гуанидин и этанол (промывочный буфер 1), и промывочный буфер, содержащий этанол (промывочный буфер 2).
  2. Поместите образец почки в дозе 30 мг в стеклянный гомогенизатор и добавьте 700 мкл реагента для лизиса на основе фенола/гуанидина. Выполняйте этот этап на льду, потому что ткань денатурируется под воздействием тепла.
  3. Гомогенизируйте образец почки, медленно надавливая пестиком на образец, поворачивая его. Повторите этот процесс несколько десятков раз на льду до тех пор, пока образец почки полностью не растворится в реагенте для лизиса на основе фенола/гуанидина. Когда при последующих измерениях микроРНК не получаются, это, вероятно, происходит из-за недостаточного растворения.
  4. Для дальнейшей гомогенизации гомогенизированный лизат необходимо перенести в систему измельчения биополимеров в микроцентрифужной спин-колонне, помещенной в сборную пробирку объемом 2,0 мл. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 3 минут при комнатной температуре.
  5. Перенесите гомогенизированный лизат в новую микроцентрифужную пробирку.
  6. Добавьте 140 μл хлороформа в гомогенизированный лизат и надежно закройте пробирку. Перемешиваем пробирку методом инверсии в течение 15 с.
  7. Инкубируйте образцы в течение 2–3 минут при комнатной температуре. Затем центрифугируйте их при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
  8. Перенесите надосадочную жидкость (обычно 300 μл) в новую микроцентрифужную пробирку, не нарушая осадок, и добавьте 1,5 объема (обычно 450 μл) 100% этанола. Перемешиваем образец путем вортексирования в течение 5 с.
  9. Дозируйте до 700 мкл образца в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны, помещенную в пробирку для сбора объемом 2,0 мл. Закройте крышку колонны и центрифугируйте при давлении 15 000 × g в течение 15 с. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
  10. Добавьте 700 мкл промывочного буфера 1 в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны для тщательной промывки образца. Закройте крышку колонки и центрифугируйте ее при давлении 15 000 × г в течение 15 с. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
  11. Добавьте 500 μL промывочного буфера 2 в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны, чтобы удалить любые следы соли. Закройте крышку колонны и центрифугируйте при давлении 15 000 × g в течение 15 с. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
    1. Повторите шаг 3.11.
  12. Снова центрифугируйте спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны при давлении 15 000 × g в течение 1 мин. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
  13. Поместите спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны в новую пробирку для сбора объемом 1,5 мл. Перелейте в колонку 25 μЛ воды, не содержащей РНКазы, и закройте крышку колонки. Оставьте образец при комнатной температуре на 5 минут, а затем центрифугируйте его при 15 000 × г в течение 1 минуты.
  14. Перенесите 25 мкл элюата, содержащего микроРНК, в новую микроцентрифужную пробирку. Поскольку микроРНК разрушается при повторном растворении, рекомендуется дозировать образец в 2 или 3 пробирки. Храните их при температуре −80 °C перед использованием.

4. Обратная транскрипция микроРНК

Примечание: Здесь 1,0 мкг выделенной РНК реверсивно транскрибируется с использованием обратной транскриптазы, поли(А)полимеразы и олиго-dT-праймеров.

  1. Подготовьте следующие предметы: микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл; 8-луночные стрип-трубки; Вода без РНКазы; лёд; смесь нуклеиновых кислот из 10 раз, содержащая дезоксинуклеотиды, рибонуклеотидтрифосфаты и олиго-dT-праймеры; смесь поли(А)полимеразы и обратной транскриптазы; и активирующий буфер, включающий Mg2+, дезоксирибонуклеотиды, олиго-dT-праймеры и случайные праймеры10.
  2. Приготовьте исходный раствор смеси, содержащий 2,0 мкл 10x смеси нуклеиновых кислот, 2,0 мкл смеси поли(А)полимеразы и обратной транскриптазы и 4,0 мкл 5x активирующего буфера, включая Mg2+, дезоксирибонуклеотиды, олиго-dT-праймеры и случайные праймеры, всего 8,0 мкл на пробирку.
  3. Раздайте по 8,0 мкл раствора мастер-смеси в каждую пробирку.
  4. Добавьте в каждую пробирку по 1,0 мкг выделенных микроРНК, выделенных из образца почки.
  5. Добавьте воду, не содержащую РНКазы, в каждую пробирку в общей сложности 20 μл. Тщательно перемешайте с помощью пипетирования и центрифугируйте при 1500 x g в течение 15 с.
  6. Образцы инкубируют в течение 60 мин при 37 °С, после чего немедленно проводят инкубацию в течение 5 мин при 95 °С. Этот этап можно выполнить в термоамплификаторе.
  7. Перенесите кДНК в новую микроцентрифужную пробирку и разбавьте в 10 раз (1:10) водой, не содержащей РНКазы.
  8. Перед применением разведенную кДНК храните в краткосрочном состоянии на льду и в течение длительного времени при температуре -80 °C.

5. qRT-ПЦР микроРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: qRT-ПЦР микроРНК проводится с использованием интеркаляционного красителя. Здесь были использованы праймеры для U6 small nuclear 2 (РНК-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p и miRNA-574-5p.

  1. Подготовьте следующие предметы: микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, 96-луночные реакционные планшеты для qRT-PCR, адгезивную пленку для 96-луночного реакционного планшета, микроРНК-специфичные праймеры, мастер-смесь для ПЦР, состоящую из Taq-ДНК-полимеразы, ПЦР-буфера, дезоксинуклеотидов и универсальных праймеров10, а также прибор для ПЦР в реальном времени.
  2. Приготовьте мастер-смесь, содержащую 12,5 мкл 2x PCR Master Mix, 2,5 мкл каждого праймера микроРНК (5 мкМ), растворенного в воде, не содержащей нуклеаз, и 1,25 мкл 10x универсальных праймеров для каждой лунки.
  3. Дозируйте 22,5 мкл мастер-смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.
  4. Добавьте по 2,5 мкл матричной кДНК в каждую лунку.
  5. Заклейте планшет клейкой пленкой для 96-луночного реакционного планшета. Затем центрифугируйте планшет при давлении 1 000 × г в течение 30 с.
  6. Используя прибор и программное обеспечение для ПЦР в режиме реального времени, запустите циклическую программу ПЦР следующим образом.
    1. Поместите планшет в прибор для ПЦР в реальном времени. Присвойте имя образцу и целевой микроРНК в каждой лунке с помощью программного обеспечения для ПЦР в реальном времени.
    2. Введите следующие условия цикличности ПЦР в программное обеспечение для ПЦР в реальном времени в соответствии с инструкциями: предварительная инкубация при 95 °C в течение 15 минут, затем 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 15 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и продление при 70 °C в течение 30 с.
  7. Анализируйте данные qRT-PCR с помощью программного обеспечения прибора для ПЦР в реальном времени. Проверьте наличие неспецифических реакций. Проанализируйте кривую диссоциации или кривую плавления, чтобы убедиться, что усиления, отличного от запланированного, не произошло.
    1. Нормализовать уровень экспрессии мишенных микроРНК к РНУ-6 в качестве эндогенного контроля. Рассчитали относительный уровень экспрессии мишенных микроРНК с помощью метода 2−ΔΔCT 11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе был исследован профиль экспрессии микроРНК у мышей с ОПП. Профиль экспрессии микроРНК был исследован в различных органах и тканях мышей. МикроРНК являются важными посттранскрипционными регуляторами и в настоящее время широко изучаются для характеристики различных заболеваний, включая ОПП. МикроРНК могут помочь в выяснении патологических состояний и быть применены для лечения ОПП12. Основными причинами ОПП являются ОРИ, нефротоксическое инсульт и сепсис. ИРИ почек представляет собой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С использованием протокола, представленного в данной рукописи, микроРНК из почек мышей IRI были успешно очищены и обнаружены с помощью qRT-PCR. Критические моменты процедуры, индуцирующей ИРИ в протоколе, включают тщательный мониторинг температуры тела и концентраций анестезии, которые, как известно, влияют на ОПП20. Преимущество этого протокола заключается в том, что он позволяет визуально подтвердить, была ли достигнута ишемия-реперфузия. Тем не менее, у этой мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Нама Нгуена, доктора философии, за редактирование черновика этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Изогнутый наконечник Конический пинцет без крючкаNatsume SeisakushoMA-47
Буфер RLTQiagen79216Буфер промывки 1
Буфер RWTQiagen1067933промывочный буфер 2
C57B6 мышиSLCне назначают
щипцы с зубамиNatsume SeisakushoMA-49
щипцы без зубовNatsume SeisakushoMA-48-1
Зажимы кровоостанавливающиеNatsume SeisakushoKN− 353
MicroAmp Optical 96 луночная реакционная пластина для qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-луночная реакционная пластина
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971адгезивная пленка для 96-луночной реакционной пластины
miRNA-132-3p праймерQiagenMS000034585'UAACAGUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p праймерQiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p праймерQiagenMS000315145'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p праймерQiagenMS000038155'UAACAGUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p праймерQiagenMS000090795'UAGCUUAUCAGACUGAUUGUGA
miRNA-223-3p праймерQiagenMS000038715'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCA
микроРНК-574-5p праймерQiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGUGUGUGU
miRNeasy Mini kitQiagen217004кремнеземную мембрану на основе спиновой колонки
miScript II RT kitQiagen218161
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073
QIA измельчительQiagen79654биополимерно-измельчительная система в микроцентрифуге, спин-колонна
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306на основе фенола/гуанидина на основе лизиса
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systemThermo Fisher Scientific4472380прибор для ПЦР в реальном времени
QuantStudio 12K Flex Software версии 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380программное обеспечение для ПЦР в реальном времени
RNU6-2 праймерQiagenMS00033740не раскрыты
хирургические ножницыNatsume SeisakushoB-2
Vascular clip applierVITALITEC1621420

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, K. J. Acute renal failure: much more than a kidney disease. Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).
  2. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clinical Chemistry. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  3. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  4. Yang, G., et al. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. Journal of Surgical Oncology. 111 (8), 992-999 (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinial Medicine. 169, 47-66 (2016).
  9. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  10. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  11. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  12. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).
  13. Ichii, O., Horino, T. MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).
  14. Ma, L., et al. Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).
  15. Saikumar, J., et al. Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury. Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).
  16. Li, Y. F., et al. MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury. Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).
  17. Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing. Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).
  18. Liu, Y., et al. MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury. Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).
  19. Colbert, J. F., et al. A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).
  20. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи