Методическая статья

Доклиническая контролируемая модель кортикального воздействия при травматическом кровоизлиянии, контузии и нейровоспалении

DOI:

10.3791/61393

⸱

10 июня 2020 г.

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Cheng Hsin General Hospital, 2Graduate Institute of Physiology, College of Medicine, National Taiwan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутрипаренхиматозное кровоизлияние и нейровоспаление, сопровождающиеся ушибом головного мозга, могут спровоцировать тяжелое вторичное повреждение головного мозга. В этом протоколе подробно описывается модель контролируемого кортикального воздействия (CCI) у мышей, что позволяет исследователям изучать кровоизлияние, ушиб и посттравматические иммунные реакции, а также изучать потенциальные методы лечения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ушиб головного мозга – это серьезная медицинская проблема, с которой ежегодно сталкиваются миллионы людей во всем мире. Существует острая необходимость в понимании патофизиологического механизма и разработке эффективной терапевтической стратегии для этого разрушительного неврологического расстройства. Внутрипаренхиматозное кровоизлияние и посттравматическая воспалительная реакция, вызванные первоначальным физическим воздействием, могут усугубить активацию микроглии/макрофагов и нейровоспаление, что впоследствии усугубит патологию головного мозга. Здесь мы предлагаем протокол контролируемого коркового воздействия (CCI), который может воспроизвести экспериментальную корковую контузию у мышей с помощью пневматической ударной системы для доставки механической силы с контролируемой величиной и скоростью на твердую мозговую поверхность. Эта доклиническая модель позволяет исследователям индуцировать умеренно тяжелую фокальную контузию головного мозга у мышей и исследовать широкий спектр посттравматических патологических прогрессий, включая ушиб кровоизлияния, активацию микроглии/макрофагов, токсичность железа, аксональное повреждение, а также краткосрочные и долгосрочные нейроповеденческие дефициты. Настоящий протокол может быть полезен для изучения долгосрочных последствий и потенциальных вмешательств при ушибе головного мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ушиб головного мозга — это форма черепно-мозговой травмы, которая занимает одно из первых мест среди самых смертоносных проблем со здоровьем в современном обществе1. В первую очередь это вызвано случайными событиями, такими как дорожно-транспортное происшествие, в результате которого внешние силы прикладывают механическую энергию к голове. Черепно-мозговая травма затрагивает около 3,5 миллионов человек и составляет 30% всех смертей, связанных с острыми травмами, в США каждыйгод2. Пациенты, пережившие ушиб головного мозга, часто страдают от долгосрочных последствий, включая очаговую моторную слабость, сенсорную дисфункцию и психические заболевания1.

Первичная травма при ушибе головного мозга вызвана механическими факторами, включая растягивающие и разрывающие силы, что приводит к немедленной деформации паренхиматозной структуры и очаговой гибели клеток ЦНС3. Ушиб кровоизлияния является общим термином для обозначения кровоизлияния в мозг из-за разрыва сосуда в месте травмы головы4. В частности, внутрипаренхиматозное кровоизлияние происходит сразу после ушиба головного мозга, что приводит к задержке формирования гематомы. В пределах гематомы гемоглобин и свободное железо, высвобождаемые из лизированных эритроцитов, могут в дальнейшем вызывать токсичность, связанную с кровью 5,6, которая вызывает грыжу, отек мозга и повышение внутричерепного давления 5,6. Коллаборативные функции нейронов (аксонов), глии, кровеносных сосудов и поддерживающих тканей также нарушаются масс-эффектом гематомы. Кроме того, стойкое и диффузное нейровоспаление с прогрессирующей нейродегенерацией продолжается в течение нескольких месяцев и вызывает вторичное повреждение мозга8.

Активация микроглии является одним из многих важных патологических признаков ушиба головного мозга 9,10. После обнаружения молекулярных паттернов, связанных с повреждением (DAMP), и утечки крови в поврежденных тканях, активированная микроглия запускает нейровоспаление, которое способствует вторичномуповреждению головного мозга. Кроме того, хемоаттрактант, высвобождаемый из микроглии, способствует инфильтрации периферических иммунных клеток в травматическую территорию, что приводит к образованию активных форм кислорода и провоспалительных цитокинов. Это создает самовоспроизводящуюся провоспалительную среду, которая вызывает прогрессирующее повреждение головного мозга 9,12. Между тем, микроглия с альтернативно активированным фенотипом может способствовать гомеостатическому восстановлению тканей и восстановлению мозга за счет очистки поврежденныхтканей от мусора. Было показано, что профилактика вторичного нейровоспаления путем снижения вредных микроглиальных иммунных реакций особенно полезна для ускорения восстановления мозга после ушиба головного мозга 3,9,10,12.

Для изучения черепно-мозговой травмы было разработано несколько доклинических моделей, включая модель падения веса, ударную травму латеральной жидкости и модель взрывной волны14,15. Тем не менее, каждая из этих моделей имеет свои слабые стороны, включая высокий уровень смертности во время процедуры, низкую воспроизводимость гистологических результатов и высокую вариабельность нанесенных повреждений между лабораториями16,17. Для сравнения, модель контролируемого коркового воздействия (ЧКВ) более адекватна для изучения фокальной мозговой контузии из-за ее точного контроля и высокой воспроизводимости 14,15,18,19.

Кроме того, манипулируя параметрами биомеханической деформации, такими как скорость и глубина удара, тяжесть индуцированного повреждения может контролироваться для создания широкого диапазона величин травмы, что позволяет исследователям имитировать различные уровни нарушений, часто наблюдаемые у пациентов17. Доклиническая модель ЧМЛ была впервые разработана в 189620 году. С тех пор CCI является самой широко применимой моделью, которая может быть модифицирована для использования на приматах21, свиньях22, овцах23, крысах24 и мышах25. В совокупности эти особенности делают CCI одной из наиболее подходящих экспериментальных моделей ушиба головного мозга26.

В нашей лаборатории используется коммерчески доступная пневматическая ударная система ЧМТ и испытаны биомеханические параметры деформации для получения умеренно тяжелого очагового ушиба головного мозга, который территориализует первичные сенсорные и моторные области коры головного мозга без повреждения гиппокампа27,28. Мы и другие продемонстрировали, что эта процедура может быть использована для изучения клинических особенностей ушиба головного мозга человека, включая потерю мозговой ткани, повреждение нейронов, внутрипаренхиматозное кровоизлияние, нейровоспаление и сенсомоторный дефицит 24,25,27,28,29,30 . Здесь мы подробно описываем стандартный протокол проведения ЧМТ у мышей, который позволяет задавать вопросы о вызванной ЧМТ потере миелина, отложении железа, воспалении ЦНС, геморрагической токсичности и реакциях микроглии/макрофагов после фокального ушиба головного мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были проведены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в больнице общего профиля Cheng Hsin и Медицинском колледже Национального университета Тайваня. В этом протоколе использовались 8-10-недельные самцы мышей дикого типа C57BL/6.

1. Индукция анестезии

  1. Обезболивайте мышь ~4% изофлураном, смешанным с комнатным воздухом со скоростью ~0,2 л/мин в индукционной камере, подключенной к истрофуорезу изофлурана.
  2. Следите за тем, чтобы дыхание было ровным. Проверьте глубину анестезии, подтвердив отсутствие у животного рефлекса на пальце ноги.

2. Предоперационная подготовка

  1. Побрейте головку мыши электрическими машинками для стрижки в каудальном и ростральном направлении. Не обрезайте усы мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потеря усов может повлиять на точность результатов последующих поведенческих тестов.
  2. Поместите мышь на стереотаксическую рамку. Осторожно вставьте ушные планки в ушные каналы. Убедитесь, что головка мыши одинаково стабилизирована обеими ушными планками.
  3. Введите носовой конус и поддерживайте анестезию на уровне 1% - 2% изофлурана в течение всей операции.
  4. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание во время операции. Держите животное на грелке, чтобы поддерживать температуру тела 37 °C.
  5. Продезинфицируйте бритую голову бетадином с последующим добавлением 70% спирта с помощью стерильных ватных тампонов. Повторите три раза.

3. Хирургия ЧМЛ

  1. Введите 100 мкл бупивакаина (0,25%) подкожно с помощью иглы инсулина 31 г перед разрезом. Аккуратно помассируйте место инъекции для лучшего впитывания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот местный анестетик обеспечивает облегчение боли непосредственно в месте операции.
  2. Сделайте продольный разрез (~1,5 см) по средней линии на волосистой части головы с помощью скальпеля или ножниц. С помощью кровоостанавливающего средства удерживайте кожу на правой стороне и дайте обнаженному черепу высохнуть в течение 1 минуты. Используйте стерильный ватный тампон, чтобы удалить остатки крови и тканей на черепе.
  3. Убедитесь, что головка мыши находится на уровне горизонтальной плоскости.
    1. Определите анатомические ориентиры Брегма и Лямбда и отметьте оба места стерильным хирургическим маркером/карандашом.
    2. Следите за тем, чтобы голова животного находилась на одном уровне в рострально-каудальном направлении. Это можно сделать, измерив Z-координаты Брегмы и Лямбды с помощью инсулиновой иглы 31 G, прикрепленной к стереотаксической рамке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте ушную планку по вертикали.
    3. Выполните горизонтальное положение головы животного, следуя той же процедуре, проверив координаты Z на средней линии вместе с двумя соответствующими местами слева и справа от средней линии, и при необходимости отрегулируйте ушные планки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ровное и стабильное положение головы животного имеет решающее значение для воспроизводимости и надежности модели CCI.
  4. Используйте ту же иглу инсулина 31 г для определения места краниэктомии. Установите начало координат XY на Брегму и сдвиньте иглу на 3 мм вправо. Отметьте это место как место краниэктомии и нарисуйте стерильным хирургическим маркером/карандашом круг диаметром 4 мм на черепе.
  5. С помощью высокоскоростного микросверла с трепаном (диаметром 4 мм) разрежьте вдоль обведенного карандашом круга, чтобы создать открытое отверстие диаметром 4 мм. Используйте настройку скорости 20 000 об/мин. Избегайте чрезмерного давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг быстро (обычно в течение от 30 секунд до 1 минуты), чтобы предотвратить термическое повреждение мозга. Чрезмерное давление во время сверления может привести к случайному проникновению, которое может сдавить и повредить поверхность мозга.
  6. Осторожно снимите костный лоскут с помощью пинцета и временно храните его в ледяном обычном физрастворе. Аккуратно промойте отверстие обычным физиологическим раствором, прежде чем надавливать на поверхность мозга кончиком ватного тампона, чтобы остановить кровотечение.
  7. Установите закругленный наконечник ударного элемента диаметром 2,5 мм на устройстве CCI под углом 22,5°. Пристрелите ударный наконечник к дюралевой поверхности. Установите параметры удара на блоке управления со скоростью 4 м/с и глубиной деформации 2 мм. Втяните металлический наконечник.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обнуление наконечника, когда он статически и слегка прижат к твердой поверхности в положении полного хода, улучшает точность нулевой точки и воспроизводимость уровня травмы.
  8. Разрядите поршень, чтобы создать удар по мозгу. Приложите стерильный ватный тампон к травмированному участку, чтобы остановить кровотечение.
  9. Поместите костный лоскут обратно в мозг мыши и закрепите стоматологическим цементом. Закройте кожу головы тканевым клеем (например, 3M Vetbond).

4. Послеоперационное восстановление

  1. Поместите мышь в чистую клетку для восстановления с подстилкой под тепловую лампу до полного восстановления.
  2. Обеспечьте увлажненный корм и подкожно вводите кетопрофен (5 мг/кг) в течение двух дней подряд после операции.
  3. Выполните вышеуказанные процедуры, за исключением шагов 3.7 и 3.8 для фиктивных контрольных животных.

5. Эвтаназия мышей

  1. Усыпляют мышей в день исследования путем передозировки изофлурана и последующей обезглавливания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для усыпления подопытных животных перед сбором образцов можно использовать несколько стратегий.
  2. Соберите образцы мозга для гистологического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иллюстрация стереотаксической установки и процедуры трепанации черепа.

Модель CCI известна своей стабильностью и воспроизводимостью при нанесении травм в диапазоне от легких до тяжелых18. Правильная стереотаксическая техника и процедура трепанации черепа являются основными определяющими факторами в создании стабильного и воспроизводимого повреждения головного мозга, вызванного ЧМТ (Рисунок 1A, B). Идеальная...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол CCI позволяет получить высоковоспроизводимую механическую травму головного мозга для исследования ушиба головного мозга. Следующие шаги имеют решающее значение для возникновения устойчивых повреждений головного мозга у животных с использованием этого протокола CCI.

Во-первых, головка мыши должна быть устойчиво закреплена на стереотаксической раме, а анатомические ориентиры Брегма и Лямбда всегда должны находиться в одной горизонтальной плоскости. Неус...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Данье Цзяна за редактирование рукописи и проницательный вклад. Мы благодарим Джих Сюань Линя за помощь в подготовке рукописи. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 107-2320-B-002-063-MY2) компанией C.F.C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4 мм короткая трепан бормашинаSalvin Dental Specialties, Inc.TREPH-SHORT-4
анти-Iba1 антителоWako chemicals#019-19741
анти-Ly76 антителоabcamab91113
карбоксилатный цемент3M70201136010
кортикальная контузия ударный элементИндивидуальный дизайн & Fabrication, Inc.S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3CCI device (S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3)
cresyl violet ацетатSigma-AldrichC5042
DAB набор для окрашиванияVectorSK-4105
козий против кролика IgG вторичное антитело, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
козий против крыс IgG вторичное антитело, Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Mayer's HematoxylinScyTekHMM500
пинцетдля тонкой науки инструменты11252-20 NO. 5
изофлуранPanion & BF Biotech Inc.
Бупивакаин 0,25%Хоспира
карбонат литияSigma-Aldrich62470
стериотексическая рамадля тонкой
наукиинструменты 14068-12
растворитель синий 38Sigma-AldrichS3382
ножницы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16 (12), 987-1048 (2017).
  2. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 66 (9), 1-16 (2007).
  3. Pearn, M. L., et al. Pathophysiology Associated with Traumatic Brain Injury: Current Treatments and Potential Novel Therapeutics. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (4), 571-585 (2017).
  4. Nyanzu, M., et al. Improving on Laboratory Traumatic Brain Injury Models to Achieve Better Results. International Journal of Medical Sciences. 14 (5), 494-505 (2017).
  5. Zhao, M., et al. Iron-induced neuronal damage in a rat model of post-traumatic stress disorder. Neuroscience. 330, 90-99 (2016).
  6. Cepeda, S., et al. Contrecoup Traumatic Intracerebral Hemorrhage: A Geometric Study of the Impact Site and Association with Hemorrhagic Progression. Journal of Neurotrauma. 33 (11), 1034-1046 (2016).
  7. Robicsek, S. A., Bhattacharya, A., Rabai, F., Shukla, K., Dore, S. Blood-Related Toxicity after Traumatic Brain Injury: Potential Targets for Neuroprotection. Molecular Neurobiology. 57 (1), 159-178 (2020).
  8. Morganti-Kossmann, M. C., Semple, B. D., Hellewell, S. C., Bye, N., Ziebell, J. M. The complexity of neuroinflammation consequent to traumatic brain injury: from research evidence to potential treatments. Acta Neuropathologica. 137 (5), 731-755 (2019).
  9. Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70 (3), 374-383 (2011).
  10. Wang, G. H., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864-1874 (2013).
  11. Karve, I. P., Taylor, J. M., Crack, P. J. The contribution of astrocytes and microglia to traumatic brain injury. British Journal of Pharmacology. 173 (4), 692-702 (2016).
  12. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
  13. Russo, M. V., McGavern, D. B. Inflammatory neuroprotection following traumatic brain injury. Science. 353 (6301), 783-785 (2016).
  14. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  15. Johnson, V. E., Meaney, D. F., Cullen, D. K., Smith, D. H. Animal models of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. 127, 115-128 (2015).
  16. Albert-Weissenberger, C., Siren, A. L. Experimental traumatic brain injury. Experimental & Translational Stroke Medicine. 2 (1), 16(2010).
  17. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal Models of Traumatic Brain Injury and Assessment of Injury Severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  18. Osier, N. D., Korpon, J. R., Dixon, C. E. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
  19. Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7, 134(2016).
  20. Kramer, S. P. A Contribution to the Theory of Cerebral Concussion. Annals of Surgery. 23 (2), 163-173 (1896).
  21. King, C., et al. Brain temperature profiles during epidural cooling with the ChillerPad in a monkey model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 27 (10), 1895-1903 (2010).
  22. Costine, B. A., et al. Neuron-specific enolase, but not S100B or myelin basic protein, increases in peripheral blood corresponding to lesion volume after cortical impact in piglets. Journal of Neurotrauma. 29 (17), 2689-2695 (2012).
  23. Anderson, R. W., Brown, C. J., Blumbergs, P. C., McLean, A. J., Jones, N. R. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. Journal of Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
  24. Chen, S., Pickard, J. D., Harris, N. G. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Experimental Neurology. 182 (1), 87-102 (2003).
  25. Lee, H. F., Lin, J. S., Chang, C. F. Acute Kahweol Treatment Attenuates Traumatic Brain Injury Neuroinflammation and Functional Deficits. Nutrients. 11 (10), 2301(2019).
  26. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
  27. Hung, T. H., et al. Deletion or inhibition of soluble epoxide hydrolase protects against brain damage and reduces microglia-mediated neuroinflammation in traumatic brain injury. Oncotarget. 8 (61), 103236-103260 (2017).
  28. Wu, C. H., et al. Post-injury treatment with 7,8-dihydroxyflavone, a TrkB receptor agonist, protects against experimental traumatic brain injury via PI3K/Akt signaling. PLoS One. 9 (11), 113397(2014).
  29. Chen, S. F., Su, W. S., Wu, C. H., Lan, T. H., Yang, F. Y. Transcranial Ultrasound Stimulation Improves Long-Term Functional Outcomes and Protects Against Brain Damage in Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55 (8), 7079-7089 (2018).
  30. Su, W. S., Wu, C. H., Chen, S. F., Yang, F. Y. Low-intensity pulsed ultrasound improves behavioral and histological outcomes after experimental traumatic brain injury. Scientific Reports. 7 (1), 15524(2017).
  31. Chen, S. F., et al. Salidroside improves behavioral and histological outcomes and reduces apoptosis via PI3K/Akt signaling after experimental traumatic brain injury. PLoS One. 7 (9), 45763(2012).
  32. Chen, C. C., et al. Berberine protects against neuronal damage via suppression of glia-mediated inflammation in traumatic brain injury. PLoS One. 9 (12), 115694(2014).
  33. Furmanski, O., Nieves, M. D., Doughty, M. L. Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells. Journal of Visualized experiments. (149), e59561(2019).
  34. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized experiments. (90), e51781(2014).
  35. Saatman, K. E., Feeko, K. J., Pape, R. L., Raghupathi, R. Differential behavioral and histopathological responses to graded cortical impact injury in mice. Journal of Neurotrauma. 23 (8), 1241-1253 (2006).
  36. Robertson, C. L., et al. Cerebral glucose metabolism in an immature rat model of pediatric traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (24), 2066-2072 (2013).
  37. Adelson, P. D., Fellows-Mayle, W., Kochanek, P. M., Dixon, C. E. Morris water maze function and histologic characterization of two age-at-injury experimental models of controlled cortical impact in the immature rat. Child's Nervous System. 29 (1), 43-53 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи