Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений

Summary

Этот метод демонстрирует использование метода северной гибридизации для обнаружения miRNAs от общего экстракта РНК.

Abstract

МикроРНК (miRNAs) являются классом эндогенно выраженных некодирующих, 21 nt малых РНК, участвующих в регуляции экспрессии генов как у растений, так и у животных. Большинство миРНК действуют как отрицательные переключатели экспрессии генов, нацеленные на ключевые гены. В растениях первичные миРНК (pri-miRNAs) транскрипты генерируются РНК-полимеразой II, и они образуют различную длину стабильных структур стволовых циклов, называемых премиРНА. Эндонуклеазы, Dicer-like1, обрабатывает премиРНК в дуплексы миРН-миРНАЗ. Одна из нитей из дуплекса miRNA-miRNA выбирается и загружается на белок Argonaute 1 или его омологи, чтобы остеклеть расщепление мРНК. Хотя миРНК являются ключевыми сигнальными молекулами, их обнаружение часто осуществляется менее оптимальными методами на основе ПЦР вместо чувствительного северного анализа помарки. Мы описываем простой, надежный и чрезвычайно чувствительный северный метод, который идеально подходит для количественной оценки уровней миРНК с очень высокой чувствительностью, буквально из любой ткани растений. Кроме того, этот метод может быть использован для подтверждения размера, стабильности и обилия miRNAs и их предшественников.

Introduction

Недавнее открытие небольших регуляторных РНК, микроРНК, привело исследования в понимании их и их роль в растениях и животных¹. Длинные прекурсоры miRNAs обрабатываются в 21 до 24 nt зрелых miRNAs HYL1 и конкретных dicer-как белки^2,3. 22 nt miRNA может инициировать каскадное заглушение, генерируя вторичные siRNAs^4. Исследования показали роль miRNAs и вторичных siRNAs в развитии, судьба клеток и стресс ответы^5,6.

Северная гибридизация является экспериментальным методом, обычно ис....

Protocol

1. Приготовление 15% денатурированного полиакриламида гель

1. Взвешивать и добавлять 4,8 г мочевины, добавить 3,75 мл 40% акриламида: бисакриламид (19:1) раствор и 1 mL 10x TBE pH 8.2 в стерильную трубку 50 мл.
2. Растворите мочевину с помощью водяной ванны, установленной при 60 градусов по Цельсию, в четкий раствор.
3. Макияж объема до 10 мЛ с использованием свежеавтонатуренной стерильной воды и охладить гель смесь до комнатной температуры.
4. Приготовьте свежий 10% (w/v) раствор аммония персульфата.

2. Сборка стеклянных пластин и электрофорезного блока

1. Вымойте весь аппарат, необходимый для геля ....

Results

В этой демонстрации, мы обнаружили и количественно выражение miR397 в различных тканях риса Indica var whiteponni (Рисунок 1). miR397 является 22 nt miRNA и сохраненной миРНК. Выражение miR397 можно обнаружить во всех проверенных образцах. Согласно данным секвенирования следующего поколения, образец 1 (саженная ткань) имеет miR397 на 5 считываний на миллион (об/мин). Мы обнаружили его сигнал удобно, указывая, что метод является очень чувствительным и может быть использован .......

Discussion

Этот метод может широко использоваться для обнаружения и количественной оценки малых РНК, включая менее обильные миРНК. Протокол в основном описывает шаги для денатурации общей РНК в погрузочном буфере, разделение размера гелевым электрофорезом, перенос РНК к мембране, перекрестная связь РНК с мембраной и гибридизация с помощью желаемых радиомаркированных олиго зондов.

Критическим шагом для любого эксперимента по blotting является использование РНК хорошего качества для подготовки образца. Пер.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% Акриламид-бисакриламидный раствор	Sigma	A9926
Персульфат аммония (APS)	BioRad	1610700
Промокательная бумага	ватман промокательная бумага I	1001-125
Бромфеноловый синий	Sigma	B5525-5G Наконечники
загрузки капилляров	BioRad	2239915
деионизированные формамид	Ambion	AM9342
Нагревательный блок	Eppendorff	5350
Hybond N+нейлоновая мембрана	GE	RPN203B
Гибридизационный флакон	Sigma	Z374792-1EA
Гибридизационная печь	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- Сканер Typhoon	29187194
экраном и кассетой PhosphorImager	GE healthcare	GE28-9564-75
Пипетки	Gilson, модели: P20 и P10	FA10002M, FA10003M
Пластиковая пипетка	Falcon	357550
Полиакриламидный гелевый аппарат	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 колонка	GE здравоохранение	27532501
Speed Vac концентратор	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 Полинуклеотидкиназа (PNK)	NEB	M0201S
Трансблот аппарат	BioRad	1703946
ULTRAHyb буфер для гибридизации	Ambion	AM8670
Мочевина	Fischer Scientific	15985
UVP-сшиватель	UVP	CL-1000L
Vortex	Tarsons	3020
Водяная баня	NEOLAB	D-8810
Ксилолцианол	Sigma	X4126-10G