Методическая статья

Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений

DOI:

10.3791/61394

⸱

11 июля 2020 г.

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2SASTRA University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод демонстрирует использование метода северной гибридизации для обнаружения miRNAs от общего экстракта РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МикроРНК (miRNAs) являются классом эндогенно выраженных некодирующих, 21 nt малых РНК, участвующих в регуляции экспрессии генов как у растений, так и у животных. Большинство миРНК действуют как отрицательные переключатели экспрессии генов, нацеленные на ключевые гены. В растениях первичные миРНК (pri-miRNAs) транскрипты генерируются РНК-полимеразой II, и они образуют различную длину стабильных структур стволовых циклов, называемых премиРНА. Эндонуклеазы, Dicer-like1, обрабатывает премиРНК в дуплексы миРН-миРНАЗ. Одна из нитей из дуплекса miRNA-miRNA выбирается и загружается на белок Argonaute 1 или его омологи, чтобы остеклеть расщепление мРНК. Хотя миРНК являются ключевыми сигнальными молекулами, их обнаружение часто осуществляется менее оптимальными методами на основе ПЦР вместо чувствительного северного анализа помарки. Мы описываем простой, надежный и чрезвычайно чувствительный северный метод, который идеально подходит для количественной оценки уровней миРНК с очень высокой чувствительностью, буквально из любой ткани растений. Кроме того, этот метод может быть использован для подтверждения размера, стабильности и обилия miRNAs и их предшественников.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавнее открытие небольших регуляторных РНК, микроРНК, привело исследования в понимании их и их роль в растениях и животных1. Длинные прекурсоры miRNAs обрабатываются в 21 до 24 nt зрелых miRNAs HYL1 и конкретных dicer-как белки2,3. 22 nt miRNA может инициировать каскадное заглушение, генерируя вторичные siRNAs4. Исследования показали роль miRNAs и вторичных siRNAs в развитии, судьба клеток и стресс ответы5,6.

Северная гибридизация является экспериментальным методом, обычно используемым для обнаружения конкретных молекул РНК. Этот метод настраивает его использование в обнаружении примерно 19 -24 nt длинных малых РНК из пула общего RNAs7. В этой демонстрации мы иллюстрируем использование этого метода для обнаружения и количественной оценки миРНК. Этот метод использует маркировку зондов с использованием радиоизотопов; таким образом, уровни миРНК в образце могут быть обнаружены с повышенной чувствительностью. В отличие от методов на основе ПЦР, этот метод обеспечивает количественную оценку экспрессии, а также определение размера miRNAs. В этом протоколе мы показываем важные шаги, которые улучшают обнаружение miRNA. Мы модифицировали шаги в blotting и гибридизации для получения высокого разрешения обнаружения сигнала miRNAs. Этот метод также может быть использован для обнаружения других эндогенных малых РНК, таких как siRNAs, tasi-вторичных РНК и snoRNAs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление 15% денатурированного полиакриламида гель

  1. Взвешивать и добавлять 4,8 г мочевины, добавить 3,75 мл 40% акриламида: бисакриламид (19:1) раствор и 1 mL 10x TBE pH 8.2 в стерильную трубку 50 мл.
  2. Растворите мочевину с помощью водяной ванны, установленной при 60 градусов по Цельсию, в четкий раствор.
  3. Макияж объема до 10 мЛ с использованием свежеавтонатуренной стерильной воды и охладить гель смесь до комнатной температуры.
  4. Приготовьте свежий 10% (w/v) раствор аммония персульфата.

2. Сборка стеклянных пластин и электрофорезного блока

  1. Вымойте весь аппарат, необходимый для геля электрофорез и электро-blotting с моющим средством. Аккуратно скраб их с помощью мягкой губкой, чтобы удалить остаточный буфер и акриламид, промыть водой и дать им высохнуть.
  2. Соберите оба стеклянные пластины вместе и поместите их твердо на губку. Используйте 1 мм толщиной пластины для этой установки. Убедитесь, что пластины находятся на том же уровне, чтобы избежать утечки.
  3. К 10 мл геля смеси добавьте 8 МЛ TEMED и 80 мл свежеприготовленного 10% (w/v) раствор аммония.
  4. Без промедления, аккуратно перемешать и залить это между собранными стеклянными пластинами. Поместите гребень тщательно. Избегайте генерации пузырьков воздуха на этом этапе.
  5. Разрешить гель полимеризировать в течение примерно 45 мин.
  6. Вымойте полимеризованный гель с стерильной водой, прежде чем поместить внутри гель работает установки.
  7. Соберите пластины внутри бегущей кассеты и аккуратно снимите гребень.
  8. Налейте свежеприготовленные стерильные 1x TBE, рН 8.2 в бак.
  9. Тщательно вымойте колодцы, трубив буфер для удаления кристаллов соли. Этот шаг помогает образцу РНК работать равномерно через гель.
  10. Выполните предварительный запуск на 80 V в течение 30 минут.

3. Подготовка погрузочного красителя и образцов

  1. Для 10 мл гель нагрузки красителя, весить 5 мг бромофено голубого, 5 мг ксилен цианола, добавить 10 мл деионированного формамида тщательно и хорошо перемешать их.
  2. Aliquot 10 мкг общей РНК в стерильную трубку 1,5 мл и высушите образцы с помощью speedvac. Не переувяхайте образцы.
  3. Повторное увеличение образцов РНК в 8 мл загрузки.
  4. Нагрейте образцы при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 2 минут, охладите в течение 1 мин на RT, вихрь и спина образцов, в течение 3 раз. Этот шаг необходим для правильной резусения и, в свою очередь, это помогает в равной загрузке образцов.

4. Гель электрофорез

  1. Остановить предварительное запуск и вымыть скважины перед загрузкой образца.
  2. Нагрейте образцы при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 1 мин и загрузите образцы горячими в колодец с помощью капиллярных наконечников. Вставьте кончик на дно колодца, чтобы образец занимал один тонкий слой в колодце.
  3. Полная загрузка всех образцов. Включите для загрузки маркера десятилетия РНК.
  4. Выполнить гель на 80 В до бромофенола синий краситель работает почти полностью. Бромофенол синий работает на 10 bp в 15% денатурации акриламид гель.

5. Подготовка к электро-размыву

  1. Вырежьте НЗюлоновую мембрану до размеров стеклянной пластины и отметьте мембрану в правом верхнем углу карандашом HB.
  2. Аккуратно поместите мембрану на поверхность стерильной воды, обращенной к обозначенной стороне к поверхности воды. Предварительно замочите мембрану в течение 15 мин.
  3. Вырезать 4 куска промокания бумаги я в размерах волокна площадку.
  4. Приготовьте сэндвич с гелем для размещения серой стороны кассеты в чистый лоток.
  5. Предварительно промокнуть волокна площадку и поместите его на кассету. Удалите пузырьки воздуха.
  6. Предварительно мокрый один кусок пятно бумаги в 1x TBE и место над волокна площадку. Удалите пузырьки воздуха, прокатки пластиковый пипетки над бумагой. Положите еще один кусок предварительно мокрой промокальной бумаги и удалить пузырьки воздуха.
  7. Тщательно удалите гель из беговой кассеты и поместите его над сэндвич установки, таким образом, что первый загруженный образец РНК вправо.
  8. Аккуратно окуните предварительно пропитанную мембрану в 1x TBE и поместите ее на гель, стоящие перед маркированной стороной вниз. Раскатать, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  9. Опустите кусок промокания бумаги, положите его на мембрану и удалите пузырьки воздуха. Dip еще один кусок blotting бумаги, поместите его на сэндвич установки и удалить пузырьки воздуха.
  10. Заполните сэндвич, поместив предварительно мокрый волокна площадку над установкой и твердо закрыть кассету.
  11. Поместите трансблот кассету в модуль и заполните 1x TBE, рН 8.2 до знака промокания.
  12. Трансфер при 10 В, ночь при 4 градусах Цельсия.
  13. После передачи поместите влажную мембрану на бумажный лист и немедленно перекрещиваем РНК к мембране путем облучения 254-нм УФ-излучением (120 000 юулов/см2). Кросс-связанные помарки, возможно, хранятся при 4 градусов по Цельсию для дальнейшей гибридизации.

6. Подготовка радиомаркированного зонда

  1. Дизайн зонда, который полностью дополняет небольшой РНК, которая должна быть обнаружена.
  2. Конец этикетки зонда с использованием ƳP32ATP (получено из BRIT) в конце 5' путем объединения компонентов в соответствии с рецептом, представленным в таблице 1.
  3. Инкубировать вышеупомянутую реакцию смеси при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
  4. Отдельные немаркированные ƳP32АТФ от зонда с помощью колонки Sephadex G-25 в соответствии с протоколом производителя.

7. Гибридизация помарки

  1. Поместите скрещенные связаны пятно, РНК стороны перед верхней внутри бутылки гибридизации.
  2. Энергично смешайте сверхчувствительный буфер гибридизации, добавьте 10 мл и инкубировать пятно внутри печи гибридизации, поддерживаемой при температуре 35 градусов по Цельсию, с вращением.
  3. Выполните до гибридизацию в течение 20 мин.
  4. Выньте бутылку из духовки и аккуратно добавьте маркированный зонд в буфер гибридизации.
  5. Гибридизируйте помарку при 35 градусов по Цельсию, с вращением на 12 ч.
  6. После гибридизации тщательно перенесите раствор гибридизации в 15-мл-трубу. Это решение может храниться при 4 градусах цельсия до повторного использования.
  7. Выполните быструю стирку помарки в течение 2 минут, чтобы удалить избыток решения гибридизации, добавив 2x буфер SSC плюс 0,5% SDS. Откажитесь от решения.
  8. Инкубировать пятно с 2x буфером SSC плюс 0,5% SDS для 35 градусов по Цельсию, с вращением в течение 30 мин.
  9. Вымойте пятно снова с 0,5x SSC буфер плюс 0,5% SDS для 35 "C, с вращением в течение 30 мин.
  10. Поместите пятно внутри крышки гибридизации, удалите избыточный буфер и запечатайте его.
  11. Подвергнуть его радиации свободного фосфора изображения экрана на ночь внутри кассеты.
  12. Обнаружить сигнал гибридизации с помощью биомолекулярного изображения и проанализировать результаты с помощью подходящего программного обеспечения.
  13. Полоса пятно путем инкубации его при 80 градусов по Цельсию, с вращением в течение 30 мин с 0,5 X SSC буфер плюс 0,1% SDS и 0,1 X SSC буфер плюс 0,1% SDS в течение 30 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой демонстрации, мы обнаружили и количественно выражение miR397 в различных тканях риса Indica var whiteponni (Рисунок 1). miR397 является 22 nt miRNA и сохраненной миРНК. Выражение miR397 можно обнаружить во всех проверенных образцах. Согласно данным секвенирования следующего поколения, образец 1 (саженная ткань) имеет miR397 на 5 считываний на миллион (об/мин). Мы обнаружили его сигнал удобно, указывая, что метод является очень чувствительным и может быть использован ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод может широко использоваться для обнаружения и количественной оценки малых РНК, включая менее обильные миРНК. Протокол в основном описывает шаги для денатурации общей РНК в погрузочном буфере, разделение размера гелевым электрофорезом, перенос РНК к мембране, перекрестная связь РНК с мембраной и гибридизация с помощью желаемых радиомаркированных олиго зондов.

Критическим шагом для любого эксперимента по blotting является использование РНК хорошего качества для подготовки образца. Пер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликта интересов не декларии.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают доступ к радиационной лаборатории, предоставленной принимающим институтом и BRIT для радиоизотопа. Лаборатория ПВС поддерживается Национальным центром биологических наук, Институтом фундаментальных исследований и грантов Тата (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) от Департамента биотехнологии, правительство Индии. Депутат признает DBT-исследования ассоциированных, DBT, правительство Индии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40% Акриламид-бисакриламидный растворSigmaA9926
Персульфат аммония (APS)BioRad1610700
Промокательная бумагаватман промокательная бумага I1001-125
Бромфеноловый синийSigmaB5525-5G Наконечники
загрузки капилляровBioRad2239915
деионизированные формамидAmbionAM9342
Нагревательный блокEppendorff5350
Hybond N+нейлоновая мембранаGERPN203B
Гибридизационный флаконSigmaZ374792-1EA
Гибридизационная печьThermo Scientific1211V79
N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин (TEMED)SigmaT7024-25ml
PhosphorImagerGE- Сканер Typhoon29187194
экраном и кассетой PhosphorImagerGE healthcareGE28-9564-75
ПипеткиGilson, модели: P20 и P10FA10002M, FA10003M
Пластиковая пипеткаFalcon357550
Полиакриламидный гелевый аппаратBioRad1658003EDU
Sephadex G-25 колонкаGE здравоохранение27532501
Speed Vac концентраторThermo Scientific20-548-130
SpinwinTarsons1010
T4 Полинуклеотидкиназа (PNK)NEBM0201S
Трансблот аппаратBioRad1703946
ULTRAHyb буфер для гибридизацииAmbionAM8670
МочевинаFischer Scientific15985
UVP-сшивательUVPCL-1000L
VortexTarsons3020
Водяная баняNEOLABD-8810
КсилолцианолSigmaX4126-10G
для

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
  4. Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
  5. Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
  6. Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
  7. Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
  8. Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
  9. Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
  10. Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNA Blot AnalysisMicroRNA DetectionNorthern BlotPlant MicroRNAsSmall RNA AnalysisGel ElectrophoresisUV Cross linkingHybridization ProbeImageJ QuantificationLoading Controls

Похожие статьи