Протокол, описанный здесь, освещает основные этапы дифференцировки индуцированных плюрипотентных эндотелиальных клеток, полученных из стволовых клеток, подготовку Neisseria meningitidis к инфекции и сбор образцов для других молекулярных анализов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Neisseria meningitidis Инфекция индуцированных плюрипотентных эндотелиальных клеток головного мозга
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Менингококковый менингит — это опасная для жизни инфекция, которая возникает, когда Neisseria meningitidis (meningococcus , Nm) может получить доступ к центральной нервной системе (ЦНС), проникая в высокоспециализированные эндотелиальные клетки головного мозга (БЭК). Поскольку Nm является патогеном, специфичным для человека, отсутствие надежных модельных систем in vivo затрудняет изучение взаимодействия между Nm и БЭК между патогеном-хозяином и устанавливает необходимость в модели, основанной на человеке, которая имитирует нативные БЭК. БЭК обладают более жесткими барьерными свойствами по сравнению с периферическими эндотелиальными клетками, характеризующимися сложными плотными соединениями и повышенным трансэндотелиальным электрическим сопротивлением (TEER). Тем не менее, многие модели in vitro , такие как первичные БЭК и иммортализированные БЭК, либо отсутствуют, либо быстро теряют свои барьерные свойства после удаления из нативного нейронного микроокружения. Недавние достижения в технологиях стволовых клеток человека позволили разработать методы получения эндотелиальных клеток головного мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые лучше фенокопируют БЭК по сравнению с другими моделями человека in vitro . Использование БЭК, полученных из ИПСК (ИПСК-БЭК) для моделирования взаимодействия Nm-BEC, имеет преимущество использования клеток человека, обладающих барьерными свойствами BEC, и может быть использовано для изучения разрушения барьера, активации врожденного иммунитета и взаимодействия бактерий. В этой статье мы продемонстрируем, как получить ИПСК-БЭК из ИПСК в дополнение к бактериальной подготовке, инфекции и сбору образцов для анализа.
Введение
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и менингеальный гематоэнцефалический барьер (mBCSFB) представляют собой чрезвычайно плотные клеточные барьеры, которые отделяют кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) и в основном состоят из высокоспециализированных эндотелиальных клеток головного мозга (БЭК)1,2. Вместе БЭК поддерживают надлежащий гомеостаз мозга, регулируя поступление питательных веществ и продуктов жизнедеятельности в мозг и из него, исключая при этом многие токсины, лекарственные препараты и патогены 1,2. Бактериальный менингит возникает, ког....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы приготовления сред / реагентов, поддержания стволовых клеток и дифференцировки адаптированы из Stebbins et al.22.
1. Подготовка материалов, необходимых для культивирования ИПСК и дифференциации БЭК.
- Матричное покрытие пластика для культуры тканей (ТС) для культуры ИМР90-4 iPSC
- Распределите матричный гель базальной мембраны (например, Matrigel) на аликвоты по 2,5 мг и храните при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро при работе с матричным гелем и аликвотой на льду, так как он образует гель при температуре выше 4 °C и не может быть аликвотирован после затвердевания. - ....
- Распределите матричный гель базальной мембраны (например, Matrigel) на аликвоты по 2,5 мг и храните при -20 °C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, описанный здесь, адаптирован из Stebbins et al. и освещает процесс дифференцировки ИПСК в эндотелиальные клетки мозга, обладающие свойствами ГЭБ, а также то, как использовать эту модель для исследований инфекций с использованием ИПСК-БЭК с Nm19,22. При правильной дифференцировке ИПСК-БЭК проявляют жесткие барьерные свойства, измеренные с помощью TEER, которые часто превышают 2000 Ω·см2, и экспрессируют эндотелиальные маркеры, такие как VE-кад.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Моделирование БЭК и ГЭБ сопряжено с трудностями, поскольку первичные и иммортализированные человеческие БЭК in vitro, как правило, не имеют устойчивых барьерных фенотипов. Появление технологий стволовых клеток человека позволило получить БЭК-подобные клетки, полученные из ИПСК, которые сохраняют ожидаемые отличительные фенотипы ГЭБ, такие как эндотелиальные маркеры, экспрессия плотных соединений, барьерные свойства, реакция на другие типы клеток ЦНС и функциональные транспортеры оттока 12, 13
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
L.M.E. поддерживается исследовательской учебной программой DFG GRK2157 под названием «3D-модели тканей для изучения микробных инфекций, вызванных патогенами человека», присужденной A. S-U. B.J.K. поддерживается постдокторской стипендией Фонда Александра фон Гумбольдта. Кроме того, мы выражаем признательность Лене Уолтер за ее техническую помощь в создании ИПСК-БЭК в культуре.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
33
Чтобы приготовить 110 мл добавки Kellogg's, приготовьте 100 мл 4 г/мл глюкозы, 0,1 г/мл глутамина и 0,2 мг/мл тиамина пирофосфата и 10 мл 5 мг/мл Fe(NO) и объедините растворы.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аккутаза (1x) | Sigma | A6964 | Реагент для ферментативной диссоциации клеток |
| Уксусная кислота | Sigma | A6283 | |
| Полностью транс-ретиноевая кислота (РА) | Sigma | R2625 | |
| Анти-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
| Анти-Клаудин-5 | Инвитроген | 4C3C2 | |
| Анти-Глут-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
| Антиокклюдин | Инвитроген | 33-1500 | |
| Анти-ВЕ-кадгерин | Санта-Круз | sc-52751 | |
| Анти-ЗО-1 | Инвитроген | 33-9100 | |
| Бакто-протеозный пептон | BD | 211684 | |
| b-меркаптоэтанол | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
| Планшеты и колбы для клеточных культур | Sarstedt | ||
| Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
| Class II Biosafety Incubator | Nuaire | NU-437-400E | |
| CO2 (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) | Nuaire | ||
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Columbia ager + 5 % овечья кровь | Biomerieux | 43049 | |
| Costar Transwell полиэфирные фильтры (12- или 24-луночные) | Corning | 3460, 3470 | |
| D(+)-глюкоза | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
| DMSO | ROTH | A994.1 | |
| Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Эпителиальный вольт-омметр (Millicell ERS-2) с электродом STX | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
| Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
| Фибронектин | Sigma | F1141 | |
| Флуоресцентный микроскоп (Eclipse Ti) | Гемацитометр Nikon | ||
| (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
| Основной фактор роста фибробластов человека (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
| Свободная среда эндотелиальной сыворотки человека (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
| Инвертированный микроскоп (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
| iPS(IMR90)-4 клетки | Добавка WiCell | ||
| Kellogg's | Фильтр простерилизовать и хранить при температуре -20°С. | ||
| Нокаутная замена сыворотки (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
| L-глутамин (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
| LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | набор для синтеза кДНК |
| Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | ROTH | 4627,5 | |
| MgCl2 | Микропипетки ROTH | KK36.1 | |
| (Research Plus) | Eppendorf | ||
| NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
| Заменимые аминокислоты (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| Набор для выделения РНК NucleoSpin | Machery-Nagel | 740955 | набор для выделения РНК |
| Пипетка для мальчика (Accu-Jet Pro) | Бренд | ||
| Сыворотка плазмы с низким содержанием тромбоцитов, бычья (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
| пленка для количественной ПЦР (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Прикладные биосистемы | 4211971 | |
| планшеты для количественной ПЦР (MicroAmp Fast 96-лунка) | Прикладные биосистемы | 4346907 | |
| Ингибитор ROCK, Y27632 дигидрохлорид | Tocris | 1254 | |
| RT-PCR термоамплификатор (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Серологические пипетки | Sarstedt | ||
| StemFlex базальная среда + 50x добавка StemFlex | Gibco | A3349401 | Среда для поддержания стволовых клеток |
| Ротор качающегося ведра (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
| Тиамин пирофосфат | Sigma | C8754-5G | |
| Трипановый синий раствор, 0,4% | Gibco | 15250061 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 | Неферментативный реагент для диссоциации клеток (ЭДТА) |
Ссылки
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
Больше статей
Эндотелиальные клетки мозгапроизводные из иПКСКмодель гематоэнцефалического барьератрансэндотелиальное электрическое сопротивлениедифференцировка стволовых клетокмаркеры эндотелиальных клетокпротокол подготовки бактериальной суспензииподдержание клеточных культуранализ барьерных свойстввзаимодействие хозяина и патогена
