Дополнительные сотовые матрицы на основе и экстра сотовой матрицы свободного поколения Murine яичка органоидов

Краткое содержание

Здесь описаны четыре метода генерации органоидов яичек из первичных неонатальных яичек, т.е. внеклеточной матрицы (ECM) и 2D и 3D-культуры ECM. Эти методы имеют несколько исследовательских применений и особенно полезны для изучения развития яичек и физиологии in vitro.

Аннотация

Органоиды яичек обеспечивают инструмент для изучения развития яичек, сперматогенеза и эндокринологии in vitro. Несколько методов были разработаны для того, чтобы создать органоиды яичек. Многие из этих методов полагаются на внеклеточную матрицу (ЭКМ) для содействия сборке тканей de novo, однако существуют различия между методами с точки зрения биомиметического морфологии и функции тканей. Кроме того, существует мало прямых сравнений опубликованных методов. Здесь прямое сравнение делается путем изучения различий в протоколах генерации органоидов, с предоставленными результатами. Описаны четыре метода архетипического поколения: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free и (4) 3D ECM культура. Для оценки генерации органоидов яичек были использованы три основных эталона. Это клеточная самосвека, включение основных типов клеток (Сертоли, Лейдиг, зародыш и перитубулярные клетки), а также соответствующая разобщенные архитектуры тканей. Из четырех протестированных сред 2D ECM и 3D ECM-свободные культуры генерировали органоиды с внутренними морфологиями, наиболее похожими на отечественные яички, включая де-ново-разобщенизацию трубчатых и интерстициальных типов клеток, развитие трубчатых структур и установленную долгосрочную эндокринную функцию. Все изучаемые методы использовали несортированные, первичные суспензии яичек мурина и использовали общедоступные культурные ресурсы. Эти методы генерации органоидов яичек обеспечивают очень доступный и воспроизводимый инструментарий для исследовательских инициатив в области органогенеза яичек и физиологии in vitro.

Введение

Органоиды яичек являются новаторской техникой для изучения развития яичек, сперматогенеза и^{физиологии в пробирке 1,,2,,3,,4.} Было изучено несколько методов для генерации органоидов; к ним относятся различные внеклеточные матричные (ЭКМ) и системы культуры, свободные от ЭКМ, как в двухмерных (2D), так и в трехмерных (3D) ориентациях. Различные методы генерации могут способствовать разработке различных стратегий клеточной сборки; это приводит к высокому уровню морфологической и функциональной изменчивости между опубликованными органоидными мод....

Протокол

Все эксперименты с мышью были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Северо-Западного университета, и все процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными МАКУК протоколами.

1. Подготовка энзиматических растворов для диссоциации тканей

1. Используйте два различных энзиматических решения (Solution 1 и Solution 2), оба из них сделаны с использованием базального среднего решения культуры (BM).
2. Для приготовления БМ добавьте сыворотку и пенициллин-стрептомицин к минимальным необходимым средним и окончательным концентрациям 10% и 1% соответственно (см. таблицу материалов для конкретны....

Результаты

Органоидное поколение считалось неудачным, если клетки яичек не собирались в пределах 72 ч от культуры, однако, все методы, представленные здесь, собираются в пределах 24 ч при использовании несовершеннолетних (5 dpp) murine клеток. Отказ поколения биологической конструкции представлен как продолжение свободно подвешенных клеток (0 h колонка на рисунке 1) даже после расширенной культуры (72 ч). При отсутствии самосожжения тканей любые видимые клеточные кластеры легко рассеиваются на отдельны.......

Обсуждение

С завершением этого протокола генерации органоидов, пользователь будет иметь четыре различных методов культуры доступны для них для сборки яичек конструкций и органоидов в ecM или ECM-свободной среде. Важно отметить, что все четыре метода позволяют исследователю неинвазивно наблюдать органоидную самосъему с течением времени с помощью замедленной визуализации или видеозаписи, а также неинвазивно собирать условные средства массовой информации для анализа секретных гормонов и цитокинов, не нарушая ткани во время культуры. В.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,22 мкм Медиа Стерильные фильтры	Millipore Sigma	scgpu05re	Для стерильных фильтрующих материалов
3β HSD первичное антитело	Cosmo Bio Co	K0607	Маркер клеток Лейдига, разведение 1:500
AlexaFluor 568 α-Mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Флуоресцентное меченое вторичное антитело
AlexaFluor 568 α-Rabbit	Thermo Fisher Scientific	A10042	Флуоресцентное меченное вторичное антитело
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	Основа питательных сред
Коллагеназа I	Worthington Bio	LS004197	Для диссоциации раствора 1
Мембранная матрица Corning Matrigel, LDEV-free	Corning	354234	Внеклеточный матрикс используется для литья 2D и 3D ECM гелей для культивирования
Countess Cell counter	Thermo Fisher Scientific	C10227	Autmated cell counter (аппарат для гемацитометра)
Камеры подсчета клеток Countess Слайды	Thermo Fisher Scientific	C10228	Предметное стекло гемацитометра для использования с автоматизированным счетчиком первичных антител Countess
DDX4	Abcam	138540	Маркер сперматогонии, разведение 1:500
Дезоксирибонуклеаза I (2,280 ед/мгDW)	Worthington Bio	LS002140	Для раствора диссоциации 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl Thermo	Fisher Scientific	14040182	Для восстановления гиалуронидазы
Фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore Sigma	W1503	Для восстановления коллагеназы I и ДНКАЗЫ I
Фетальная бычья сыворотка	Thermo Fisher Scientific	16000044	Для расщепления растворов фермента
Фолликул стимулирующий гормон	Abcam	ab51888	Для долговременной культуры органоидов
Хорионический гонадотропин человека	Millipore Sigma	C1063	Для долговременной культуры органоидов
Гиалуронидаза, из бычьих яичек	Millipore Sigma	H4272	Для диссоциации раствор 2
Ингибин B Иммуноферментный анализ	Ansh Labs	AL-107	Ингибин B ИФА Набор
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828-028	Источник сыворотки для базальных сред
MicroTtissue 3D Petri Dish Micro-mold spheroids (24-35, массив 5x7)	Millipore Sigma	Z764051	для 3D ECM-Free organoids fabrication
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-луночный	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	Для 2D ECM без ECM, и 2D, 3D ECM культура
Пенициллин/Стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	Антибиотик для сред
Richard-Allan Scientific; Гистогель, гель для обработки образцов	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	Для помощи в встраивании парафина
первичного антитела SOX9	Millipore Sigma	AB5535	Sertoli Marker, разведение 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)	Teklad Global	2920	Мышиный корм без фитоэстрогенов
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)	Teklad Global	2916	Корм для мышей без фитоэстрогенов
Тестостерон Фермент Связанный с Иммуносорбентом Анализ	Calbiotech	TE373S	Тестостерон ИФА Набор
Трипан Синий Раствор, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Для подсчета клеток
&альфа;SMA первичное антитело	Millipore Sigma	A2547	Перитубулярный маркер, 1:500 разведение
&бета; Катенин первичное антитело	BD Biosciences	610154	маркер цитоплазмы Сертоли, разведение 1:100