Method Article

Дополнительные сотовые матрицы на основе и экстра сотовой матрицы свободного поколения Murine яичка органоидов

DOI:

10.3791/61403

⸱

October 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описаны четыре метода генерации органоидов яичек из первичных неонатальных яичек, т.е. внеклеточной матрицы (ECM) и 2D и 3D-культуры ECM. Эти методы имеют несколько исследовательских применений и особенно полезны для изучения развития яичек и физиологии in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды яичек обеспечивают инструмент для изучения развития яичек, сперматогенеза и эндокринологии in vitro. Несколько методов были разработаны для того, чтобы создать органоиды яичек. Многие из этих методов полагаются на внеклеточную матрицу (ЭКМ) для содействия сборке тканей de novo, однако существуют различия между методами с точки зрения биомиметического морфологии и функции тканей. Кроме того, существует мало прямых сравнений опубликованных методов. Здесь прямое сравнение делается путем изучения различий в протоколах генерации органоидов, с предоставленными результатами. Описаны четыре метода архетипического поколения: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free и (4) 3D ECM культура. Для оценки генерации органоидов яичек были использованы три основных эталона. Это клеточная самосвека, включение основных типов клеток (Сертоли, Лейдиг, зародыш и перитубулярные клетки), а также соответствующая разобщенные архитектуры тканей. Из четырех протестированных сред 2D ECM и 3D ECM-свободные культуры генерировали органоиды с внутренними морфологиями, наиболее похожими на отечественные яички, включая де-ново-разобщенизацию трубчатых и интерстициальных типов клеток, развитие трубчатых структур и установленную долгосрочную эндокринную функцию. Все изучаемые методы использовали несортированные, первичные суспензии яичек мурина и использовали общедоступные культурные ресурсы. Эти методы генерации органоидов яичек обеспечивают очень доступный и воспроизводимый инструментарий для исследовательских инициатив в области органогенеза яичек и физиологии in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды яичек являются новаторской техникой для изучения развития яичек, сперматогенеза ифизиологии в пробирке 1,,2,,3,,4. Было изучено несколько методов для генерации органоидов; к ним относятся различные внеклеточные матричные (ЭКМ) и системы культуры, свободные от ЭКМ, как в двухмерных (2D), так и в трехмерных (3D) ориентациях. Различные методы генерации могут способствовать разработке различных стратегий клеточной сборки; это приводит к высокому уровню морфологической и функциональной изменчивости между опубликованными органоидными моделями. Цель этой статьи состоит в том, чтобы обсудить текущее состояние в пробирке тестикулярных моделей, и служить в качестве шаблона для будущих исследователей, при разработке яичек органоидных экспериментов. В рамках настоящего исследования в экспериментальном процессе и биологическом исходе определены и охарактеризованы четыре различных архетипа системы культуры. К ним относятся: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free и 3D ECM методы культуры. Представленные в настоящем деле стратегии призваны быть простыми, доступными и воспроизводимыми между различными лабораториями и исследовательскими группами.

Исторически для яичка, обозначение "in vitro", был использован для нескольких различных методов культуры яичек тканей и клеток. К ним относятся органотипические ткани / орган культуры методы (т.е.эксплант культуры) 5, изолированные семенной трубчатойкультуры 6,яичек клеточной культуры 7, и методы де Новотканиморфогенез (т.е., биологические конструкции и органоиды) 1 . Первые исследования в пробирке сперматогенез были проведены около 100 лет назад, с культурой кролика яичка explants в 19208, а затем в 1937 году с мышью explants9. В рамках этих первоначальных экспериментов сперматозоиды наблюдались в значительной степени вырождаются в течение первой недели культуры, хотя некоторые мейотически дифференциации клеток были определены. Напоминая эти исторические отчеты, тестис explant культуры был возрожден и оптимизирован в 2011 году, чтобы стать возможным методом для изучения яичка10. С 2011 года, explant культуры производится плодородия компетентных спермыв нескольких докладах 11,12,13. Тем не менее, из-за explant культуры зависимость от уже существующих местных труб яички, эти последние достижения более точно описаны как примеры "ex vivo" функции яичек и сперматогенез, функции тканей, которая была сохранена или возобновлена после удаления из организма организма. Несмотря на свою распространенность в литературе, долгосрочное поддержание зародышевых клеток и дифференциации в яичках explants является сложнойзадачей для репликации 14,15,16,17,18, особенно в течение таймфреймов достаточнодолго,чтобы полностью наблюдать в пробирке сперматогенез (35дней у мышей 19 и 74 у людей20). Это интригует, чтобы оценить, что многие из тех же проблем, с которыми сталкиваются 100 лет назад, все еще испытываются в ex vivo сперматогенез сегодня.

В отличается от подходов ex vivo, органоиды яичек de novo собраны микротызы, полностью генерируемые в пробирке из клеточных источников (т.е. первичных яичек). Тестикулярные органоиды обеспечивают творческую стратегию, чтобы обойти историческую зависимость поля от уже существующих местных тканей, и резюмировать биологии яичек полностью in vitro. Есть несколько требований, разделяемых большинством моделей органоидных тканей; к ним относятся (1) виво-миметическая морфология тканей или архитектура, (2) несколько основных типов клеток представленной ткани, (3) самосделки или самоорганизации в их поколении, и (4) способность имитировать некоторый уровень функциипредставленной ткани и физиологии 21,22,23,24. Для яичка, это может быть захвачено в четырех основных признаков: (1) включение основных типов яичек клеток, зародыши, Сертоли, Лейдиг, перитубулярные и другие интерстициальные клетки, (2) клеточной сборки тканей, (3) надлежащим образом разобщенные типы клеток в отдельные трубчатые отсеки (зародыши и сертолии) и интерстициальные области (все другие типы клеток), и (4) некоторую степень функции тканей (например, секреция репродуктивных гормонов или тканей). Учитывая исторические проблемы в поддержании дифференциации зародышевых клеток ex vivo и in vitro, повторение виво-миметических архитектур яичек (т.е. структур, напоминающих семенные трубочки) с дополнительными маркерами, предполагающими моделирование физиологии яичек (например, эндокринная функция), являются приоритетными вехами в направлении генерации органоидов, которые в один прекрасный день могут выдержать в пробирке.

Большинство опубликованных методов органоидов яичка воспользоваться коммерчески доступны ECM (например, коллагена или собственной ECM формулировки)25,26,27 или пользовательских источников ECMs (т.е. децеллюляризованных яичка ECM полученных гидрогели)28,29,30. Экзогенный ECM способствует образованию тканей de novo путем предоставления сборочно-поддерживающего эшафота для генерации тканей. ECM методы позволили впечатляющий уровень формирования тканей, в том числе некоторые присутствия зародышевых клеток и ткани-мимететическойморфологии 25,28. Тем не менее, ECMs они используют не всегда универсально доступны (т.е., decellularized ECM полученных гидрогели), и некоторые методы требуют сложных гель и клеточных ориентаций посева (например, 3-слойные градиенты ECM и 3D-печати)25,31,32. Методы, свободные от строительных лесов (например, висячие капли и неадъедерные пластины культуры)33,,34,35 такжесоздали надежные и высоко воспроизводимые органоиды без необходимости ECM гелей или эшафотов. Тем не менее, морфология тканей этих эшафот-свободных органоидов часто отличается от in vivo яички, и большинство из этих докладов включают биохимические добавки ECM длясодействия образованию тканей 33,34,36, или в качестве альтернативы, полагаться на центрифугации для принудительной агрегации клеток и уплотнения34, что делает их менее идеальными для изучения клеточной миграции и самоорганизации.

Четыре метода генерации органоидов, представленные в этой рукописи, включают как зависимые от ЭКМ, так и независимые стратегии, каждая из которых использует простое клеточное посевное, позволяющее осуществлять наблюдение за клеточной органоидной самосожжением. Все четыре метода могут быть выполнены из тех же подвесок клеток или могут использовать пользовательские и клеточного типа обогащенных популяций. Сила этих методов является способность наблюдать органоидов самостоятельно собираться в режиме реального времени, и непосредственно сравнить, как яичек структуры самостоятельной сборки между различными микроокноронами культуры. Фенотипические различия между этими четырьмя методами культуры должны быть рассмотрены для их воздействия на исследовательский вопрос или предмет следователя. Каждый метод производит биологические конструкции или органоиды в пределах 24 ч или менее. В заключение, методы, представленные здесь обеспечивают инструментарий органоидных методов сборки для изучения органоидной сборки яичек, развития тканей и физиологии яичек в пробирке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с мышью были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Северо-Западного университета, и все процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными МАКУК протоколами.

1. Подготовка энзиматических растворов для диссоциации тканей

  1. Используйте два различных энзиматических решения (Solution 1 и Solution 2), оба из них сделаны с использованием базального среднего решения культуры (BM).
  2. Для приготовления БМ добавьте сыворотку и пенициллин-стрептомицин к минимальным необходимым средним и окончательным концентрациям 10% и 1% соответственно (см. таблицу материалов для конкретных реагентов). Затем стерильный фильтр БМ через фильтр 0,22 мкм. Перед использованием с клетками, предварительно эквилибрировать стерильные БМ до нейтрального рН, распределяя в культуре блюдо и размещение в увлажненной, 5% CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию, как минимум 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: БМ может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 1 недели, после чего свежие БМ должны быть сделаны.
  3. Чтобы подготовить коллагеназы I фондовых решений, сначала растворить 100 мг коллагеназы I в 1 мл стерильных эмбрионов класса H2O (окончательная концентрация 10% м / в), инвертировать или вихрь, чтобы раствориться, и хранить 20 йл aliquots при -20 КК для более длительного использования. Алициты следует разморозить только один раз.
  4. Для подготовки деоксирибонуклеазы I (DNase I) фондовые растворы, добавить 20 мг DNase I в 1 мл стерильного эмбриона класса H2O (окончательная концентрация 2% м / в), инвертировать или вихрь, чтобы раствориться (не вихрь), и хранить 20 йл aliquots при -20 градусов по Цельсию для более длительного использования. Алициты следует разморозить только один раз.
  5. Для растворов запасов гиалуронидазы добавьте 30 мг в 1 мл стерильного фосфатного буферного солевого раствора (PBS; окончательная концентрация 3% м/в гиалуронидазы в PBS, содержащейCaq/Mg), инвертировать или вихрь растворить, и хранить 100 йл aliquots при -20 C для более позднего использования. Aliquots можно разморозить и повторно заморозить несколько раз без потери энзиматической активности.
  6. Для подготовки диссоциации Раствор 1, добавить 10 йл коллагеназы I и 10 Л DNase I в 1 мл стерильных, предварительно equilibrated БМ (Окончательные концентрации: 1 мг / МЛ коллагеназы I и 5 мкг / мл DNase I). Тритурировать осторожно с пипеткой, чтобы смешать раствор, и предварительно разогреть до 37 градусов по Цельсию перед использованием с тканью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 2 готовится путем добавления 33 л гиалуронидазы (предварительно до 37 градусов по Цельсию) на 1 мл раствора 1 (до конечной концентрации 1 мг/мл). Это происходит на полупути через энзиматические диссоциации ткани яичка на шаге 2,5 ниже.

2. Диссоциация тканей яичка

ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши были размещены в полипропилеиновых клетках и обеспечены пищей и водой ad libitum. На животных кормили облученной чау, которая не содержит фитоэстрогенов. Несовершеннолетние мыши CD-1, 5 дней послеродовой (dpp), были использованы для всех экспериментов и анестезии до эвтаназии и сбора тканей, в анестезии камеры прилагается к изофлюран испаритель (2,5 л / мин в O2). Мыши были подтверждены для полной анестезии из-за отсутствия ответа на палец-колоть, после чего мышей усыыли через обезглавливание.

  1. Обезболивать мышей в изофлюрановой камере, обеспечивать анестезию через палец-колоть, а затем обезглавить мышь с помощью острых ножниц. Поместите усыпляемую мышь на коврик для вскрытия и стерилизовать живот 70% этанола. Палатка кожи нижней части живота с типами и открыть живот ножницами.
  2. Найдите яички в левом нижнем и правом паховой областях живота. Отрежьте их соединения к vas deferens и любой якорной соединительной ткани, после этого поднимите весь яичко (с epididymis все еще прикрепленным) от животного. Поместите яички в чашку Петри предварительно equilibrated BM.
  3. Под микроскопом вскрытия и в стерильном поле, сделать небольшой разрез в туника albuginea на одном конце каждого яичка либо с небольшой ножницой микродиссекции или разрывая осторожно с помощью двух тонких типсов.
    1. Затем, удерживая яички с противоположного конца разреза, аккуратно сожмите яички мелкими типсами и нажмите нежным радикальным движением к отверстию в тунике; это выпустит ткани яичка, как один сплоченный кусок.
  4. Разрежьте яички на более мелкие кусочки (≤ 2мм 3) и поместите их в 1 мл предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) диссоциации Раствор 1.
    1. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
    2. Для более чем 10 яиц увеличьте общий объем раствора диссоциации на 1 мл, обеспечив минимум 1 мл раствора диссоциации на 10 яиц (например, 2 мл для 20 тестов, 3 мл для 30 яиц и т.д.).
    3. Аккуратно тритурировать кусочки яичка 50 раз (50x) в растворе 1 с помощью P1000 пипетки. Убедитесь, что трубоубийки отделены друг от друга и от интерстициальной ткани в этой точке. Если сгустки остаются, инкубировать еще 5 минут и тритурировать еще раз (50x).
  5. Добавьте 33 МКЛ раствора запаса гиалуронидазы (предварительно разогретого при 37 градусов по Цельсию, из шага 1,5) на 1 мл раствора 1 диссоциарной смеси (содержащей частично разобщенной ткани яичек и трубочков). После добавления гиалуронидазы, это называется раствором 2.
    1. Тритурат (50x) с использованием P1000 и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
    2. Тритурат (50x) с использованием P200 пипетки.
    3. Убедитесь, что на данный момент нет видимых трубок или скопления клеток присутствуют. Если сгустки сохраняются, инкубировать еще до 5 минут, с дальнейшей тритурации с помощью P200 пипетки (50x).
  6. Утолить ферменты диссоциации, добавив сыворотку крупного рогатого скота плода (FBS) до 10% от общего объема раствора 2. Тритурат несколько раз с помощью P200 пипетки, чтобы обеспечить отсутствие комков остаются, и фильтр через 40 мкм ситечко клеток для производства одноклеточной подвески.
  7. Центрифуга клеток на 100 х г в течение 7 мин, отказаться от супернатанта, и повторного перерасхода клеток в свежем БМ.
  8. Подсчитайте общие и жизнеспособные концентрации клеток с помощью trypan синего исключения на гемоцитометре. Добавьте 10 МКЛ из 1:1 разбавленной, клеточной подвески: трипан синий раствор, в камеру подсчета гемоцитометра ячейки (см. Таблицу материалов).
    1. Ре-центрифуга клеток на 100 х г в течение 7 мин и повторно в свежем БМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только жизнеспособные клетки для расчета концентрации клеток и их количества. Используйте только клеточные суспензии ≥ 80% жизнеспособности для генерации органоидов.
    2. Подготовка одноклеточной подвески в концентрации клеток, как описано для того, чтобы aliquot 280000 клеток с учетом объемов, используемых в протоколе конкретные шаги ниже в разделе 3: 2D ECM-Free - 0,56 х 106 клеток / мл, 2D ECM - 0,56 x 106 ячеек/мл, 3D ECM-Free - 4,66 x 106 ячеек/мл, 3D ECM - 2,8 х 106 ячеек/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все культурные эксперименты, представленные здесь, начинаются с 280 000 клеток, посеянных на культуру хорошо. Эти цифры соответствуют репрезентативным данным на рисунке 1, рисунке 2, рисунке 3 и рисунке 4.

3. Приготовление органоидных культурных блюд и посев клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения однородной ECM, до оттепели замороженных aliquots ECM ночь перед экспериментами. ECM aliquots должны быть погружены в ведро со льдом в холодильнике 4 градусов по Цельсию или холодной комнате, чтобы гарантировать медленное, постепенное повышение температуры. Все ECM используется на 1:1 окончательного разбавления в БМ для культуры. Храните размороженный ECM и 1:1 разбавленный ECM на льду до непосредственно перед использованием, в противном случае ECM может полимеризировать преждевременно.

  1. Для 2D ECM-свободной культуры, никакой специальной подготовки не требуется, пластины одноклеточных суспензий (500 МКЛ из 0,56х 10 6 клеток / мл в БМ) непосредственно на 4-колодец камерных слайдов, и поместить в 35 градусов по Цельсию инкубатор для культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны придерживаться нижней части культуры блюдо в течение первых 24 ч культуры и может проявлять некоторые небольшие кластеры 3D клеток в течение этого же времени.
  2. Для 2D ECM культуры, обойтись 100 йл холодной 1:1 разбавленной внеклеточной среде матрицы подвала в 4 хорошо камеры слайд, обеспечивая гель охватывает всю тарелку дно.
    1. Поместите камерную горку в инкубатор на 35 градусов Цельсия в течение как минимум 30 минут, чтобы ECM м полимеризуется в гель.
    2. Добавьте подвеску клетки (500 МКЛ 0,56 х 106 клеток/мл в БМ) прямо на верхней части 2D-геля после полимеризации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны группируются вместе, чтобы сформировать небольшие 3D-кластеры в течение первых 24 ч культуры.
  3. Для 3D ECM-свободной культуры, подготовить агарозы 3D Петри блюдо вставки перед началом клеточной культуры.
    1. Во-первых, автоклав 1,5 г порошка агарозы в стакане 100 мл, затем добавить 75 мл стерильной, дистиллированной воды и микроволновой печи для производства расплавленной 2% агары для 3D Петри литья блюдо.
    2. В стерильном рабочем пространстве, обойтись расплавленной агарозы в 3D Петри блюдо формы до мениска на уровне со сторонами формы.
    3. Дайте агарозе остыть и затвердеть. Когда твердые, перевернуть плесень с ног на голову и осторожно гибкой неоднократно, пока агароза 3D Петри блюдо падает свободной от плесени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, можно подготовить много агарозы 3D Петри блюда и хранить их в стерильных H2O или DPBS при 4 КК в течение более одного месяца.
    4. Перед культивированием поместите блюда агарозы 3D Petri в блюдо из 24 хорошо культуры и накройте их 1 мл БМ. Пусть 3D Петри блюда equilibrate в БМ, по крайней мере 30 минут в рамках 37 КК культуры инкубатора. Отбросьте БМ и повторите эквилибровирование еще раз с помощью 1 мл свежего БМ. После эквилибрации 3D-чашек Петри в БМ они будут выглядеть того же цвета, что и БМ (т.е. розовый).
    5. Чтобы подготовиться к посеву клеток, удалите все БМ из колодец и выпределите 200 МКЛ свежего БМ вокруг, но не внутри центральной ниши 3D чашки Петри. Кроме того, собирать любые оставшиеся БМ изнутри центра клеточного посева углубление микроуэлла вставки.
    6. Выпределите одноклеточную суспензию (4,66 клетки/мл в 60 МКЛ БМ) в центральную нить чаши агарозы 3D Петри. Аккуратно тритурировать вверх и вниз, чтобы смешать клетки и гарантировать одноклеточную подвеску в начале культуры.
    7. Поместите в в увлажненной 35 C инкубатор для культуры. На следующий день снимите 200 МКЛ БМ со всей микроуровня и замените 1 мл свежего БМ. Это приведет к уровню жидкости над плоскости вставки, погружая всю культуру.
    8. Медленно и осторожно удалить / добавить средства массовой информации из-за пределов агарозы 3D Петри блюдо. Органоиды должны были уплотняться на ночь, позволяя им отдыхать внизу и позволяя изменениям в средствах массовой информации оставить органоиды нетронутыми.
  4. Для 3D-культуры ECM подготовьтесь к одной клеточной подвеске, объединив в равных частях подвеску клетки в БМ с холодным, предварительно оттаявным ECM (окончательная концентрация 2,8 х 106 клеток/мл).
    1. Немедленно раздай смесь клетки-ECM в 4 хорошо камеры слайд, обеспечивая смесь охватывает все дно пластины.
    2. Поместите слайды камеры при 35 градусов по Цельсию в инкубатор и позвольте ее содержимому полимеризироваться. Это должно занять не менее 30 минут. После полимеризации добавьте 500 МКЛ БМ поверх культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны были группируются вместе, чтобы сформировать небольшие 3D агрегаты в течение первых 24 ч культуры.

4. Органоидное обслуживание

  1. Культура всех видов органоидных моделей при 35 градусов по Цельсию. Для всех видов культуры обмен половины своих средств массовой информации со свежим БМ каждые 2 дня. Чтобы органоиды не были случайно собраны при обмене средой, всегда собирайте мультимедиа медленно из угла камерной слайд-тарелки, а с внешней точки за пределами агарозы 3D-чашек Петри. Все средства массовой информации могут храниться при -20 градусов по Цельсию для использования с иммуноанализом или другими анализами позже (т.е. количественной оценкой секретных репродуктивных гормонов или цитокинов).
  2. После 7 дней в культуре, использовать БМ, содержащий фолликулостимулирующего гормона (окончательная концентрация 20 МИУ/мл) и человека хорионический гонадотропин (окончательная концентрация 4,5 МЕ/мл). Это относится ко всем типам органоидной культуры.
  3. Регулярно изображение всех органоидных культур (т.е. замедленной визуализации) для характеристики органоидного образования и количественной оценки метрик самос сборки, развития и роста с течением времени.

5. Органоидная коллекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Все органоиды могут быть исправлены с 4% параформальдегида в PBS для ниже по течению иммунолабеля и гистологических анализов. Исправить на 2 ч при комнатной температуре с вращением, или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.

  1. Для 2D культур, свободных от ECM, сначала промойте образец свежим PBS, а затем добавьте фиксатор непосредственно поверх прилипаемых конструкций.
  2. Для ECM (2D и 3D) методы культуры, промыть один раз с PBS, а затем либо добавить фиксации непосредственно на верхней части ECM-органоидный образец (исправить ECM гель и органоиды вместе), или же, мягко пипетки органоидов вверх и вниз, чтобы освободить их от окружающих ECM, и перейти к отдельной трубке для фиксации.
  3. Для 3D ECM-свободной культуры, нежно pipette органоиды вверх и вниз в пределах центральной рецессии чашки агарозы 3D Петри; это будет смыть органоиды из облегчения их легкой коллекции с пипеткой. Затем перенесите органоиды в отдельную трубку для фиксации.
  4. Перед обработкой в парафин, вставлять много органоидов (≥ 20) в пределах небольшого объема (30 йл) геля обработки тканей; это помогает ориентировать и концентрировать органоиды на небольшой площади в парафиновых блоков, облегчая наблюдение при разделе и легче визуальной идентификации в парафиновых секциях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут быть сложными для идентификации после встраивания парафина и секции на микротоме.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоидное поколение считалось неудачным, если клетки яичек не собирались в пределах 72 ч от культуры, однако, все методы, представленные здесь, собираются в пределах 24 ч при использовании несовершеннолетних (5 dpp) murine клеток. Отказ поколения биологической конструкции представлен как продолжение свободно подвешенных клеток (0 h колонка на рисунке 1) даже после расширенной культуры (72 ч). При отсутствии самосожжения тканей любые видимые клеточные кластеры легко рассеиваются на отдельны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С завершением этого протокола генерации органоидов, пользователь будет иметь четыре различных методов культуры доступны для них для сборки яичек конструкций и органоидов в ecM или ECM-свободной среде. Важно отметить, что все четыре метода позволяют исследователю неинвазивно наблюдать органоидную самосъему с течением времени с помощью замедленной визуализации или видеозаписи, а также неинвазивно собирать условные средства массовой информации для анализа секретных гормонов и цитокинов, не нарушая ткани во время культуры. В...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом детского здоровья и развития человека (NICHD) F31 HD089693, Национальным институтом экологических наук здоровья / Национальным центром продвижения трансляционных наук (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 и 4UH3ES029073-03, а также Мемориальным профессором Томаса Дж.

Авторы хотели бы поблагодарить Эрика В. Рота за помощь в передаче электронной микроскопии. В этой работе использовался объект BioCryo Центра NUANCE Северо-Западного университета, который получил поддержку от ресурса мягкой и гибридной нанотехнологии (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); программа MRSEC (NSF DMR-1720139) в Научно-исследовательском центре материалов; Международный институт нанотехнологий (IIN); и штата Иллинойс, через IIN. Он также использовал оборудование CryoCluster, которое получило поддержку от программы МРТ (NSF DMR-1229693). Графика на рисунке 1 была разработана с использованием BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 мкм Медиа Стерильные фильтрыMillipore Sigmascgpu05reДля стерильных фильтрующих материалов
3β HSD первичное антителоCosmo Bio CoK0607Маркер клеток Лейдига, разведение 1:500
AlexaFluor 568 α-MouseThermo Fisher ScientificA-21202Флуоресцентное меченое вторичное антитело
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Флуоресцентное меченное вторичное антитело
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Основа питательных сред
Коллагеназа IWorthington BioLS004197Для диссоциации раствора 1
Мембранная матрица Corning Matrigel, LDEV-freeCorning354234Внеклеточный матрикс используется для литья 2D и 3D ECM гелей для культивирования
Countess Cell counterThermo Fisher ScientificC10227Autmated cell counter (аппарат для гемацитометра)
Камеры подсчета клеток Countess СлайдыThermo Fisher ScientificC10228Предметное стекло гемацитометра для использования с автоматизированным счетчиком первичных антител Countess
DDX4Abcam138540Маркер сперматогонии, разведение 1:500
Дезоксирибонуклеаза I (2,280 ед/мгDW)Worthington BioLS002140Для раствора диссоциации 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl ThermoFisher Scientific14040182Для восстановления гиалуронидазы
Фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко +Ca/+MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503Для восстановления коллагеназы I и ДНКАЗЫ I
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific16000044Для расщепления растворов фермента
Фолликул стимулирующий гормонAbcamab51888Для долговременной культуры органоидов
Хорионический гонадотропин человекаMillipore SigmaC1063Для долговременной культуры органоидов
Гиалуронидаза, из бычьих яичекMillipore SigmaH4272Для диссоциации раствор 2
Ингибин B Иммуноферментный анализAnsh LabsAL-107Ингибин B ИФА Набор
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028Источник сыворотки для базальных сред
MicroTtissue 3D Petri Dish Micro-mold spheroids (24-35, массив 5x7)Millipore SigmaZ764051для 3D ECM-Free organoids fabrication
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-луночныйThermo Fisher Scientific12-565-7Для 2D ECM без ECM, и 2D, 3D ECM культура
Пенициллин/СтрептомицинThermo Fisher Scientific15-140-122Антибиотик для сред
Richard-Allan Scientific; Гистогель, гель для обработки образцовThermo Fisher ScientificHG-4000-012Для помощи в встраивании парафина
первичного антитела SOX9Millipore SigmaAB5535Sertoli Marker, разведение 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)Teklad Global2920Мышиный корм без фитоэстрогенов
Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)Teklad Global2916Корм для мышей без фитоэстрогенов
Тестостерон Фермент Связанный с Иммуносорбентом АнализCalbiotechTE373SТестостерон ИФА Набор
Трипан Синий Раствор, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Для подсчета клеток
&альфа;SMA первичное антителоMillipore SigmaA2547Перитубулярный маркер, 1:500 разведение
&бета; Катенин первичное антителоBD Biosciences610154маркер цитоплазмы Сертоли, разведение 1:100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680(2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472(2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472(2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884(2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227(2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011(2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002(2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15(2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171(2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Testicular OrganoidsECM Culture2D ECM free3D ECM freeCellular Self assemblySertoli CellsLeydig CellsGerm CellsPeritubular CellsTissue Architecture

Related Articles