Модифицированные методы загрузки высокой пропускной способности пластин извлечения ДНК снижают потенциал загрязнения

Summary

Современные методы загрузки 96-х пластин для извлечения ДНК могут быть подвержены загрязнению. Мы подробно описали новый метод погрузки пластин 96 скважин, который снижает риск перекрестного загрязнения скважин. Наш метод поможет другим исследователям извлечь выгоду из эффективности высокой пропускной способности методов извлечения ДНК и свести к минимуму риск заражения.

Abstract

Методы секвенирования ДНК с высокой пропускной способностью в значительной степени способствовали прогрессу в нашем понимании взаимосвязей между микробными сообществами, характеристиками хозяина и более широкими функциями экосистем. При этом быстрое увеличение широты и глубины возможностей секвенирования пришли методы для извлечения, усиления, анализа и интерпретации ДНК окружающей среды успешно с максимальной эффективностью. К сожалению, быстрое выполнение извлечения ДНК может произойти за счет увеличения риска заражения образцов. В частности, экстракции с высокой пропускной способностью, основанные на образцах, содержащихся в пластине 96-й пластины, предлагают относительно быстрый метод, по сравнению с однотрубными извлечениями, но также увеличивают возможности для хорошого перекрестного загрязнения. Чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения образцов, сохраняя при этом преимущества высокой пропускной способности методов экстракции, мы разработали новый метод загрузки образцов окружающей среды в 96-колодец пластин. Мы использовали проколочные пленки уплотнения ПЦР для покрытия каждой пластины при загрузке образцов и добавили образцы сначала в ПЦР трубки перед перемещением их в скважины; в совокупности такая практика снижает риск дрейфа проб и непреднамеренной двойной загрузки скважин. Метод, изложенный в настоящем документе, предоставляет исследователям подход к максимальному использованию доступных методов экстракции с высокой пропускной способностью при одновременном снижении риска перекрестного загрязнения, присущего пластинам 96-й пластины. Мы предоставляем подробный шаг за шагом наброски того, как перейти от сбора образцов к извлечению ДНК при минимизации риска нежелательного перекрестного загрязнения.

Introduction

Недавние достижения в области секвенирования микробных сообществ с высокой пропускной способностью обеспечивают беспрецедентную глубину секвенирования и, следовательно, беспрецедентный взгляд на функционирование и разнообразие микробиома^{Земли 1}. По мере увеличения способности мультиплекса все больше и больше образцов на одну полосу секвенирования, извлечение ДНК одной трубки может стать ограничивающим скорость шагом в генерации экологических данных. Тем не менее, новые методы в высокой пропускной способности ДНК извлечения обещают для обработки больших количеств образцов окружающей среды с большей эффективностью, чем это было^{ранее возможно 2}. Эти методы часто включают в себя использование 96-хорошо пластин вместо однотрубных труб, тем самым увеличивая возможное количество извлечений, которые могут произойти одновременно. Таким образом, практичность и эффективность высокой пропускной способности методов экстракции очевидны и были реализованы для обработки экологических^{образцов,}начиная^{от почвы 3,4} и^{растительных тканей 3,,5} до фекального вещества^{человека 2}.

Хотя эти методы могут резко ускорить обработку образцов и извлечение ДНК, начальный этап загрузки почвы и других экологических образцов в 96-хорошо пластин подвержены перекрестному загрязнению. Этот тип хорошо загрязнения может произойти во время извлечения^{ДНК 6,,7,,}8 ,^{и скважины}особенно уязвимы на этом первом этапе, прежде чем образцы приостановлены в буферный раствор. McPherson et al.^{9 демонстрируют метод загрузки} корневища почв в 96-колодец пластин с использованием воронок и 8-хорошо ПЦР полосы охватывает, но в то время как их метод является более контролируемым подходом к погрузке пластин, он по-прежнему предоставляет широкие возможности для загрязнения соседних скважин при загрузке каждого образца. Кроме того, открытые скважины позволяют отвлеченного исследователя поместить образец в неправильную скважину или добавить образец в колодец, который уже был загружен. Кроме того, различные типы образцов оказались неподходят для загрузки с помощью этого метода; влажные образцы часто прилипают к воронки и сухие образцы "прыгать" между скважинами из-за статического электричества.

Чтобы уменьшить возможности загрязнения скважин на первом этапе экстракции ДНК с высокой пропускной способностью, мы разработали новый подход к загрузке образцов почвы в пластины 96 скважин. Наши методы защищают скважины от воздействия окружающей среды и не позволяют нам случайно загрузить несколько образцов в одну скважину (двойная загрузка). Мы считаем, что метод, о которого сообщается ниже, обещает уменьшить потенциал загрязнения и как таковой обеспечивает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин для последующей экстракции ДНК.

Protocol

1. Лабораторная скамейка и подготовка инструмента для загрузки пластины из 96 колодец

1. Очистить верхнюю скамейку, затуманив 70% этанола. Протрите и дайте воздуху высохнуть перед распылением скамейке сверху с 10% отбеливателя. Протрите скамейку сверху сухой.
2. Стерилизовать микро-scoopula, шпатель, и хирургические ножницы (изогнутые) путем погружения в 95% этанола, а затем подвергать пламя. Опустите каждый в 10% отбеливатель и дайте высохнуть перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты должны быть стерилизованы между каждым образцом.

2. Подоборка и подготовка выборки

1. Стерилизовать перчатки с использованием этанола до подоборки.
2. Гомогенизировать образцы почвы тщательно до подсвеборки.
3. Используя стерилизованные инструменты, загрузите помеченную 2 мл центрифуги трубку с образцом примерно до половины полной.
4. Повторите шаг 2.2 до тех пор, пока все 95 образцов не будут отобраны в помеченные 2 мл центрифугных труб. 96-я^{колодец} должна использоваться в качестве добывающей пустоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.3 и 2.4 сделаны для того чтобы свести к минимуму требуемое пространство хранения и предотвратить сверх или двойной выборки.
5. Храните 2 мл под образец труб на льду до загрузки пластины.
6. Этикетка 96 стерильных 200 йл плоской крышкой ПЦР трубки A1'u2012A12, B1'u2012B12, .... H1-u2012H12. Поместите эти трубки для того, чтобы в 96-хорошо стойку.
7. Назначьте идентификатор образца с расположением хорошо (A1-u2012H12) и завечьте его.

3. Подготовка плиты

1. Снимите резиновую крышку с пластины 96-колодец(рисунок 1А-1С)и поместите ее в стерильный полиэтиленовый пакет (см. таблицу материалов). Печать полиэтиленовый пакет для предотвращения загрязнения.
2. Обложка 96-хорошо пластины с уплотнительной пленкой(рисунок 1D-1E); например, используйте заранее проколотую герметиза (см. таблицу материалов). Обеспечь уплотнение путем свертывать с резиновым роликом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пирсируемые силиконовые коврики потенциально могут предложить многоразовый вариант, при условии соответствующей очистки между использованиями, но силиконовые коврики, которые мы тестировали легко разделить вдоль проколов и не будет предлагать равную защиту для любых следующих пластин.
3. Поместите тарелку в холодильник (4 кк), чтобы сохранить прохладу.

4. Передача подпровеев

ПРИМЕЧАНИЕ: См. шаг 4.13 для модификаций, когда образец почвы очень мал.

1. Поместите 24 из 2 mL подпроецов в ледяную глыму для холодного хранения.
2. Используя имя образца и лист расположения хорошо выбрать правильный 200 йл плоской крышкой ПЦР трубки.
3. Возьмите 2 мл под образец трубки и вихря для 5 с, чтобы обеспечить гомогенизацию.
4. Использование пламени и отбеливателя стерилизованных инструментов нагрузки 200 йл первого образца в правильной плоской крышкой ПЦР трубки(рисунок 1F).
5. Повторите шаги 4.2'u20124.4 до тех пор, пока не будут загружены все 24 образца. Затем перейти к шагу 4.6.
6. Используя отбеливание окунутой бумаги протрите, очистите снаружи 200 йл плоской трубки ПЦР.
7. Переверните трубку и нажмите на скамейку, чтобы переместить образец к верхней части трубки. С обесцвеченными и стерилизованными пламенем ножницами, зажимайте дно трубки ПЦР, чтобы создать отверстие для образца, чтобы попасть в пластину 96-хорошо(рисунок 1G).
8. Найти правильный хорошо на 96-хорошо пластины и пройти трубку через пластину с разрезом в конечном итоге лицом до достижения, что хорошо. Наклоните пластину немного, чтобы облегчить прокол предварительно прокалывания прокалывания пленки, и только тогда, когда трубка находится непосредственно над правильным хорошо инвертировать его так, что сократить кончик вписывается в колодец. Используя стерилизованные инструменты, нажмите верхнюю часть трубки ПЦР, пока вся почва не упала из трубки в колодец. Оставьте трубку в колодец с закрытой крышкой(рисунок 1H-1J).
9. Удалите одну плоскоокупную трубку ПЦР на 200 йл за один раз и добавьте к этому хорошо 750 МКЛ шариковогораствора (рисунок 1K). Нажмите 200 йл плоской крышкой ПЦР трубки вплоть до хорошо и пометить сверху с sharpie, чтобы указать, что эта хорошо была загружена. Повторите это для каждого образца.
10. После того, как все 24 образца были загружены и бисером решение добавил, удалить 2 мл подпробных труб и заменить 24 неамперных труб.
11. Повторите шаги 4.1'u20124.10 до тех пор, пока все 95 скважин не будут загружены образцом или раствором из чистого и бисера. Удалите трубки, не проходя их по открытым скважинам(рисунок 1L).
12. Аккуратно снимите проколотую пленку и замените резиновую крышку, чтобы защитить пластину до началаизвлечения (рисунок 1М-1О).
13. Для очень небольших количеств почвы, которые также мелкозернистые, добавить 750 йл шарикового раствора в образец трубки и использовать широкое отверстие пипетки отзыв для передачи всего содержимого в соответствующий колодец. Поместите трубку ПЦР в отверстие, чтобы предотвратить двойную загрузку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при реализации этой модификации, как твердые частицы органического вещества или мелкие фрагменты породы больше, чем отверстие кончика пипетки может засорить пипетку и сделать передачу образца суспензии трудно.
14. По мере необходимости замораживать при -20 градусов по Цельсию и хранить пластины загружены с образцом и шариком решение до запланированной добычи.

5. Сравнение методов погрузки пластин

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы проверить наш новый метод для загрузки 96-ну пластины извлечения ДНК, мы разделили одну пластину 96-колодец на три секции. Мы использовали три различных метода погрузки пластин для сравнения потенциала непреднамеренной загрузки почвы и перекрестного загрязнения. Три метода, которые мы использовали были методы, изложенные в McPherson et al.⁹, протокол загрузки по умолчанию^{Зиагена 10}, и протокол, который мы излагаем в этой публикации.

1. Загрузка почвы в тарелку
   1. Раздел 96-хорошо пластины на три четыре колонки блоков. Загрузите каждый блок с помощью одного из трех методов, упомянутых выше.
   2. Загрузите почву во все остальные скважины, чтобы образцы и пустые колодцы были поражены. Такая схема позволяет получить максимальную возможность для непреднамеренной загрузки образцов и перекрестного загрязнения.
   3. Заморозить 96-хорошо пластины при -20 градусов по Цельсию до извлечения ДНК.
2. Извлечение ДНК
   1. Извлекайте ДНК в соответствии с протоколом извлечения пластины 96-й^{пластины производителя 10.}
   2. Храните экстракты ДНК при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.
3. Количественная оценка ДНК в пустых скважинах
   1. Оттепель ДНК экстракты при комнатной температуре, вихрь и спина вниз с помощью пластины счетчика.
   2. Измерьте и замитьте концентрацию ДНК пустых скважин с помощью спектрофотометра.
   3. Используйте ANVOA и пост-специальный тест Tukey для анализа различий в среднем концентрации ДНК в пустых скважинах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значительные различия были зарегистрированы в No 0,05.

Results

Этот новый метод был успешно использован для загрузки 96-ну пластины извлечения ДНК. Сравнение методов загрузки пластин показало, что наш метод имеет самую низкую концентрацию ДНК в пустых скважинах. Концентрация ДНК в пустых скважинах была значительно ниже, чем метод предложил мой McPherson et al.⁹ (p lt; 0.05), хотя концентрации ДНК в нашем методе статистически не отличались от метода по умолчанию Зиагена(рисунок 2). Все три метода производили средние концентрации Д...

Discussion

Этот метод уменьшает возможности для хорошо колодец перекрестного загрязнения при загрузке высокой пропускной способности образца извлечения пластин и предлагает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин за пределами существующих стратегий^{загрузки пластин 9,10}. Загрязнение среди скважин может быть более распространенным в 96-ну пластины извлечения, чем в однотрубных извлечений, особенно^{при автоматизированной 6,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 унций WhirlPak	Nasco	B01065
2 мл центрифужные пробирки	Fisherbrand	05-408-129
200 &; L микро-ПЦР-пробирки	Thermo Scientific	AB 2000
96-луночный набор для экстракции ДНК PowerSoil	Qiagen	12955-4	Мы использовали набор для экстракции почвы, но любой набор для 96-луночного формата подойдет.
Ледяной блок для центрифужных пробирок на 2 мл	Any	Any Любой	ледяной блок, сделанный на 2 мл пробирки
подойдет Ледяной блок на 200 & микро; L микро-ПЦР пробирки	Any	Any Any	Любой блок льда на 200 & микро; L трубки будут работать
микроскопула	любая
любая предварительно вырезанная прокалываемая герметизирующая пленка	Excel Scientific	XPS25
шпатель		любой
хирургические ножницы	любой	любой