Эпигенетические маркеры используются для подзарядки белых кровяных телец (WBC) через количественную оценку моделей метилирования ДНК. Этот протокол представляет собой мультиплекс капли полимеразной цепной реакции (mdPCR) метод с использованием термопластичного еластомера (TPE) на основе микрофлюидного устройства для производства капель позволяет точной и мультиплекс метилирования конкретных целевых количественно WBC дифференциальных кол-
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метилирование специфических мультиплексных капель ПЦР с использованием полимерных капель генератор устройства для гематологической диагностики
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Описан мультиплексный рабочий процесс ПЦР (mdPCR) и подробный протокол для определения эпигенетических белых кровяных телец (WBC) дифференциального числа, наряду с термопластичным еластомером (TPE) микрофлюидным устройством генерации капель. Эпигенетические маркеры используются для субтипирования WBC, который имеет важное прогностический значение при различных заболеваниях. Это достигается за счет количественной оценки моделей метилирования ДНК конкретных богатых CG регионов в геноме (cpG локусов). В этой работе, бисульфит-обработанной ДНК из периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) инкапсулируется в каплях с mdPCR реагентов, включая грунтовки и гидролиз флуоресцентные зонды, характерные для cpG локусов, которые коррелируют с суб-популяций WBC. Мультиплексный подход позволяет проводить допрос многих локусов CpG без необходимости отдельных реакций mdPCR, что позволяет более точно определить параметрические поднаселения WBC с использованием эпигенетического анализа мест метилирования. Эта точная количественная оценка может быть распространена на различные приложения и подчеркивает преимущества для клинической диагностики и последующего прогноза.
Введение
Анализ состава белых кровяных телец (WBCs) является одним из наиболее часто запрашиваемых лабораторных тестов в гематологической диагностике. Дифференциальное количество лейкоцитов служит индикатором для спектра заболеваний, включая инфекцию, воспаление, анемию и лейкемию, и находится под следствием в качестве раннего прогностический биомаркер для ряда других условий, а также. Золотой стандарт в субтипинге WBC включает в себя иммуностиметь и/или цитометрию потока, которые требуют дорогостоящих, подверженных нестабильности флуоресцентных антител и часто сильно зависят от квалификации оператора в подготовке образца. Кроме того, этот метод применим только к свежим образц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты, проведенные в этом исследовании с участием образцов человека, были одобрены Советом по этике СРН и проводились в соответствии с политикой СРН, регулируя человеческие предметы, которые следуют применимым руководящим принципам исследований и соответствуют законам Квебека, Канада.
1. Подготовка клеток
- Оттепель замороженных человеческих периферических кровяных моноядерных клеток (PBMCs) немедленно, поместив криовиальный в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- Переверните криовиальный дважды, чтобы аккуратно повторно использовать клетки и с помощью 1 мл пипетки передачи клеточной подвеск....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Устройство генератора микрофлюидных капель на основе TPE было изготовлено с использованием описанного протокола, как показано на рисунке 1. Маска прозрачности была использована в фотолитографии для получения кремния (Si) мастер. Мягкая литография была выполнена для получения обратной реплики PDMS мастера Si, который затем был использован для изготовления эпоксидной плесени. Прекурсор Epoxy был налил на PDMS и вылечить для перекрестного и затвердевания. Эта плесень, представляющая точную копи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный экспериментальный протокол и методы позволяют в доме mdPCR с помощью изготовленного генератора капель TPE, тепловой циклер, и флуоресцентный микроскоп. Изготовленное устройство с использованием мягкого TPE для связи TPE обеспечивает гидрофобные свойства поверхности, которые являются однородными во всех стенках канала, так что окончательное устройство не требует какой-либо обработки поверхности для последующего использования в качестве генератора капель. Этот материал регулярно используется в точках ухода п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликтов, которые будут объявлять, нет.
Благодарности
Авторы признают финансовую поддержку со стороны Национального исследовательского совета Канады.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Bio-Rad, Миссиссога, Онтарио, | TFI0201 | ПЦР пробирка | |
| RAN Biotechnologies, Беверли, Массачусетс | 008-FluoroSurfactant | Фторсодержащее поверхностно-активное вещество | |
| Silicon Quest International, Санта-Клара, Калифорния | |||
| Oxford Instruments, Абингдон, Великобритания | EMCCD камера | ||
| Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Используется для анализа | ||
| Nikon, Япония | 10x объектив | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Манассас, Вирджиния | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Фишер, Канада | |||
| Vitrocom, Нью-Джерси, США | 5015 и 5010 | Боросиликатная капиллярная трубка | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Япония | LC-L1V5 | DEL УФ-источник | |
| Доломит | 3200063 | Одноразовые жидкостные трубки | |
| Доломитовая | 3200302 | Одноразовые жидкостные трубки | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Вертикальный световой микроскоп | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schä RDING, Австрия | |||
| Zymo Research, Ирвайн, CA | D5030 | ||
| Photron, Сан-Диего, CA | |||
| IDT, Коралвилль, IA | |||
| Gersteltec, Пулли, Швейцария | SU-8 фоторезист | ||
| Fineline Imaging, Колорадо-Спрингс, CO | |||
| Qiagen, Хильден, Германия | |||
| Изображение J | Используется для оценки диаметра | ||
| Анакемия, Монреаль, QC | |||
| Excelitas, MA, США | Светодиодная люминесцентная лампа | ||
| Galenvs Sciences Inc., Монреаль, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Å М&Аринг; l, Швеция | Термопластичный эластомер (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Япония | Используется для получения | ||
| 3M, St Paul, MN | Несущее масло | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Синее флуоресцентное окрашивание живых клеток (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, США | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, США | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Корбуссен, Германия | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Миссиссога, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Миссиссога, ON | |||
| Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк | Инвертированный микроскоп | ||
| Nikon, Япония | |||
| Loctite | АА 352 |
Ссылки
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
