Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Капсула на основе модели для незрелых жесткий тик этапы заражения на лабораторных мышей

6.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61430

⸱

9 июля 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1UMR BIPAR, INRAE, Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, ANSES, Université Paris-Est, 2Faculté de Pharmacie, Université de Limoges, 3UMR SPE 6134 CNRS, Université de Corte Pascal Paoli

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании, система кормления для нимфальных и личиночки этапов жесткого клеща была разработана с помощью капсулы прилагается к лабораторной мыши. Кормовая капсула изготовлена из гибких материалов и остается прочно прикрепленной к мыши в течение по крайней мере одной недели и позволяет комфортно контролировать кормление клещей.

Аннотация

Клещи являются обязательными паразитами для кормления крови на всех стадиях развития (кроме яйцеклеток) и признаются переносчиками различных патогенов. Использование моделей мышей в исследованиях клещей имеет решающее значение для понимания их биологии и взаимодействия тик-хозяина-патогена. Здесь мы демонстрируем нетязвую технику кормления незрелых стадий твердых клещей на лабораторных мышах. Преимущество метода заключается в его простоте, короткой продолжительности и способности контролировать или собирать клещей в разные моменты эксперимента. Кроме того, методика позволяет накрепление двух отдельных капсул на одной и той же мыши, что полезно для различных экспериментов, где две разные группы клещей должны питаться одним и тем же животным. Не раздражающая и гибкая капсула изготовлена из легкодоступных материалов и сводит к минимуму дискомфорт экспериментальных животных. Кроме того, эвтаназия не является необходимым, мыши полностью восстановить после эксперимента и доступны для повторного использования.

Введение

Клещи являются важными переносчиками нескольких патогенов и представляют серьезную опасность для здоровья животных и человека1. Создание эффективной системы питания имеет решающее значение при изучении их биологии, взаимодействия тик-хозяина и патогена или установлении эффективных мер контроля. В настоящее время несколько систем искусственного кормления, которые избегают использования живых животныхдоступны для клещей 2,3,4, и они должны быть использованы всякий раз, когда экспериментальные условия позволяют., Однако в различных экспериментальных условиях эти системы не могут надлежащим образом имитировать специфические физиологические особенности, и использование живых животных необходимо для достижения соответствующих результатов.

Лабораторные мыши обычно используются для изучения многих биологических систем и регулярно используются в качестве хозяев длякормления клещей 5,,6,,7,,8,,9. Два наиболее распространенных метода кормления незрелых клещей на мышах включают бесплатные заражения и использование камер заключения прилагается к мыши. Бесплатные заражения в основном используются для личинок этапов и engorged клещей может упасть в область, где они могут быть восстановлены. Камеры заключения обычно состоят из акриловых или полипропиленовых колпачков, которые приклеены к спине мыши. Первый метод является эффективной естественной системой для кормления клещей, но не позволяет внимательно следить во время эксперимента, потому что отдельные клещи рассредоточены в разных частях тела хозяина. Кроме того, engorged клещей, которые падают в области восстановления может стать загрязненныхкала и мочи 10,11,12,13,14, которые могут серьезно повлиять на тик фитнес или они могут быть повреждены или съедены мышью, если нет разделения между животным и восстановления области15.,, Камерные системы позволяют засовывать клещей в определенную область, однако процесс склеивания трудоемкий и колпачки часто слабо придерживаются клея и поэтому часто отсоединяются во время эксперимента16,,17,,18,,19. Крышки также жесткие, неудобно, и привести к кожным реакциям, которые препятствуют повторному использованию мышей и требует их эвтаназии после эксперимента.

В нашем предыдущем исследовании, мы успешно разработали эффективную систему с использованием камер из этилено-винилового ацетата (EVA) пены для кормления клещей на лабораторныхкроликов 20. В этом случае мы адаптировали эту систему к модели мыши и предлагаем простой и чистый метод подачи незрелых жестких тиковых стадий в закрытых капсулах из ЭВА-пены. В частности, наша система использует эластичные капсулы EVA-пены, приклеенные к бритым мышам обратно с быстрой сушкой (3 мин), не раздражающим латексным клеем. Этот метод позволяет твердое и длительное присоединение капсул к экспериментальной мыши, а также эффективное заражение клещей / сбор в течение всего эксперимента. Плоская капсула изготовлена из гибких материалов и не препятствует манипуляции мышью для сбора крови или других целей. Система подходит в основном для нимфальных стадий клеща, но с небольшим изменением она может быть использована для кормления личинок, а также. Метод может быть завершен одним опытным человеком и обширная подготовка не требуется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Пожалуйста, обратите внимание, что этот протокол может применяться только тогда, когда все меры по обеспечению благосостояния и безопасности будут выполнены в лаборатории. Этот протокол получил разрешение на использование мышей для кормления клещей Комитетом по этике для экспериментов на животныхComEth Anses/ENVA/UPEC, Номера разрешений E 94 046 08. Для конечной точки, животные подвергались воздействию CO2 в течение 9 минут в два этапа по 4 и 5 минут каждый из них.

1. Подготовка капсулы

  1. Stick 2 мм толщиной EVA-пены и клей двойной липкой пены вместе(рисунок 1A).
  2. Используя 20 мм диаметром кожаное отверстие удар, вырезать круг из придерживаются кусочки пены. Затем, используя 12 мм диаметром отверстие удар, вырезать интерьер, чтобы создать двойной круг пены(рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина рамы капсулы должна быть больше 3 мм в размерах, чтобы гарантировать достаточную поверхность для процесса склеивания кожи хозяина (см. ниже).
  3. Очистите защитную полоску бумаги от клейкой двойной липкой пены(рисунок 1С)и прикрепите прозрачный круговой пластик диаметром 20мм (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При кормлении личинок, не удалять защитную полоску бумаги из клейкой пены и непосредственно перейти к шагу 2 в протоколе. Клей двойное кольцо пены, в том числе защитную полоску бумаги к мыши.
  4. Сделайте щель 1 см в прозрачном пластике(рисунок 1E).
  5. Создайте не менее 10 небольших отверстий с энтомологическимштырем (рисунок 1F),чтобы позволить чрезмерное испарение влаги во время эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капсула(рисунок 1G) имеет общую высоту 4 мм (2 мм EVA-пены вместе с 2 мм клей пены) и может быть использован для кормления нимф и личинок всех твердых видов клещей. Размер капсулы(рисунок 1H) 20 мм внешнего диаметра подходит для большинства штаммов мыши, но может быть изменен в случае необходимости.

2. Подготовка мышей перед заражением клещами

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, 10 - 12 недель самки экспериментальных мышей (напряжение C57BL/6 и BALB/cByJ) были сохранены в стандартных клетках с пищей и водой, предлагаемых объявление libitum (Зеленая линия вентилируемые стойки на -20 Pa) во Французском агентстве по продовольствию, окружающей среде и гигиене труда (ANSES) аккредитованных животных объектов в Maisons-Alfort, Франция. Дважды в день за животными наблюдали опытные техники на любые аномальные кожные реакции, проблемы со здоровьем или осложнения.

  1. Анестезия мыши с изофлюраном в индукционной камере. После анестезии, поместите мышь к манипуляции площадку и прикрепить к носу конус для непрерывного питания изофлюран (Рисунок 2A). Мониторинг скорости дыхания и уменьшить уровень изофлурана, чтобы убедиться, что это меньше, чем 80 вдохов в минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед манипуляцией, этикетка отдельных мыши татуировки или радиочастотной идентификации чипа, если это необходимо. Рекомендуется держать отдельных мышей в отдельных клетках, чтобы избежать повреждения капсулы путем укусов.
  2. Бритье передней части мыши из-за лопаток до области сразу за ушами(рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бритая область должна быть больше, чем поверхность капсулы.
  3. Нанесите не раздражающий латексный клей на весь участок EVA-пены подготовленной капсулы и подождите 1 мин(рисунок 2B).
  4. Клей капсулы к мыши обратно небольшое 3 мин постоянное давление пальцем (ы) (Рисунок 2C), особенно на левой и правой стороне капсулы. Слегка поднимите капсулу, чтобы визуально проверить ее привязанность к коже. Если неприложенные области найдены, нанесите больше клея с помощью шпателя и нажмите еще на 3 минуты.

3. Клещ заражения

  1. Для заражения нимфой, ввести отдельные нимфы в капсулу через разрез, сделанный в шаге 1.4 (Рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ixodes клещей видов максимум 20 нимф рекомендуется на одну капсулу.
  2. Слегка сожмите капсулу с двух сторон, чтобы прозрачный пластик сгибаться для облегчения введения отдельных нимф с использованием тонкого вскрытия миппов(рисунок 2D). Нажмите отдельных нимф через разрез внутри капсулы. Оказавшись внутри, поверните типсы на 90 градусов и вытащите типсы, чтобы отставить клещей внутри капсулы.
  3. Для заражения личинок удалить бумажный листок из прикрепленной капсулы (Рисунок 2E). Поместите шприц, содержащий личинки(рисунок 2F), прямо внутри капсулы и депозит клещей, нажав шприц поршень. Аккуратно поверните поршень к коже, чтобы удалить оставшиеся личинки прилагается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите личинки в шприц 1 мл с разрезанным концом, подключенным к куску хлопка до начала эксперимента.
  4. После того, как личинки откладываются на кожу, закройте капсулу, прикрепив прозрачный пластик(рисунок 2G).
  5. Нанесите защитную пластиковую полосу вокруг капсулы(рисунок 2H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защитная пластиковая полоса значительно улучшила прочность капсулы в течение всего эксперимента(рисунок 2I,J). Можно прикрепить две капсулы к одной отдельной мыши(рисунок 2K). В этом случае требуется не менее 3 мм пространства между капсулами и бритая область должна быть увеличена соответствующим образом.
  6. Верните мышей в клетку.

4. Коллекция клещей

  1. Обезботь мышь, как в шаге 2.1 выше.
  2. Сделать крестообразный разрез(рисунок 3A) к пластику скальпелем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот крестообразный разрез позволяет легко сбора engorged клещей или отряд кормления клещей, если это необходимо.
  3. При необходимости, reclose капсулы, приклеив клей пластиковый патч к прозрачному пластику (20 мм в диаметре, рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если коллекция клещей в нескольких точках времени желательно, тот же липкий пластиковый патч может быть использован. Если протокол требует, можно также усыплять мышь, удалить капсулу, и собирать / отсоединять клещей(рисунок 3C).

5. Восстановление мышей

  1. Держите мышей в клетке еще на одну неделю.
  2. Пусть капсула отсоединиться естественным путем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае, это занимает около 8-9 дней для капсулы упасть. Когда капсула удаляется, важно проверить на аномальные реакции на кожу мышей. В случае раздражения применяют смягчающий лосьон, хотя обычно никакого лечения не требуется. Если этический протокол позволяет, восстановленных мышей(рисунок 3D) могут быть повторно использованы для другого заражения клещей или другой эксперимент (ы).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы предлагаем подробный шаг за шагом метод для кормления незрелых жестких стадий тик в EVA-пены капсулы, применяемые к спине мыши(рисунок 2). Этот не трудоемкий протокол подходит для различных типов экспериментов, когда требуется точный мониторинг и сбор тиков. Основными преимуществами этого метода являются его простота, легкодоступные экономически эффективные материалы и короткая продолжительность. Кроме того, нам удалось прикрепить две капсулы к одной мышиного человека...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важным шагом в протоколе является твердое склеивания капсулы к коже мыши. Поэтому латексный клей следует однородно нанесите на всю поверхность капсулы ЭВА-пены и следует применять постоянное давление в течение 3 минут, особенно на левую и правую сторону капсулы. Мы также рекомендуем размещение капсулы как можно дальше вперед на спине, чтобы избежать ее удаления мышью с помощью задних лап. В наших экспериментах, только приклеить EVA-пены и латексного клея к коже мыши была проверена, и мы не можем гарантировать до...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы признаем техническую помощь Национального института сельскохозяйственных исследований имени Алена Бернье (INRAE) и Окан Ле Биделя (ANSES). Исследование было поддержано DIM One Health - Регион Иль-де-Франс (Акроним проекта: NeuroPaTick). Мыши были приобретены ANSES. Д-р Джеффри Л. Блэр признан за пересмотр более ранней версии рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
EVA-пена толщиной 2 мм, (низкая плотность)Магазин косплеяEVA-45kg (950/450/2 мм)Его можно заказать также через Amazon (арт. No B07BLMJDXD)
Термоусадочная трубка Электрическая проволочная обмотка рукав 31 мм/1,22 дюймаAmazonB0848S3S6TРазличные диаметры термоусадочных трубок доступны через Amazon.
Мыши BALB/cByJCharles RiverКод штамма 627
Мыши C57BL/6Charles RiverКод штамма 664
Нетоксичный латексный клейTear menderТкань и Клей для кожиТакже доступен через Amazon (арт. No B001RQCTUU)
Инструмент для пробивки Инструмент для ручного искусстваAmazonB07QPWNGBFпродается Amazon как инструменты для обработки кожи 1-25 мм Круглый стальной резак для кожи Ремешок для ремня
Чехлы для крепления ПВХ ПрозрачныеB078BNLSNPПодходит любой прозрачный лист ПВХ от 0,150 мм до 0,180 мм Подходит
самоклеящаяся прокладка Губка с двойным покрытием Пенопластовая лентаAmazonB07RHDZ35Jпродается Amazon в виде двухсторонней пенопластовой ленты в 2 рулонах, сверхпрочной белой монтажной ленты Наклейки с прозрачным уплотнением из пенопласта
(круги диаметром 20 мм)AmazonB01DAA6X66

Ссылки

  1. Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
  2. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
  3. Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
  4. Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
  5. Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
  6. Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
  7. Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
  8. Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
  9. Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
  10. Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
  11. Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
  12. Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
  13. Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
  14. Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26(2012).
  15. Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286(2017).
  16. Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
  17. Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
  18. Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47(2009).
  19. Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39(2013).
  20. Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994(2018).
  21. Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
  22. Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
  23. Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
  24. Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
  25. Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
  26. Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
  27. Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Капсула на основе модели для незрелых жесткий тик этапы заражения на лабораторных мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.