Методическая статья

Рядом с одновременным лазерным сканированием конфокаловой и атомной микроскопии силы (Conpokal) на живых клетках

DOI:

10.3791/61433

⸱

11 августа 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол техники Conpokal, который сочетает в себе конфокаловую и атомную силовую микроскопию в единую приборную платформу. Conpokal обеспечивает ту же клетку, тот же регион, вблизи одновременной конфокальные изображения и механической характеристики живых биологических образцов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы, доступные для микро- и наномасштабной механической характеристики, взорвались в последние несколько десятилетий. От дальнейшего развития сканирующего и трансмиссионного электронного микроскопа до изобретения атомной силовой микроскопии и достижений в области флуоресцентной визуализации, были достигнуты значительные успехи в технологиях, позволяющих изучать мелкие материалы. Conpokal является portmanteau, который сочетает в себе конфокаловую микроскопию с атомной микроскопии силы (AFM), где зонд "тыкает" поверхности. Хотя каждый метод чрезвычайно эффективен для качественного и/или количественного сбора изображений самостоятельно, Conpokal предоставляет возможность тестирования с помощью смешанной флуоресцентной визуализации и механической характеристики. Предназначен для почти одновременной конфокальные изображения и атомной силы зондирования, Conpokal облегчает эксперименты на живых микробиологических образцов. Дополнительное понимание от парных приборов обеспечивает ко-локализацию измеренных механических свойств(например,эластичный модуль, адгезия, шероховатость поверхности) AFM с субклеточными компонентами или активностью, наблюдаемой через конфокалярную микроскопию. Эта работа обеспечивает шаг за шагом протокол для работы лазерного сканирования конфокальных и атомных микроскопии силы, одновременно, для достижения той же клетки, той же области, конфокальные изображения, и механические характеристики.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инструменты микро- или наномасштабной механической оценки часто используются для выявления характеристик деформации на уровне одной клетки или микроорганизма, в то время как отдельные инструменты микроскопии высокого разрешения используются для визуализации подклеточных процессов и структурных особенностей. Conpokal, представляет собой сочетание лазерного сканирования конфокальной микроскопии и атомной микроскопии силы (AFM) в единую инструментальную платформу. Техника Conpokal была впервые внедрена в не биологической полимерной системе, целью которой было определение адгезии, эластичности и поверхностного натяжения твердых поверхностей при контакте с мягкими поверхностями. Конфокальные изображения обеспечили визуальную визуализацию того, как полимер деформируется, придерживается и высвобождается из жесткогозонда 1,2. От полимеров до биологических образцов, этот метод предоставляет возможность для почти одновременной живой клетки или микроорганизмов конфокальных изображений и AFM.

Изменения в эластичности клеток были вовлечены в патогенез многих заболеваний человека3 включая сосудистые нарушения4Малярии5,6, серповидноклеточная анемия7Артрит8Астма9, и рак6,10,11,12,13,14,15. Общие методы для измерения механики клеток включают использование магнитных бусинок16,17, оптический пинцет18,19, микропипетт аспирации8,20,21,22, и AFM11,23,24,25,26. С момента применения AFM к живым клеткам, он был легко адаптирован для характеристики клеточной топографии27,28 а также механические свойства11,24,29,30,31 с наномасштабной точностью. AFM была дополнительно адаптирована для микрорепеологии32,33, частотная модуляция34,35, и ползучести25,36,37 эксперименты по изучению вискоэластичных свойств различных клеточных линий. Использование соответствующей наноконактной модели имеет решающее значение для извлечения количественных значений эластичности из измерений отступов, производимых AFM1,2. Исследования AFM, которые исследуют влияние цитоскелетных препаратов на эластичность клеток, показали, что эластичный модуль сильно пострадал38. Основываясь на эластичных измерениях модуль, многие исследователи показали, что раковые клетки мягче, чем их не преобразованные аналоги11,38,39. Повышенная деформация, вероятно, играет заметную роль в способности раковых клеток метастазировать и проникать в ткани40. Такое поведение регулируется модификациями в цитоскелетной организации клеток38,41,42. Помимо рака, еще одним классом механически-зависимых заболеваний являются респираторные заболевания. Например, острый респираторный стрессовый синдром поражает все больше и больше людей с каждым годом. Было показано, что, когда пациенты ставятся на механическую вентиляцию, с высокой концентрацией кислорода, их состояние может ухудшиться43. В серии исследований, наблюдающих альвеолярные эпителиальные макрофаги с AFM, ученые обнаружили, что добавление богатой кислородом среды увеличило жесткость клеток из-за формирования актина; ярким примером воздействия AFM на наше детальное понимание воздействия атмосферной среды на дыхательную функцию на клеточном уровне и, в конечном счете, исцеление и здоровье человека44,45,46. Эпителиальная скованность клеток во время миграции к ране также может быть оценена с помощью AFM и что изменение эластичного модула происходит, чтобы сигнализировать о распространении будущих клеток47,48. Таким образом, существует практическая необходимость количественной оценки клеточной механики, чтобы понять, чем больные клетки отличаются от здоровых и взаимодействуют с ними.

AFM также используется для изучения клеевых свойств и структуры поверхности. Атомный силовой микроскоп имеет различные режимы для сбора информации о образце с помощью контактной механики. Для живых биологических образцов две основные цели заключаются в получении количественных механических значенийсвойств(например, упругих модули, клеевых сил), а также высоты поверхности карты. Эти режимы включают режим касания (также известный как прерывистый контакт), который поддерживает постоянную амплитуду кантилевера, периодически контактную с поверхностью образца и контактным режимом, который поднимает или понижает кантилевер для поддержания постоянногоотклонения 49. Карты адгезии могут быть собраны с помощью силового отображения в системе AFM. Кантилевер притягивает образец к определенной силе, а затем убирается. Сила сопротивления опровержения измеряется детектором для создания графика смещения силы. Сила адгезии является максимальной силой, измеренной во время опровержения. Поверхностная морфология обеспечивает детальное представление образца на микро- или наноуровн. Кантилевер завершает сканирование по образцу на основе отступов и отклонения, захваченных движением кантилевера на каждом пикселе, выявляя микро- и наноразмерные объекты. С AFM, размер небольших функций, таких как peptidoglycanструктура 50, полимернаяцепь выравнивание 51, flagella52, lamellipodia53, и filipodia54 могут быть измерены. В то время как сила AFM заключается в кривых смещения силы и неоптических топологических изображениях, конфокалипическая микроскопия предлагает детальную визуализацию флуоресцентно помеченных образцов.

Конфокальные лазерного сканирования микроскопии (CLSM) является доминирующим методом для визуализации живых клеток, фиксированных клеток итканей 55,56,57. CLSM используется для биологической визуализации с 1955 года, т.е.смомента ее создания 58,59. В то время как принцип работы конфокальных микроскопов(т.е.отторжения из фокусного света через пинхол) остался практически неизменным, техническая реализациястала очень разнообразной 56,57,58,60. Конфокальные изображения могут быть реализованы с помощью многоапунктного сканирования,как в вращающейся дисковой системе 61, точечный сканирование одного лазерного луча,как в линии сканирования 62, или изображения функции распространения точки с последующими переназначениями пикселей через мульти-элемент детектор57. Последние достижения, которые расширяют полезность конфокальные изображения включают возможность лазерного сканирования, высокоскоростное резонансное сканирование, и детекторывысокой чувствительности 63,64,65. Преимущество, что все конфокальные системы имеют более широкое микроскопы является способность выполнять оптические секции в оси z с большей детализацией, особенно в толстых образцах. Широкое поле микроскопы с помощью камеры на основе обнаружения собирать свет, который излучается из фокусной плоскости и, одновременно, свет, излучаемый отовсюду в пути освещения. Закрыв пинхол, за счет уменьшения сигнала, как аксьное, так и боковое разрешение может быть увеличенона 66. В CLSM изображения строятся пикселем по пикселю через сбор сигналов выбросов, так как лазер возбуждения сканируется через поле зрения x-y. Коллекция из нескольких x-y плоскостей вдоль оси z образца может быть использована для реконструкции трехмерной архитектурыобразца 57,67. Конфокалиптическая микроскопия в сочетании с введением флуоресцентных белков произвела революцию в нашем понимании клеточнойбиологии 68. Например, он стал важным инструментом в неврологии69. CLSM регулярно используется для наблюдения очищенной ткани, а также для получения всеобъемлющих изображений иммунной окрашенных мозга и нейрональной архитектуры сети70. Это приложение привело к новым пониманием синаптических контактов и связи между нейронами и глиальными клетками в головном мозге71. От клеток мозга до пузырьков, флуоресцентные протоколы окрашивания поддерживают осмотр и захват клеточных функций с помощью конфокаловой микроскопии длядостижения в терапевтических методах 72,73.

Хотя они являются впечатляющими и универсальными инструментами индивидуально, сочетание конфокальной и атомной микроскопии силы (Conpokal) позволяет исследователям однозначно соотносить топографические и микромеханические клеточные/тканевых свойства с наблюдением различных клеточных органелл и их соответствующей динамики. Парные приборы позволяют пользователям, по существу, "видеть" то, что они зондирования; огромное преимущество перед одной техникой самостоятельно. С Conpokal, отображение силы через AFM накладывается на конфокальные изображения, чтобы соотнести жесткость клеток, адгезии или морфологии цитоскелетной структуры в образце, например. Общая цель метода Conpokal заключается в предоставлении исследователям платформы для изучения живых образцов в краткой, эффективной манере, обеспечивая как данные изображения, так и данные о материальном свойстве на одной платформе. В этой работе мы демонстрируем работу Conpokal, включая надлежащий отбор и подготовку образцов, установку инструмента, калибровку кантилевера и предоставляем рекомендации по успешному устранению неполадок. После протокола, мы предоставляем репрезентативные результаты, которые включают успешные бактерии и клеточную AFM высоту отображения, бактерий и клеток AFM modulus отображение, и конфокальные изображения мульти-помеченных клеток, через одноклеточный конфокальный и AFM. В заключение мы обсвястим критические шаги процедуры Conpokal, рекомендации по устранению неполадок, ограничения техники, значимость и будущие перспективы метода.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка инструментов, культурных средств массовой информации, блюд

  1. Включите источники питания как для конфокального микроскопа, так и для атомного силового микроскопа, а также для любых других связанных с ним инструментов или устройств, используемых во время Conpokal. Дайте приборам достаточно времени, чтобы тепло уравночные и стабилизировались перед началом измерений. Как правило, достаточно 1 ч.
  2. Подготовь одну чистую, одобренную системой, стеклянную чашку Петри и заполните половину полной, но не более двух третей полной, с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) или аналогичной чистой жидкостью. Это блюдо (именуемое «калибровочное блюдо») отделено от образцов блюд и будет использоваться для обнаружения и калибровки атомного силового микроскопа (AFM) кантилевера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы жидкость была чистой и имеет низкую аутофторесценцию, чтобы предотвратить любое вмешательство в спектры флуоресценции. PBS рекомендуется, потому что он имитирует биологическую среду.
  3. Приготовьте экспериментальные образцы блюд таким образом, чтобы связанная с ними жидкость наполнила блюдо как минимум наполовину полным. Если образец флуоресцентный, убедитесь, что он покрыт или в темном месте, пока это необходимо. Очистите дно всех стеклянных блюд с помощью линзы чистых и линз салфетки.
  4. Создание папок хранения данных для конфокальных и AFM на жестком диске компьютера (ы).

2. Отбор клеток или микроорганизмов

  1. Для создания бактерий фондовый раствор, привить Streptococcus mutans бактерий, используя цикл прививки, в 15 мл Тодд Хьюитт дрожжей (THY) в одночасье (для экспоненциальной фазы) в 5% CO2 инкубатора.
  2. За 1 ч до завершения ночной инкубации, покрыть экспериментальный образец блюд 1 мл раствора поли-л-лизина или достаточно покрыть стеклянную часть стеклянного дна блюда и оставить в кабинете биобезопасности на 1 ч. После установки, аспират поли-л-лизин раствор и промыть посуду 3x с PBS.
  3. После 18 - 24 ч бактериальной инкубации, привить THY с 1 мл бактериальной суспензии до оптической плотности 0,6 - 0,7 достигается (типичные значения для прививки 3 мл THY с 1 мл бактериальной суспензии на блюдо). Добавьте 1 мл нового раствора бактерий в каждое блюдо с покрытием поли-л-лизина и инкубировать в течение 1 ч. В течение последних 10 минут добавьте 1 мл зеленого флуоресцентного мембранного пятна (концентрация 1 МКМ) к каждому блюду.
  4. Промыть каждое блюдо 3x с PBS. Аккуратно исправить бактерии с около 1 мл 4% параформальдегида раствор в течение 15 минут при комнатной температуре внутри биобезопасности кабинета. Промыть каждое блюдо 3x с PBS после фиксации.
  5. Храните эмбрионационную почку человека (HEK) 293 клетки в жидком азоте. Выполните быстрое оттаивание при 37 градусах по Цельсию водяной бане перед покрытием.
  6. Добавьте 1 мл раствора мембранной матрицы в средствах массовой информации клеточной культуры к каждому клеточному образцу блюда и инкубировать (5% CO2) при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Аспирировать раствор и мыть посуду с клеточной культуры средств массовой информации. Плита необходимое количество HEK 293 клеток(например,100000 клеток на 35 мм блюдо) и добавить 2 мл клеточной культуры средств массовой информации. Затем инкубировать (5% CO2) клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 48 ч.
  7. После 48 ч добавьте 2 МКЛ флуоресцентного микротрубообразного цитоскелетового красителя (концентрация 1x) к каждому клеточному образцу блюда и инкубировать в течение 30 мин. Аспирировать раствор, содержащий краситель, мыть клетки 3x с PBS, и добавить 2 мл клеточной культуры средств массовой информации.
  8. Добавьте 1 мл плазменного мембранного красителя (концентрация 10 МКМ) в образец посуды и инкубировать в течение 30 минут. Вымойте раствор, содержащий краситель 3x с PBS и добавить 2 мл средств массовой информации культуры клеток.
  9. Счетчик ядра, добавив 1 йл нуклеиновой кислоты красителя (концентрация 10 МКМ) раствор образца блюд и инкубировать в течение 30 мин. Вымойте раствор, содержащий краситель 3x с PBS и добавить 2 мл культуры средств массовой информации.

3. Процедура AFM

  1. Откройте программное обеспечение для работы атомного силового микроскопа (AFM), нажав на значок программного обеспечения на компьютере.
  2. Поверните или вставьте цель воздуха низкого увеличения (рекомендуется 10x или 20x). Большое рабочее расстояние 5 мм и более полезно во время опускания и калибровки наконечника.
  3. Намонтировать выбранный этап образца ячейки, если он еще не установлен. Для живых образцов используйте нагреватель для употребления образца при желаемой температуре.
  4. Загрузите чистую, одобренную системой чашку Петри, заполненную наполовину полной PBS (подготовленной в шаге 1.2) или аналогичной чистой жидкостью (калибровочная тарелка). Если этап образца имеет встроенные застежки, используйте их, в противном случае, используйте вакуумную смазку для стабилизации образца.
  5. Выберите соответствующий cantilever AFM для желаемого сбора данных и установите его следующим шагам ниже.
    1. Используя перчатки, смонтировать чип AFM в стеклянный блок с помощью AFM чип монтажа этапе, пинцет, и небольшая отвертка. Аккуратно поместите чип AFM на стеклянный блок и сориентировать его таким образом, чтобы он был по центру. Кантилевер, плюс очень небольшая часть чипа AFM, должен быть в видимой, непрозрачной части монтажного блока.
    2. Закрепить чип отверткой, затягивая винт, пока чип плотно против стеклянного блока. Убедитесь, что AFM cantilever правильно ориентирован с помощью стерео микроскопа или портативного spyglass. Отрегулируйте по мере необходимости. После правильной ориентации поместите стеклянный блок в голову AFM в надлежащей ориентации и заблокируете его на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация чипа AFM в стеклянном блоке важна для того, чтобы системные лазеры целились в заднюю часть кантилевера и правильно отражались на фотодетекторе. Будьте осторожны, чтобы не затянуть винты во время размещения, как эта процедура может привести к чип aFM, кантилевер, или отзыв сломать.
  6. Используя яркий вариант конфокального микроскопа, найдите дно калибровочной тарелки с помощью ручки фокусировки. Принять к сведению эту высоту z как значение, где дно блюда находится по отношению к цели микроскопа.
  7. Используя панель управления двигателем системы AFM на компьютере, который управляет двигателями stepper, переместиМ кантилевер AFM от образца выше 2000 мкм.
  8. Используя обе руки, аккуратно поместите голову AFM с чипом AFM на сцену образца, убедившись, что каждая из вертикальных точек на голове AFM прочно установлена в назначенных канавках на сцене AFM. После того, как глава AFM находится на месте, визуально увидеть, как близко держатель кантилевера к блюду. Если он кажется слишком близко, таким образом, что глава AFM находится в контакте или в пределах 1 мм от верхней части образца блюда, обратно его с помощью двигателей z stepper перед снижением AFM отзыв к образцу.
  9. Используя яркое освещение, медленно опустите чип AFM на дно стеклянной тарелки с помощью панели управления двигателем z stepper на программном обеспечении AFM. Найдите ручные микрометры, которые контролируют X-y или в плоскости движения головы AFM на приборной платформе. Отрегулируйте положение кантилевера AFM в поле зрения, исправив головку AFM по мере того, как в поле зрения попадает кантилевер.
    1. Так как расположение в нижней части блюда неизвестно в это время, ниже со ступенями 100 - 200 мкм, чтобы избежать сбоя наконечник AFM в чашку Петри. Как правило, наконечник должен быть снижен 800 - 2000 мкм. По мере опускаемого наконечника следите за тем, чтобы тень появлялась на представлении программного обеспечения микроскопа, что указывает на то, что наконечник AFM приближается к нижней части блюда.
    2. Снижение приращений до 20 - 50 мкм. Не забудьте настроить смотреть таблицы (LUTs) изображения камеры, как кончик снижается в блюдо с помощью панели LUTs на конфокального программного обеспечения. Продолжайте снижать наконечник AFM, используя небольшие шаги, пока он в основном находится в фокусе.
    3. Убедитесь, что наконечник достаточно темный, чтобы общая форма его можно было увидеть и по центру поля зрения. Также убедитесь, что наконечник появляется размытым, что подтверждает, что он не столкнулся с нижней части блюда, пока.
  10. Отрегулируйте фокус микроскопа таким образом, что наконечник теперь находится в фокусе, имея в виду рабочую дистанцию цели. Прежде чем перейти к более высокой цели увеличения, используйте инструмент измерения микроскопа для сбора ширины и длины кантилевера AFM, получить доступ к панели измерительных инструментов на конфокальцном программном обеспечении. Примите к сведению эти измерения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не разбить цель в нижней части образца блюдо, которое также может привести к образцу блюдо вступают в контакт с наконечником AFM, потенциально повреждая его.
  11. При необходимости снимите лазерный световой фильтр и убедитесь, что лазер AFM находится на свете, чтобы лазерный свет стал виден в оптике.
    1. Используя лазерные циферблаты выравнивания, перемести лазер в поле зрения и вблизи наконечника AFM. Как только лазер находится в этом месте, замените лазерный световой фильтр.
    2. Используя лазерные циферблаты выравнивания, поместите лазер на задней стороне, где наконечник AFM находится на кантилевере. На данный момент, лазерная панель выравнивания должна читать сумма сигнала больше, чем 0,0 В. Если сумма сигнала не получена, отрегулируйте зеркало с помощью ручного управления зеркальной ручкой до тех пор, пока сумма сигнала больше 0,0 V читается на экране.
    3. Перемещение лазера в небольших количествах во всех направлениях на кантилевере AFM до тех пор, пока не будет достигнут максимальный сигнал суммы, но позиция находится на кончике AFM. После того, как лазерное положение установлено, обнуление вертикального и бокового отклонения с помощью ручного управляемого отклонения циферблатов.
    4. Наблюдайте за панелью лазерного выравнивания на программном обеспечении AFM и с помощью вертикальных и боковой ручки отклонения на голове AFM, выровнять детектор так, что цель по центру (красная точка в центре перекрестия) и нет вертикального или бокового отклонения.
  12. Откройте окно калибровки в программном обеспечении AFM. Вввемите всю конкретную информацию эксперимента. Перед калибровкой выключите источник света конфокального микроскопа и закройте корпус AFM, если это применимо, чтобы ослабить любой потенциальный шум, поступающий из комнаты света или вибрации комнаты. Затем нажмите кнопку калибровки, чтобы автоматически позволить системе откалибровать наконечник. После завершения калибровки в рамках калибровочной панели будет обеспечена жесткость кантилевера (N/m) и его чувствительность (нм/В). Обратите внимание на это для более длительного анализа.
  13. Оттягивать кантилевер AFM по крайней мере 2000 мкм с степпер двигателей. Снимите голову AFM со сцены и удалите калибровочное блюдо. Поверните или вставьте нужную цель. Убирая цель 10% рабочего расстояния, если система запрограммирована для поддержания той же координационной плоскости между целями. Если это нефтяная цель, поместите одну каплю масла погружения на глаз цели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опровержение цели снижает вероятность объективного контакта с образцом блюда во время размещения.
  14. Чтобы надежно удерживать образец блюда на месте, используйте ватный тампон, чтобы применить небольшие мазки вакуумной смазки по краю образца кольца в стадии образца, или использовать образцы клипов. Тщательно загрузите образец блюда в стадию образца.
  15. После того, как образец находится, поверните его несколько раз, чтобы обеспечить хорошее уплотнение блюдо для образца держателя через смазку. Поднимите цель на дно блюда, пока масло просто фитили над глазом цели.
  16. Используя микроскоп, без головы AFM на сцене, сосредоточьте систему визуализации так, чтобы образец был в фокусе. Обратите внимание на эту высоту z для справки.
  17. Тщательно замените голову AFM на платформу.
  18. Используя двигатели stepper z, опустите кончик к образцу. По мере снижения наконечника AFM при необходимости отрегулируйте таблицы (LUTs) в ярком изображении. Опустите кончик до почти резкого. Используя микрометров наконечника AFM с ручным управлением, переместите головку AFM так, чтобы наконечник AFM был в центре или влево по центру поля зрения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку высота z AFM была отмечена ранее в шаге 3.6, могут быть предприняты более крупные шаги, чтобы снизить наконечник AFM, однако, смазка была добавлена в нижней части блюда и потенциально масла к цели, так что это значение только для справки. Рекомендуется сделать 50 - 100 мкм шагов и регулировки меньше, как кончик приходит в фокусе
  19. Корректировать положение лазера с помощью ручных микрометров на головку AFM. При необходимости обнуляйте вертикальные и боковое отклонения, регулируя соответствующие ручки и перекалибровать кантилевер AFM в образце блюда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кантилевер был откалиброван в среде, отличается от выборки, он должен быть откалиброван в среде сканирования для учета потенциального изменения рефракционного индекса. Кроме того, лазер может дрейфовать с задней стороны кантилевера из-за шума или изменения температуры. Только скорректировать лазер и перекалибровать при необходимости и в образце блюдо над стеклянным субстратом при использовании бесконтактной калибровки. При использовании контактной калибровки, перекалибровать внутри калибровки блюдо с помощью образца среды.
  20. Для достижения высокого качества конфокальных изображений микроскопа, заменить ток смягчающий световой фильтр с фильтром, который блокирует все AFM лазерного света. Этот световой фильтр не обеспечивает помех от яркого света лазера AFM.
  21. Используя кнопку автоматического подхода, обычно обозначаемую нисходящей стрелкой, опустите кончик на дно образца блюда. Установите размер/область сканирования, разрешение, точку набора, длину z и время пикселя (или используйте откалиброванные/распространяемые значения) на панели управления изображениями и начните сканирование.
  22. После завершения сканирования поднимите чип AFM на 50 – 100 мкм, прежде чем перешагировать в новое положение измерения в образце блюда. После того, как новое местоположение найдено, подойти к стеклу, и начать сканировать снова следующие шаги 3.21 и 3.22.
  23. Выберите опцию Autosave или вручную сохраните каждый генерируемый файл от каждого отдельного сканирования, нажав на Save.

4. Конфокаль процедура

  1. Откройте конфокального операционного программного обеспечения. Убедитесь, что все связанные с ними периферийные устройства, источники света и контроллеры включены и функционируют нормально.
  2. Поверните или вставьте цель низкого увеличения (10x или 20x) для просмотра образца. Убедитесь, что цель находится на безопасном рабочем расстоянии от того места, где будет иметь место образец блюда, и, при необходимости, отступить от цели, чтобы избежать любого потенциального столкновения цели с образцом. Используя ватный тампон, мазок вакуумной смазки по краю образца блюдо кольцо. При использовании масляной цели поместите одну каплю масла погружения на переднюю линзу цели
  3. Поместите желаемый образец в стадию выборки. Закрутьте образец вокруг немного времен для того чтобы обеспечить что смазка вакуума произвела плотную связь к вставке этапа образца или использует зажимы образца. При использовании масла цели, поднять цель на дно блюда, чтобы масло просто фитили над стеклянным дном. Чтобы избежать чрезмерного отбеливания, свести к минимуму окружающее освещение.
  4. Используя режимы яркого поля или эпифлуоресценции через камеру или окуляры, найдите образец и используя ручку фокусировки, сосредоточьтесь на области, которая представляет интерес, содержащую несколько ячеек или одну ячейку. Часто поле зрения в оптическом микроскопе будет больше, чем окно сканирования x-y в системе AFM (100 х 100 мкм). Внесите коррективы в положение AFM в конфокальных поля зрения с помощью панели управления двигателем в программном обеспечении AFM, так что сканирование AFM и конфокальная оптика изображения те же функции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В поле зрения, Есть, как правило, только несколько ячеек, так что легче определить, какие клетки желательно зондировать. По мере того как AFM дирижировано, клетка будет видима на програмной программе AFM и, от там, пользователь может pinpoint специфически зоны интереса для зонда.
  5. При желании, захват изображений в ярком поле или эпифлуоресценции с помощью камеры или CLSM режимов на основе этикетки образца, фокус ручки, и захват кнопок на микроскоп программного обеспечения.
  6. Используя программное обеспечение микроскопа, выберите опцию илиоткройте панель для обеспечения конфокальных возможностей (например, лазеров и последующих параметров). Эта опция обычно отмечается значениями длины волны лазерной линии.
  7. Выберите лазерные линии, подходящие для красителей, которые используются для окрашивания образцов. Включите одну или несколько лазерных линий, чтобы возбудить и изображение этих функций в образце.
  8. Установите выигрыш до значения, которое оптимизирует флуоресценцию образцов, но ограничивает количество шума. Типичным стартовым значением является выигрыш 70.
  9. Отрегулируйте мощность лазера, чтобы избежать насыщенных пикселей, но максимизировать динамический диапазон. Типичный стартовый диапазон для лазерной мощности составляет 1 - 3%.
  10. Установите размер пинхол до 1 Airy единицы, чтобы максимизировать разрешение для оптического сечения. Если образец тусклый и мощность лазера уже высока, откройте пинхол, чтобы увеличить сигнал за счет уменьшения разрешения оси z.
  11. Установите время обитаемогопикселя (т.е.скорость сканирования). Начните с 2-х годов времени и при необходимости отрегулируйте, чтобы отразить яркость выборки. Выберите размер пикселя/размер сканирования для выбранной цели, позволяя инструменту вычислить его с помощью кнопки опции Nyquist и выбранного количества пикселей на изображении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время ожидания в более толстых образцах может привести к чрезмерному отбеливанию при сборе стеков z.
  12. Выберите опцию Сканирования на программном обеспечении инструмента и начните сбор данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если прибор имеет несколько лазеров, каждый из них может быть оптимизирован самостоятельно, а затем побежал одновременно для мультифлуоресцентных изображений.
  13. Используйте ручку фокусировки, чтобы увеличить и выйти и найти оптимальное поле зрения в образце.
  14. Захват изображений с помощью кнопки захвата системы и сохранить все необходимые форматы файла образца в нужное место / папку на жестком диске компьютера, или локальный внешний жесткий диск.
  15. Продолжайте корректировать прибыль, мощность лазера, размер пинхол, скорость отбора проб и другие значения соответственно для оптимизации изображения. Индекс насыщения пикселей может быть активирован, чтобы проверить, перенасыщены ли пиксели. Если это перенасыщение присутствует, получить и лазерной мощности могут быть скорректированы для устранения насыщенных пикселей. Используйте LUTs в качестве руководства для внесения конкретных корректировок.
  16. Если это возможно, используйте скорость выборки Nyquist системы, которая отображается в программном обеспечении в виде панели или кнопки, чтобы обеспечить сбор изображений при максимально возможном разрешении.
  17. Активируйте стек confocal системы z или инструмент сбора объема изображения. Используя опцию «снизу вверх» с одной лазерной линией, в частности, лазерной линией, которая освещает функцию в образце, установите стартовые и финишные плоскости для измеренного объема.
  18. Используйте предлагаемые интервалы между плоскостами в стеке z, который рассчитывается для выполнения критериев отбора проб Nyquist для наилучшего получения осяного разрешения, предоставляемого прибором и используемой лазерной линии.
  19. При использовании нескольких лазерных линий используйте кратчайшую длину волны для расчета интервала. Когда приобретение завершится, сохраните файл в соответствующей папке.
  20. Кроме того, если априори существует знание толщины образца, определите громкость, выбрав среднюю плоскость, которая выглядит самой яркой и острой. В этой ситуации установите верхнюю половину толщины выборки над средней плоскости и нижнюю до половины толщины ниже средней плоскости.
  21. После того, как сбор образцов в этой области зрения завершен, или образец отбелен, используйте моторизованную или вручную контролируемую сцену, чтобы найти другое место, представляющие интерес для образца, и повторить шаги для сбора изображений.

5. Процедура очистки

  1. Убедитесь, что все файлы данных, как из CLSM, так и AFM, сохраняются в соответствующих местах.
  2. Убирайте чип AFM с помощью двигателей z stepper по крайней мере 2000 мкм или расстояние, которое было пройдено, чтобы добраться до поверхности образца. Снимите голову AFM со сцены и аккуратно поместите ее на место отдыха.
  3. Отвячься от цели микроскопа так, чтобы он был далеко от образца. Если использовалась нефтяная цель, то цель должна быть убрана достаточно далеко, чтобы больше не было контакта между целью и подложком образца.
  4. Используя перчатки, удалите образец и очистить от жира, и масло, если это применимо, из нижней части образца блюдо. Приобретите новую, чистую, пустую чашку Петри и заполните ее 70% этанолового раствора наполовину до трех четвертей полной. Поместите его в держатель образца и замените головку AFM, чтобы чип AFM впитал раствор этанола в течение 5 минут.
  5. В то время как чип AFM замачивается, рекомендуется начать копирование данных эксперимента на внешний жесткий диск. После погружения чипа AFM в раствор этанола, по крайней мере 5 минут, удалите голову AFM и поместите его в место отдыха.
  6. Используя перчатки, снимите держатель чипа AFM и поместите его в монтажную станцию. Аккуратно удалите чип AFM с помощью пинцета с резиновыми рукоятками. Поместите использованный наконечник обратно в расположение коробки он пришел из ориентированных от оси, чтобы обозначить, что он был использован. Для будущей справки обратите внимание, какой совет был использован в эксперименте.
  7. Вывихните из системы чашку Петри, наполненную раствором этанола, и утилизировать жидкость и тарелку. Используя перчатки, очиститель объективов и салфетки объектива, аккуратно очистите масло от цели микроскопа, следуя стандартным протоколам. Очистите держатель образца, удалив любую смазку. Утилизация всех отходов в соответствии с протоколами биобезопасности и возвращение инструментов в известные места.
  8. Закончите сбор данных с компьютера (ы) и выключите их. Отключим все инструменты, аксессуары, периферийные устройства или другие устройства, используемые для эксперимента.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника Conpokal схематично представлена на рисунке 1A, а изображение установки показано на рисунке 1B. Для того, чтобы точно сопоедать биологические структуры с помощью конфокаляций с теми же структурами в AFM, выравнивание двух систем во время установки имеет решающее значение. Выберите авторитетных конфокальных и AFM производителей, которые знакомы с пространственными требованиями друг друга. Кроме того, успешное внедрение метода опирается на хорошие процедуры окрашивания, иммобилизации биологической структуры и надлежащего выбора чаевых AFM. Высота живых клеток часто представляет собой проблему для изображений AFM. Сканирование AFM над живой ячейкой HEK показано на рисунке 2A. Высота для этой конкретной ячейки HEK составила около 10 мкм, продемонстрировано сканированием линии зеленым цветом(рисунок 2B). Наконечник AFM с нулевым смещением (наконечник находится в самом конце кантилевера) или высота наконечника, большая, чем высота ячейки(например,высота наконечника ≥ 10 мкм) будет производить очень решенное изображение отдельных ячеек. Пример плохого сканирования из-за неправильного выбора чаевых AFM включен в рисунок 2C. На этом изображении черные пиксели появились на вершине ячейки, что указывает на то, что AFM piezo находится вне диапазона из-за большой высоты ячейки. Конец кантилевера AFM появился на изображении (округлый квадрат) из-за смещения кончика в сочетании с недостаточной высотой наконечника по сравнению с высотой ячейки. Эти артефакты на изображении AFM указывают на то, что для изображения ячейки следует выбрать другой наконечник AFM.

Эффективная маркировка при окрашивании флуоресценции вместе с правильным зондом для визуализации живых клеток необходимы для этого метода. Мы выполнили трехцветное конфокальные изображения, показанные на рисунке 3A с ядерным пятном (флуоресцирование синий), микротрубочка пятно (флуоресцирование зеленый), и липофильной мембраны пятно (флуоресцирование красный). Эти живые клеточные зонды были выбраны из-за их ограниченного спектрального перекрытия и их совместимости со стандартными кубиками фильтра. Мы также включили яркое оптическое изображение на рисунке 3B.

Из AFM, анализ наконечника отступов вместе с наномеханикатической модели, производит модул карту поверхности. Пример карты модула, построенной с использованием модели Hertz, и параболического профиля (радиус 8 нм) для формы наконечника показан наложенным на 3D-реконструкцию формы клетки на рисунке 4A (это те же две ячейки, показанные на рисунке 3). Соответствующая 3D проекция лазерного конфокального z стека показана на рисунке 4B.

Метод также подходит для небольших биологических структур, в том числе отдельных бактерий, микро- и наноскопические особенности которых трудно решить с помощью световой микроскопии. Постоянное исследование использует технику Conpokal для изучения механических механизмов внутри клеточной стенки, которые влияют на устойчивость к антибиотикам в Streptococcus mutans.74 Манипуляция компонентами клеточной стенки привела к изменениям в морфологии и устойчивости к антибиотикам. Conpokal облегчает живой, в решении, сбор данных(например,поверхностная морфология, эластичный модуль, сила адгезии и шероховатости поверхности) на одноклеточных образцах для пар механических свойств с наличием или отсутствием компонентов клеточной стенки. Рисунок 5A,B включает в себя сканирование AFM и измеренную карту модула бактерии стрептококка мутанов. Лучшее разрешение было достигнуто в этом масштабе с AFM, чем с традиционной конфокальные микроскопии.

Рисунок 6 содержит конфокальные изображения колонии Enterococcus faecalis окрашены зеленым флуоресцентным пятном структуры клеток, которая крепится к стене клетки. Рисунок 5 и рисунок 6 демонстрируют применимость техники Conpokal к микробам в дополнение к эукариотических клеток.

figure-results-1
Рисунок 1: Конпокал установки.
(A)Схема техники Conpokal. (B)Изображение установки инструмента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Атомная силовая микроскопия живых клеток.
(A)AFM изображение двух клеток HEK. (B)Высота профиля (зеленая линия в A) ячейки HEK, указывающая на высоту клетки довольно велика на 10 мкм. (C) Плохое изображение AFM клетки астроцитов, где AFM пьезо находится вне диапазона на вершине клетки и есть доказательства обратной визуализации конца кантилевера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Конфокаль и яркая микроскопия живых клеток.
(A) Лазерное сканирование конфокальные микроскопии живых клеток HEK окрашенных с ядерным пятном (флуоресцирование синий), микротрубокон пятно (флуоресцирование зеленый) и липофильной мембраны пятно (флуоресцирование красный). (B)Соответствующее яркое оптическое изображение. Шкала баров составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Сравнение 3D визуализации AFM и конфокалипной микроскопии живых клеток HEK.
(A) Modulus карта построена с использованием модели Герц подходят и параболический профиль (радиус 8 нм) для кончика формы накладываются на 3D реконструкции ячейки от AFM. (B)Соответствующая 3D проекция лазерного конфокального z стека с ядерным пятном (флуоресцирование синий), микротрубочка пятно (флуоресцирование зеленый) и липофильной мембраны пятно (флуоресцирование красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: AFM образца бактерий.
(A) AFM сканирования и( B) измеряется модульная карта бактерии Streptococcus mutans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Конфокальцавная микроскопия образца бактерий.
Конфокальные изображения колонии Enterococcus faecalis с зеленым флуоресцентным мембранным пятном. Шкала бар составляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conpokal является передовой, эффективной техникой для сбора высококачественных изображений и на месте механических свойств живых биоматериалов в жидкой среде. Способность собирать исключительные морфологические и топографические изображения в сочетании с живыми механическими свойствами простирается мимо типичных методов электронной и световой микроскопии. Отдельно конфокальный микроскоп обеспечивает яркое поле, эпифлуоресценцию и лазерное сканирование конфокальных возможностей для достижения высококачественных, подробных флуоресцентных изображений образцов. AFM обеспечивает механическую характеристику, но без вспомогательной оптики становится трудно ориентироваться в образце. С помощью этих двух систем пользователь может собирать изображения и механические свойства одной и той же ячейки во время эксперимента, что является большим преимуществом перед двумя отдельными инструментами. Цель этой рукописи заключается в информировании и руководстве пользователей об обширных возможностях объединенной системы Conpokal для будущего биологии, инженерии и здравоохранения. Протокол включает в себя подготовку инструментов, культурных средств массовой информации, посуды, подбор микроорганизмов, процедуру AFM, конфоканую процедуру и очистку. Наиболее важными шагами для успешного живого, в решении, Conpokal сессии являются выборка иммобилизации, разумный выбор чаевых, и живое исполнение пятна. В разделе обсуждения этой рукописи будут подробно останавливаться на рекомендациях по культуре, советах по устранению неполадок и оперативных руководящих принципах, а также о будущей работе над техникой Conpokal. Рекомендации по культуре будут охватывать рекомендации по культуре выборки, иммобилизации и окрашиваниям. Советы и рекомендации AFM, confocal и Conpokal обсудят выбор чаевых и калибровку, разрешение, ограничения и почти одновременную операцию. Будущая работа включает в себя перспективы и потенциал для перспективных путей исследования.

Протокол охватывает культуру, зондирование и визуализацию образцов живых клеток и фиксированных бактерий. Одна из проблем, присутствующих при проведении AFM в жидкости проистекает из кантилевер движения обструкции из-за образца помехи и гидродинамического сопротивления. Если образец не очень хорошо прилип к субстрату, существует потенциал для загрязнения кантилевера секциями образца, плавающими в жидкости. В этом случае измерения скомпрометированы, поскольку они являются предположением о эластичной приверженности и микромеханических свойствах образца. Клетки HEK не были обработаны с фиксатором, однако, S. mutans и E. faecalis требуют дополнительной иммобилизации, подобно другим прокариотическим клеткам. Выбранные бактерии показали активное движение, которое препятствовало зондированию клеток и визуализации, поэтому образцы были мягко, химически зафиксированы для содействия иммобилизации. Есть альтернативы химической фиксации, такие как фильтр мембраны, которые физически ловушки отдельных клеток впорах 75.

Выбор подсказок также является важнейшим компонентом настройки и работы AFM. При использовании механических свойств, основанных на деформации биоматериала, необходимо учитывать жесткость кантилевера и совместимость материальной жесткости, что является нетривиальной задачей. Основная цель состоит в том, чтобы наилучшим образом соответствовать жесткости материала с жесткостью выбранного кантилевера. Если кантилевер намного мягче образца, он будет подвергаться слишком сильному отклонению. Если кантилевер жестче, чем образец, то детектор AFM может быть не в состоянии захватить такие небольшие отклонения. Рекомендуется при выборе подходящего кантилевера AFM, выбирать на основе экспериментального применения. Для сбора подробных изображений в режиме прерывистого контакта, советы AFM в диапазоне 0,1 - 0,3 Н/м для жесткости и радиуса наконечника в пределах 5 нм - 100 нм эффективны для живой визуализации клеток. Рекомендуются небольшие конические советы. Острые советы обеспечивают небольшую контактную зону и способность indent дальнейшей помощи в сборе мелких деталей и особенностей в образцеморфологии 76. Тем не менее, резкие советы также могут быть проблематичными, поскольку они склонны к проколуобразцов,когда настройки (например, точка набора, пиксельное время, скорость подхода) требуют слишком много отступов или отступ слишком быстро. Чтобы избежать эффектов высокой скорости напряжения, локального затвердевания штамма вблизи резкого наконечника, или просто контролировать зону контакта и приближаться к скорости, многие предпочитают использовать силовую спектроскопию с коллоидным наконечником для измерения эластичного модула.

Советы AFM в диапазоне от 0,01 до 1,0 Н/м для жесткости и радиуса наконечника в пределах 1 - 5 мкм рекомендуется для измерения эластичных модули живых клеток. Большие размеры кончиков, как правило, стеклянные коллоиды, обеспечивают известную область контакта и вряд ли проколоть клетку при контакте. Прямоугольные кантилеверы предпочтительнее треугольных, потому что во время калибровки, бесконтактный метод может быть использован для прямоугольной геометрии по сравнению с контактной калибровкой для треугольной геометрии. Кроме того, в связи с деликатным характером советов AFM, рекомендуется, чтобы оператор реализует пинцет с резиновыми наконечниками, чтобы уменьшить потенциал для повреждения деликатный чип AFM или монтаж блока. Другие параметры, которые необходимо иметь в виду, включают скорость подхода наконечника AFM и количество отступов в образец. Хорошим ориентиром является сохранить отступ около 10% от толщины (или высоты) образца и выбрать скорость, которая исключает потенциальное гидродинамическое сопротивление опытных cantilever38.

Сложные экспериментальные приборы обычно бывают с препятствиями, которые требуют устранения неполадок в приборе настройки, калибровки и эксплуатации. Сбой наконечника AFM или кантилевера в образец или образец субстрата является распространенной ошибкой для новых пользователей. Чтобы избежать этой проблемы, протокол предлагает поддержку кантилевера из 2000 мкм. Этот шаг гарантирует, что наконечник не вступают в контакт с нижней части блюда, если предыдущий пользователь забыл отступить отзыв при очистке после экспериментов. Тем не менее, расстояние в 2000 мкм было выбрано для выбранного держателя блюда, используемого в этом протоколе. Другой диапазон, больше или меньше, возможно, потребуется выбрать в зависимости от стиля держателя блюда используется. Во время выравнивания лазера и детектора в протоколе упоминается регулировка зеркальной ручки для максимизации суммы сигнала. Ручка регулировки зеркала не может присутствовать на всех AFMs. Если присутствует, однако, один из способов манипулирования инструментом для устранения неполадок сигнал низкой суммы заключается в том, чтобы настроить зеркальную ручку, используемую для учета среды, в которой будет происходить сканирование; жидкости(например, воды,средств массовой информации, PBS) или воздуха. Из-за разницы в индексе преломления света через воздух и через жидкость, зеркальная ручка, возможно, потребуется настроить. Максимальная чувствительность изгиба кантилевера AFM будет находиться в расположении наконечника AFM, поэтому лазерный свет, который возвращает положение изгиба через его размещение на фотодиоде, должен быть расположен в расположении наконечника AFM. В зависимости от выбранного наконечника AFM значение сигнала суммы может варьироваться от 0,3 до 3,0 В. Задняя часть покрытия на кантилевере AFM, такая как Cr-Au или Al, увеличит сумма сигнала и чувствительность измерения.

Геометрия наконечника актуальна при завершении калибровки наконечника во время операции AFM. Было достигнуто хорошее соглашение между бесконтактной и контактной калибровкой. Если выбранный кантилевер AFM не прямоугольный, необходимо будет проработать контактную калибровку. Имейте в виду, что среда, в которой наконечник откалиброван, должна быть такой же, как образец среды. Если эти жидкости отличаются, пользователь должен перекалибровать. При использовании наконечников AFM в жидкости частота, измеряемая системой, должна быть от одной четверти до одной трети от частоты естественного резонанса, обозначаемой производителем. Хороший способ проверить, что система откалибровала наконечник правильно, чтобы проверить значения в тепловом шуме файл, который генерируется. Убедитесь, что этот файл сохраняется в соответствующей папке. Если система имеет проблемы калибровки или несуществеющие значения выйти, перекалибровать, или настроить лазерное положение немного затем перекалибровать.

Еще одной причиной плохой суммы сигнала может быть связано с AFM cantilever выравнивания. Когда чип AFM устанавливается в стеклянный блок, важно, чтобы кончик кантилевера остается в небольшом лазерном окне (гладкая стеклянная область). Если чип находится слишком далеко вперед, угол, под которым cantilever естественно лежит может вызвать проблемы с отражением от кантилевера, отсутствует фотодетектор и в результате плохой сигнал суммы. Если чип находится слишком далеко назад, лазер не сможет отразиться от задней части кантилевера, вызывая плохой сигнал суммы. По этим причинам, установленный чип AFM, возможно, потребуется настроить. Кроме того, другая проблема, которая может возникнуть, возникает с высотой выборки. Инструмент AFM, используемый в этом протоколе, имеет максимальный диапазон пьезо z (высота) 15 мкм. Если пользователь обнаружит, что программное обеспечение не в состоянии собрать данные о высоте и заставить карты в определенном пикселе, появится черный ящик, указывающий, что система находится вне диапазона(рисунок 2C). Один из способов снять эту проблему заключается в том, чтобы установить высоту пьезо на более низкое значение, например, 2 или 3 мкм, так что большая часть диапазона 15 мкм стремится к отображению ожидаемой высоты ячейки. Этот метод должен, в большинстве экспериментов, связанных с клетками или бактериями, исправить проблему, связанную с диапазоном z.

Экспериментаторам, которые требуют расширенного диапазона z для высоких образцов с высотой более 10 - 15 мкм, возможно, придется проводить дополнительный модуль на AFM. Производители AFM имеют эту опцию, доступную за дополнительные расходы для большинства систем. Расширяя диапазон z, экспериментатор имеет доступность для сканирования образцов, которые считаются высокими в микро-масштабе с небольшими проблемами для вне диапазона значений или модификации двигателя AFM piezo. Хотя эти модули стоят дополнительно, некоторые, в зависимости от производителя, могут предложить дополнительную высоту, до 100 мкм в направлении z. Confocal по-прежнему возможно с более высокими образцами, если пользователь имеет большое расстояние работы, высокая цель увеличения или готов использовать воздушные цели, возможно, 20x или 40x. Снижая объективное увеличение микроскопа, рабочая дистанция увеличивается, набирая расстояние, чтобы посмотреть вершину более высокой выборки. Эта модификация к более низкой цели увеличения будет жертвовать разрешением. В conpokal установки, упомянутые в этой рукописи, 60x TIRF (полное внутреннее отражение флуоресценции) цель имеет рабочее расстояние около 100 мкм мимо крышки стеклянного дна образца блюдо.

Что касается конфокального микроскопа, о котором говорится в этой рукописи, то обсуждается несколько важных положений. Конфокальная система, используемая для производства фигур в этой рукописи, реализовала 60-х масляную цель TIRF с численной диафрагмой 1,49. Лазерные линии на 405 нм, 488 нм и 561 нм возбудивания длин волн были использованы для живой образец клетки изображения, показанные на рисунке 3 и рисунок 4. Предел дифракции конфокального микроскопа может быть определен с помощью уравнения Abbe Resolution, Abbe Resolution (x,y) и 2NA, где длина волны возбуждения для Alexa 488, на 488 нм, и NA является диафрагмой для конфокального конденсатора, который составляет 0,3. Таким образом, определяется аксиальное разрешение 272 нм. Для эпифлуоресценции изображения, два случая рассматриваются для определения разрешения, где пинхол установлен в один воздушный блок (AU) и 0,5 а.е. В последнем случае пинхол закрывается таким образом, что происходит значительная потеря света, но разрешение увеличивается. Конфокальное программное обеспечение вычисляет боковой родной и axial родной резолюции на 170 нм и 290 нм для пинхол на 0,5 а.е., и 200 нм и 370 нм для пинхол на 1 АС, соответственно. Сферические аберрации, введенные в систему, могут быть учтены в процессе деконволюции для увеличения контрастности и разрешения в микроскопических изображениях. Из-за ограничений дифракции, которые присущи конфокальные микроскопы, конфокальные изображения колонии бактерий на рисунке 6 не хватает соответствующего разрешения для деталей видели в AFM сканирования бактерий на рисунке 5. AFM предоставляет доступ к наномасштабным функциям и деталям, которые трудно запечатлеть с помощью конфокального микроскопа. Однако, в зависимости от требуемого разрешения флуоресценции необходимо, рисунок 5 и рисунок 6 демонстрируют применимость техники Conpokal к микробам в дополнение к эукариотических клеток.

Преимущество использования конфокального микроскопа позволяет оператору собирать 3D-изображения конкретных областей в образце с заточенными деталями. Эти изображения коррелируют с AFM, просматривая поверхность, которая была исследована через изображение AFM и конфокального сканирования той же области. Так как микроскоп инвертирован, изображение эпифлуоресценции собирает световую информацию с противоположной стороны пробы, которая была исследована. Пинхол внутри конфокальной системы помогает ограничиться одной плоскости с определенного расстояния при фильтрации света, который исходит от остальной части образца или даже комнаты. По существу, пинхол помогает изолировать свет, поступающий из одной плоскости интереса к образцу. Как правило, эта интересная плоскость должна содержать сильные маркеры флюорофора, поскольку для перевернутых конфокальных систем обнаружение одной молекулы будет ограничено конфокальные микроскопы более высокого разрешения. Эпифлюоресценция освещения менее желательна в связи с тем, что в режиме эпифлуоресценции, любой свет от образца, который отражается в цели собирается и используется для создания изображения, поэтому невозможно изолировать одну плоскость. Confocal методы обеспечивают более изолированные одно плоскости изображение образца особенность в вопросе из-за пинхол77. Если, например, вершина эукариотической клетки зондирована AFM, эта же поверхность может быть изолирована с помощью лазерного сканирования конфокальных возможностей микроскопа, а не с режимом эпифлуоресценции изображения. Рекомендуется следить за здоровьем/формой клеток во время получения данных с помощью изображений одновременно в режиме контрастного дифференциального интерференции с помощью передаваемого детектора света и лазерной линии 488 нм. При захвате z стек образца, для процедуры, подробно описанной выше, только получить детектор регулируется. Любое морфологическое изменение клеток во время измерения, которое не обязательно видно в флуоресцентных каналах, указывает на то, что артефакты вводятся в измерение.

Идеальное расстояние между плоскостами можно получить, следуя рекомендации программного обеспечения для кратчайшей длины волны, используемой в технике визуализации. Родное разрешение и отношение сигнала к шуму в объемах изображения могут быть эффективно улучшены с помощью алгоритмов деконволюции, доступных в модуле обработки изображений программного обеспечения приобретения. Тем не менее, выполняя флуоресцентную микроскопию, выбор конкретных пятен и красителей имеет жизненно важное значение, чтобы избежать раннего отбеливания или перекрестного стебля от перекрывающихся возбуждающих/эмиссионных спектров. В некоторых случаях пользователь может столкнуться с неисправностью в конфокальных генерации света. Если пользователь испытывает недостаток светового излучения или неисправных лазерных линий, одним из способов устранения неполадок является сброс системы, как правило, делается путем перезапуска операционного программного обеспечения. Если проблема сохраняется, детектор передаваемого света, возможно, не смог переместиться в оптический путь светового микроскопа или из него. Сброс положения детектора передатчика может помочь облегчить сбор света или проблемы с лазерной визуализацией.

Основное внимание в инструменте Conpokal уделяется предоставлению пользователям возможности собирать оптическую и напорную информацию о живых биоматериалах в жидкой среде одновременно и на одной клетке или объекте. Эта работа явно описывает, как выполнять эти эксперименты в жидкости, естественный дом для многих биоматериалов, хотя, сухие эксперименты все еще могут быть выполнены с помощью приборов. С образцами, приготовленными в чашках Петри, высота чашки является ограничением. В связи с конфигурацией стеклянного блока, который держит кантилевер AFM, боковые стенки посуды должны быть под 10 мм в высоту; если блюдо слишком высокое, инструмент не сможет опустить наконечник AFM на поверхность образца или субстрата.

Хотя существует ограничение по размеру выборки, нет никаких ограничений с инструментом или программными возможностями в отношении задержки времени. Одновременно confocal и AFM по возможности с правыми факторами в месте. Ограничение, которое способствует его почти одновременные возможности относится к шуму, который генерируется при выполнении определенных функций конфокальные микроскопии и атомной микроскопии силы функции одновременно. Вибрации от двигателей, которые перемещают цель микроскопа во время сбора стека z, будут добавлены к сигналу от наконечника зонда AFM во время его движения. Шум будет усилен нефтяной целью, так как двигатели движутся вверх и вниз в направлении z, чтобы осветить последовательные плоскости в образце. Таким образом, рекомендуемый протокол включает в себя последовательное собрание AFM сканирования и конфокальные z стек изображений. Одновременно CLSM и AFM потребуется стационарное изображение с confocal, однако, с текущей техникой, время задержки для двух инструментов может быть как короткие, как десятки секунд. Фактическое время перехода от операции AFM к конфокальные изображения составил около 2 - 4 минут для изображений, собранных на рисунке 2A и рисунок 4B. Это значение было определено путем вычитания двух периодов времени сбора изображений из общего времени 33 минут, которое включает в себя время, чтобы начать и завершить сканирование AFM, переключить режимы инструмента для активации конфокальных изображений, и начать и завершить конфокальный стек изображения z.

Будущее Conpokal направлено на изучение новых структурно-функциональных отношений в дополнение к острому пониманию процессов одной клетки. Например, эксперименты по лечению на месте наркотиков на клеточном или бактериальном образцах для определения воздействия эластичности клеток были бы продвижением к полям биоматериалов, биологии и биомеханики. Лечение терапии в образец блюдо в то время как изображения и зондирования даст знания о том, как образец реагирует на терапии в живой и тщательно контролируемой среде, с течением времени. Включение нового препарата или экологические проблемы расширит понимание того, как цитоскелет или органель расположение влияет на передвижение, топология, жесткость и т.д. Другим потенциальным достижением Conpokal является возможность иметь полный экологический контроль над системой. Текущий Conpokal упомянутых в этом протоколе размещается внутри акустического корпуса, предназначенного для снижения шума изнутри лаборатории. Улучшение этого жилья даст возможность проверить в рамках, возможно, одного или сочетания факторов, не ограничиваясь такими, как стерильная среда, температура контролируемых, или даже переменной гравитации. В нынешнем виде метод Conpokal обеспечивает эффективный и полезный подход для характеристики живых, в жидком биоматериалах, но будущее этого метода только еще больше продвинуть эти возможности.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем финансирование NIH COBRE под номером P20GM130456. Мы благодарим Британское ядро световой микроскопии, которое поддерживается вице-президентом по исследованиям, за помощь в этой работе. Штаммы S. mutans и E. faecalis предоставила доктор Наталья Короткова. Первое упоминание игры на словах, Conpokal, чтобы описать сочетание конфокальные микроскопии и атомной микроскопии силы приписывается д-р Брэд Беррон, химической и материалотехники, в Университете Кентукки, в беседе с д-ром Мартой Грейди (соответствующий автор) в ожидании прибытия семинара оратор д-р Джонатан Фам, который присоединился к факультету в области химической и материалотехники в Университете Кентукки осенью 2017 года.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Акустический корпусJPK-BrukerАкустическаякамера для снижения шума
BioTracker 488 Зеленые микротрубочки Цитоскелет Красительдля миллипор SigmaSCT142Используется для маркировки микротрубочек в клетках млекопитающих
CP-qp-CONT-BSG АСМ-наконечникиNanoAndMoreCP-qp-CONT-BSG-BКоллодальные наконечники АСМ, подходящие для измерения модуля упругости на биологических образцах
Дил Краин (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат ('DiI'; DiIC18(3)))ThermoFischer ScientificD282Используется для маркировки плазматической мембраны клеток млекопитающих
Модифицированная среда Dulbecco's EagleVWRVWRL0100-0500Компонент среды клеточных культур
Фосфатно-солевой буфер DulbeccoThermoFisher ScientificA1285601Используется для моделирования биологической среды
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаFischer Scientific45000-736Компонент среды для клеточных культур
Fisher BioReagents Микробиологические добавки к средам: Экстракт дрожжейFischer ScientificBP1422-500Компонент среды для бактериальной культуры
FluoroDish Чашка для клеточных культурWorld Precision Instruments (WPI)FD35-100Посуда со стеклянным дном, боковые стенки которой менее 10 мм, необходимы для полноценного функционирования Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 нуклеиновая кислота окрашиваниеThermoFischer Scientific62249Используется для маркировки ядра клеток млекопитающих, хороший ядерный маркер для живых клеток
Эмбриональная почка человека 293 клеткиATCC Глобальный биоресурсный центрCRL-1573Клетки млекопитающих, используемые в протоколе
MatrigelVWR47743-716Покрытие в чашке для клеточных культур
Модель: PFQNM-LC-A-CAL AFM tipsBrukerPFQNM-LC-A-CALНаконечники АСМ, которые хорошо подходят для образцов большой высоты (например, эукариотических клеток)
NanoWizard 4aJPK-BrukerNanoWizard 4aAFM
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Nikon A1NikonA1 HD25используемый для светлопольной, эпифлуоресцентной и конфокальной визуализации
ПЕНИЦИЛЛИН/СТРЕПТОМИЦИНVWR16777-164Компонент среды
для клеточных культурPetriDishHeaterJPK-BrukerPetriDishHeaterПоддерживает желаемую температуру образца чашки Петри
qp-BioAC-Cl Наконечники AFMНаносенсорыqp-BioAC-Cl-10Три различных консоли AFM различной жесткости
Сменный пинцет с наконечником из углеродного волокнаTed Pella Inc.5051Используется для аккуратного размещения и удаления деликатных наконечников АСМ в стеклянный монтажный блок
Todd Hewitt Broth BactoBD DIFCO Bacterius LtdBacto-249240Компонент бактериальной питательной среды
Ванкомицин, BODIPY FL ConjugateThermo Fisher ScientificV34850Используется для флуоресцентного мечения клеточной стенки бактерий
Микроскоп ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602(2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102(2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102(2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046(2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809(2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9(2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101(2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429(2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564(2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54(2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011(2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427(1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236(2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546(2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи