Биомиметическая репликация микроструктуры поверхности корня с использованием изменения мягкой литографии

Репликация микроструктуры поверхности листа является известным методом в области исследований биомиметики^1,,2,,3,4. Самые ранние репликации микроструктуры поверхности листа были выполнены с использованием лака для ногтей и резиновых материалов, нанесенных на поверхность листа для лучшей визуализации микроструктуры, в частности stomata^{5,,6,7,8,9,10}. Метод был затем усовершенствован, и передовые полимеры были использованы для имитации микроструктуры поверхности листьев с помощью мягкой литографии, особенно в контексте биомиметики супергикофических поверхностей^2,3,4,11,12. В последние годы этот метод был доказан в качестве полезного инструмента в изучении взаимодействия между поверхностью листьев и микроорганизмов, проживающих на поверхности, являются ли они патогенными^13,14 или полезным, как часть естественной филлиосферы листьев¹⁵. Упрощение естественной системы оказалось чрезвычайно полезным при изучении поверхностно-микроорганизмных взаимодействий даже тогда, когда чисто синтетические системы использовались в качестве поверхностей^{15,,16,,17,,18.}

В то время как репликация микроструктуры поверхности листьев была показана как полезный инструмент для изучения взаимодействия, происходящего на поверхности листа с различными микроорганизмами, такого инструмента для корней растений не существует. Корни растений труднее изучать, так как они находятся под землей, и все взаимодействия происходят в почве. Как и листья, микроструктура поверхности корня, вероятно, будет играть определенную роль в корневых и микроорганизмных взаимодействиях. Однако в настоящее время не существует метода изоляции конкретной роли микроструктуры поверхности корня в сложных корневых и микроорганизмных взаимодействиях. Наиболее изученной микроструктурной особенностью поверхности корня является корневые^{волосы 19,,20,,21}. Корневые волосы играют важную роль в увеличении площади поверхности и тем, что позволяет более эффективное потребление питательных веществ и^{воды 22}, однако их участие в качестве структурной особенностью в корневых микроорганизмов взаимодействия никогда не были протестированы.

Наиболее широко используемым полимером для мягкой литографии в листьях является полидиметил силоксан (PDMS). PDMS свойства напоминают те из листа кутикулы^15,23. Однако, в корнях растений, наиболее распространенным материалом является целлюлоза²⁴,^25, которая имеет различные свойства, чем у PDMS^26,27,28.^, Использование PDMS для создания синтетической платформы для изучения эффектов микроструктуры поверхности в корневых взаимодействиях является, следовательно, менее чем идеальным.

Представленный здесь протокол позволяет формировать синтетическую микроструктурную реплику поверхности корня из различных материалов. Как и метод репликации микроструктуры поверхности листа, это двухступенчатый процесс. Первый шаг использует биологическую ткань (корень) в качестве источника для литья в полиуретановую форму (отрицательная реплика). Полиуретановая плесень, которая представляет отрицательное изображение микроструктуры поверхности корня, может быть использована в качестве основы для генерации положительной репликации микроструктуры поверхности корня из различных материалов, включая PDMS и производные целлюлозы. Эта репликация поверхности корня может быть позже использована в качестве платформы для понимания роли структуры поверхности в корневых взаимодействиях микроорганизмов.

1. Выращивание растений и подготовка корней

1. Вариант 1: Подготовка авантюрных корней из стебля.
   1. Возьмите укоренения лоток для выращивания растений.
   2. Заполните лоток с почвой.
   3. Добавьте одно семя томатного сорта M82 в каждую клетку в подносе.
   4. Обложка семена с небольшим количеством почвы.
   5. Вода лоток со дна с капельницы, как вода заполняет дно лотка и почва поглощает воду.
   6. Добавляйте 2 л удобрений на 1 л воды на дно лотка раз в неделю.
   7. Расти в растущей камере при 25 градусах Цельсия.
   8. Используйте условия освещения 9 ч света (7:00-16:00) чередуются с 15 ч темноты.
   9. Через 3 недели вынуть растение из почвы.
   10. Вырежьте корневую систему от растения в точке взаимодействия со стеблем.
   11. Положите безкорневое растение в стакан, наполненный водой.
   12. Через несколько дней, вырезать adventitious корни, которые выходят из стебля и использовать их для репликации.
2. Вариант 2: Подготовка семени прорастающих корней.
   1. Влажные чашки Петри размера фильтровальная бумага с водой.
   2. Положите несколько семян M82 (не более 10) на бумагу, внутри чашки Петри.
   3. Инкубировать пластину при 25 градусов по Цельсию.
   4. Гидрат бумаги каждый день.
   5. После проросания корни достаточно долго (примерно 5 дней), удалить семена и использовать корни для репликации.

2. Приготовление корневой отрицательной реплики из полиуретана

1. Для создания отрицательного раствора реплики добавьте 9,49 г диметакрилата диметакрилата в 20 мЛ.
   1. Добавьте 1,45 мл этилового метакрилата в флакон.
   2. Перемешать при комнатной температуре (RT) до тех пор, пока раствор не станет ясным и не станет однородным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 2 ч достаточно для достижения однородного решения.
   3. Добавьте 3 мл пластификатора, дитил фталата и перемешайте 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диэтил фталат ошибся в акрилат мономер.
   4. Добавьте 300 мл инициатора фото, 2-гидрокси-2-метилпропиофенона, и перемешайте на ночь на RT. Продолжайте помешивая, пока все пузырьки не будут удалены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Решение можно сохранить на RT.
2. Чтобы создать отрицательную копию корня, возьмите чистый стеклянный слайд и залейте 1 мЛ отрицательного раствора реплики на нем.
   1. Поместите 2'u20123 корни над решением. Не допускайте, чтобы корни были полностью покрыты раствором.
   2. Держите слайд под 8 W ультрафиолетовый (УФ) лампы для 8'u201210 мин. Не держите раствор под ультрафиолетовым светом слишком долго.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не держать раствор под ультрафиолетовым светом слишком долго, как это делает полиуретан слишком трудно, что делает невозможным удаление корня.
   3. Выключите УФ-лампу, снимите реплику со стеклянной горки и поместите ее в чашку Петри, наполненную этанолом, чтобы удалить неотредактированный мономер.
   4. Чтобы получить отрицательную реплику, удалите корень из реплики очень медленно с помощью щипцов.

3. Подготовьте корень положительной реплики из PDMS.

1. Для создания смеси для положительной реплики, поместите 10 г диметил силоксан в бумажный стаканчик.
   1. Добавить 1 г лечащей вещества и тщательно перемешать.
   2. Держите смесь в детикаторе под вакуумом в течение 2 ч, чтобы удалить пузырьки воздуха.
2. Чтобы создать положительную копию, поместите полиуретановую отрицательную реплику в чашку Петри.
   1. Налейте смесь PDMS поверх отрицательной реплики.
   2. Нанесите вакуум на 2 ч для обеспечения покрытия микроструктуры.
   3. Держите чашку Петри на ночь на RT.
   4. Отделить вылеченную положительную копию от отрицательной реплики вручную.

4. Подготовьте корень положительной реплики из этилового целлюлозы.

1. Для создания этилового раствора целлюлозы, положить 1,32 мл диэтил пталата в качестве пластификатора в 100 мл чашки.
   1. Добавить 20 мл этанола и перемешать на RT в течение 2 ч.
   2. Добавить 3,3 г этилового солелу и перемешать на ночь.
2. Чтобы создать положительную копию, поместите полиуретановую отрицательную реплику в чашку Петри.
   1. Налейте раствор этилового целлюлозы поверх отрицательной реплики.
   2. Держите чашку Петри на ночь на RT под капотом.
   3. Удалите положительную реплику из отрицательной реплики очень медленно щипцами.

Чтобы сформировать репликацию микроструктуры поверхности корня, корень должен быть выбран для литья. Мы выращиваем томатные растения в почве, что делает использование естественного корня из корневой системы чрезвычайно сложным. Удаление почвы из корневой системы может быть затруднено и дополнительно, корни корневой системы хрупкие и могут сломаться при попытке литья. Поэтому мы предлагаем сначала использовать более жесткие корни, чтобы установить протокол в лаборатории. Формирование таких корней описано на рисунке 1A. Корневая система растения удаляется после того, как растение было выращено в течение 3 недель, а безкорневое растение помещается в воду в течение недели, пока из стебля не вытекают самые претенциозные корни. Эти корни могут быть использованы для репликации во время создания протокола. После того, как протокол был хорошо установлен, желательно более реалистичное покрытие корневой поверхности. Здесь мы предлагаем избегать корней, выращенных в почве, как полное удаление почвы в чрезвычайно сложной задачей. Вместо этого мы предлагаем использовать прорастающие корни, поставляя ценную информацию о микроструктуре поверхности корня генетически специфического растения. Рост таких корней описан на рисунке 1B. Семена помещаются на влажную фильтровальную бумагу и инкубируют при 25 градусов по Цельсию. Примерно через 5 дней, в течение которых фильтровальная бумага сохраняется влажной, проросли корни достаточно долго для репликации. Эти корни являются более хрупкими, чем ранее предложенные корни и требуют более деликатного ухода.

Производство реплики микроструктуры поверхности корня представляет собой двухступенчатый процесс. На первом этапе естественный корень формируется в форму на основе полиуретана (отрицательная реплика). Преимущество этого шага заключается в том, что все материалы для полиуретановой формы готовятся и корень помещается на вершине подготовленного раствора в самом конце для 10 мин воздействия УФ. В результате, биологическая ткань не подвергается суровым условиям слишком долго и может быть мягко обработаны в конце процесса. Если следуют все шаги протокола, генерируется хорошая отрицательная реплика. Эта реплика покажет структуру клетки поверхности корня, а также отверстия, представляющие расположение корневых волос(Рисунок 2A). Если некоторые критические шаги в протоколе не выполняются, процедура не будет выполнена. Одним из таких шагов является размещение корня на полиуретановом растворе перед лечением. Корень должен быть помещен очень осторожно, чтобы избежать погружения его в полиуретаново решение. Такое погружение, любой части корня, вызовет захват корня в твердом полимере без возможности удалить его. Если такое событие происходит, корень останется в пределах отрицательной реплики после того, как он вылечился(Рисунок 2B). Другим важным шагом является лечение время УФ-излучения. Рекомендуемое время лечения составляет 8'u201210 мин. Переход мимо 10 мин приведет к чрезвычайно жесткой полиуретановой формы, что делает невозможным удалить корень, не нарушая его в полиуретановой формы. Поломка корня иногда может быть видна невооруженным глазом, например, при поломке большого куска(рисунок 2C, сверху, отмеченный фиолетовыми стрелками). Тем не менее, иногда мелкие кусочки корня остаются в материале, который трудно обнаружить невооруженным глазом и микроскоп должен быть использован(Рисунок 2C, дно, отмеченные фиолетовыми стрелками). Мы рекомендуем тщательно изучить полиуретановую отрицательную реплику с микроскопом до продолжения протокола, чтобы убедиться, что остаточного корня нет.

После того, как полиуретан отрицательные реплики подготовлены; многие материалы могут быть использованы для подготовки положительной реплики. Подготовка положительной реплики, используя полиуретановую отрицательную реплику в качестве формы, прямо вперед и полностью зависит от качества полиуретановой отрицательной реплики. Для создания положительной реплики мы использовали как PDMS-как это хорошо известно в области мягкой литографии(рисунок 3A)и этиловой целлюлозы в качестве материала, который лучше имитирует свойства корневой поверхности, которая в основном состоит из целлюлозы(рисунок 3B). Sem изображение реплики PDMS показывает волосы корня очень ясно. Волосы находятся в зоне удлинения, где они начинают появляться. Таким образом, длина корневых волос меняется вдоль поверхности корня, как они становятся длиннее, так же, как в естественном корне (Рисунок 3A). Этил целлюлоза генерирует более твердую и менее гибкую пленку, чем PDMS. Следовательно, удаление его из негативной формы требует большего ухода. Тем не менее, некоторые волосы и поверхностная микроструктура видны под световым микроскопом(рисунок 3B). Мы использовали эти два материала для создания положительной реплики, однако, любой материал, который может сформировать фильм будет хорошим кандидатом на положительные реплики, используя полиуретана отрицательной реплики.

Рисунок 1: Корни томатных растений для репликации. (A) Томатное (M82) растение выращивается при 25 градусах с 9 ч света и 15 ч темноты. Через 3 недели растение удаляется из почвы и корневая система отрезана. Безкорельное растение кладут в воду до тех пор, пока адвентиозные корни не выйдут из стебля примерно через неделю. Эти корни не показывают точную структуру, как корни корневой системы, но они представляют собой хорошую модель. Эти корни менее хрупкие, чем корни корневой системы, и поэтому они предпочитают работать с при создании техники в лаборатории. (B) Семена томатного (M82) помещаются на влажную фильтровальную бумагу в чашку Петри и инкубируют при 25 градусах Цельсия. Бумага увлажняется каждый день, и семена прорастают. Корни растут и примерно через 5 дней достаточно долго, чтобы быть использованы для репликации. Эти корни мягче и должны быть использованы, как только метод хорошо создан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Микроскопия изображения полиуретана отрицательной реплики. ()SEM изображение полиуретан отрицательной реплики, сделанные в соответствии с протоколом после всех шагов. Структура ячейки хорошо видна. желтые стрелки указывают на отверстия, образованные волосками в корне. (B) Свет микроскопии изображения полиуретана отрицательной реплики с корнем внутри него, как она была полностью покрыта раствором и удаление его было невозможно. Полиуретановый негатив был вылечен с корнем внутри. Корень виден глазом и с помощью световой микроскопии. Невозможно удалить этот корень из вылеченной реплики. (C) Свет микроскопии изображения полиуретана отрицательной реплики, которая хранилась под ультрафиолетовым светом слишком долго. В результате корень не может быть полностью удален из полимера ни крупными частицами, видимыми глазом (верхнее изображение, отмеченное фиолетовыми стрелками), ни небольшими фракциями, видимыми только под микроскопом (нижнее изображение, отмеченное фиолетовыми стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Микроскоп изображения положительной реплики. (A) SEM микрограф положительной реплики из PDMS. Увеличение показывает корневые волосы. (B) Свет микроскопии изображения положительной реплики из этилового целлюлозы. Волосы отображаются на изображениях справа, в то время как текстура поверхности видна на изображении слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.