Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Инъекция гидрогелевых биоматериальных каркасов в мозг после инсульта

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61450

⸱

1 октября 2020 г.

 ,  , 

В этой статье

Краткое содержание

Инсульт является глобальной проблемой с минимальными вариантами лечения и отсутствием текущей клинической терапии для регенерации потерянной ткани мозга. Здесь описаны методы создания точного фототромботического инсульта в моторной коре грызунов и последующего введения гидрогелевых биоматериалов для изучения их влияния на регенерацию тканей после инсульта.

Аннотация

Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими инсультами и определяются как внезапная закупорка сосуда, снабжающего кровью мозг. В течение нескольких минут после блокировки клетки начинают умирать и приводить к непоправимому повреждению тканей. Современные терапевтические методы лечения сосредоточены на удалении сгустков или лизисе, чтобы обеспечить реперфузию и предотвратить более серьезное повреждение головного мозга. Хотя преходящая пластичность мозга может со временем спасти часть поврежденной ткани, значительная часть пациентов остается с неврологическим дефицитом, который никогда не разрешится. Существует нехватка терапевтических возможностей для лечения неврологического дефицита, вызванного инсультом, что подчеркивает необходимость разработки новых стратегий лечения этой растущей популяции пациентов. Инъекционные биоматериалы в настоящее время разрабатываются для повышения пластичности мозга и улучшения эндогенного восстановления за счет доставки активных агентов или стволовых клеток. Одним из методов проверки этих подходов является использование модели инсульта грызунов, введение биоматериала в ядро инсульта и оценка восстановления. Знание точного местоположения ядра инсульта является обязательным для точного лечения после инсульта, поэтому модель инсульта, которая приводит к предсказуемому расположению инсульта, предпочтительнее, чтобы избежать необходимости визуализации до инъекции. Следующий протокол будет охватывать, как вызвать фототромботический инсульт, как вводить гидрогель контролируемым и точным образом, а также как извлекать и криосекционировать мозг, сохраняя биоматериал нетронутым. Кроме того, мы расскажем, как эти же гидрогелевые материалы могут быть использованы для совместной доставки стволовых клеток. Этот протокол может быть обобщен на использование других инъекционных биоматериалов в сердцевину инсульта.

Введение

Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах1. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими, в то время как большинство из оставшихся 13% являются геморрагическими2. Ишемический инсульт определяется как закупорка кровотока в артерии к окружающим тканям. Эта окклюзия приводит к кислородному голоданию и последующему некрозу, что часто приводит к постоянной инвалидности у выживших пациентов. Несмотря на снижение смертности от инсульта3,ожидается, что к 2030 году его распространенность возрастет до 3,4 млнчеловек4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты проводились в соответствии с IUCAC в Университете Дьюка и Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. В этом исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6J в возрасте от 8 до 12 недель. Животные содержались при контролируемой температуре (22 ± 2 ° C), с периодом 12-часового светло-темного цикла и доступом к гранулированной пище и воде ad libitum. Протоколы анальгезии и седации описываются как одобренные IUCAC, но могут отличаться от протоколов, используемых в других лабораториях.

Животные могут быть преждевременно усыплены, если они испытывают чрезмерное беспокойство, вокализацию (указывающую на неконтролируемую боль), самот....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью этого метода была демонстрация того, как вводить биоматериалы в мозг после инсульта. Фототромботическая модель с розовой бенгальской розой и лазером 520 нм использовалась для контролируемой ориентации поражений инсульта как по размеру, так и по местоположению. Через пять дней после инсульта инфаркт может быть визуализирован во время операции(рисунок 1B)и с помощью TTC и визуализации окрашенных слайдов IHC(рисунок 2). Увеличение диаметра лазера с 2-кратной .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем легко воспроизводимую, минимально инвазивную, постоянную модель инсульта и описываем, как ввести биоматериал в инфаркт через пять дней после инсульта. Использование фототромботического красителя Rose Bengal и коллимированного лазера 520 нм, подключенного к стереотаксическому устройству, дает нам возможность позиционировать удар в моторной коре мыши с повышенной точностью. Через пять дней после инсульта расположение инфаркта видно на глаз в центре облучения, 2,0 мм медио-латерально к брегме. Затем г.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что TS является основателем Tempo Therapeutics, которая стремится коммерциализировать гидрогели MAP.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Национальные институты здравоохранения и Национальный институт неврологических расстройств и инсульта за финансирование (R01NS079691).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% Нормальная козья сывороткаVWR100504-028Для блокировки буфера
2-слойная спиртовая предварительная прокладка, стерильная, MediumMedlineMDS090735
25 мкл Шприц Hamilton 702RN, без иглыFishcer Scientific14824663Шприцы, используемые для введения биоматериалов
25 мкл Пипетка положительного смещенияGilsonM-25
2x Beam Expander, 400-650 нмThorlabsGBE02-AРасширитель лазерного луча
Регулируемая сценическая платформаKopf Instruments901
Анти-глюкозный транспортер GLUT1 антитело, кроликAbcamab13435
Антитело к Iba1, козаabcamab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Наборы для сбора крови. 25G, 12"Medsupply367294для перфузии
BKF12 - Матовая черная алюминиевая фольгаThorlabsBKF12Для покрытия всего, что является отражающим при использовании лазера.
Мини-ножницы Bone Iris - 3-1/2"Sklar хирургические инструменты64-2035
C57BL/6 мышиJackson Laboratory0006648-12 недель
Сборка клетки RobThorlabsER3-P43" Длина, диаметр 6мм, 4 упаковки - для крепления лазера к стеротаксу
Заусенцы из углеродистой стали диаметром 0,5 мм FineScience Tools19007-05Для создания отверстия для заусенцев
Хром(III) додекагидрат сульфата калияVWREM1.01036.0250
Компактный контроллер для лазеров с косичкамиThorlabsCLD1010LP
ватные палочкиVWR89031-288
CP 25 наконечники для пипетокGilsonF148012
Donkey anti-goat IgG H& L (488)abcamab150129
Ослик Анти-Кролик IgG H& L (647)abcamab150075
Donkey Anti-rat IgG H& L (555)abcamab150154
EMS DPX MountantElecron Microscopy Sciences13512Монтажное решение для слайдов
EMS Желатиновый порошок типа A 300 BloomElectron Microscopy Sciences16564Для желатинового покрытия слайдов
EMS Параформальдегид, гранулированныйVWR100504-162Для изготовления 45 PFA
ESD Worstation kitElmstatWSKK5324SBНеобходимость настройки лазерной
волоконной настольной настенной панели, без резьбыThorlabsHCA3Необходимость подключения лазера к валу Kopf
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC/APC & APC, f=4,6 мм, 350-700 нм, диаметр 0,75 мм
Тонкие ножницы - прямые/острые-тупые/10 смFine Science Tools14028-10
GFAP антитела, крысаThermo Fisher Scientific13-0300
Нагревательная пластинаKopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge Гидрофобная барьерная ручкаVector LaboratoriesH-4000Для окрашивания слайдов
IMPAC 6-Интегрированный центр анестезии для нескольких пациентовVetEquip901808
Йодные подушечкиMedx SuppleMED MDS093917H
Jewlers Щипцы #5GFS химикаты46085
Лазерные защитные очкиThorlabsLG10BЯнтарные линзы, 35% видимого света (доступны и версии Google)
M27-1084 Мощный светодиодный двойной прицел с гусиной шеейLED-11C
Медицинский USP Класс кислородаВоздушный газOX USP250
Miltex Adson Перевязочные щипцы, дисекционный классIntefraMiltex V96-118
Мини-шнур/беспроводной триммер для мелких животныхHarvard aparatus72-6110
Мини-насос с переменным расходомThomas Scientific70730-064Насос для перфузии
Mouse Brain Матрицы, корональные срезы, 1 ммKent ScientificRBMA-200cДля TTC срезов
мышь Газовая анестезия Держатель головкиKopf Instruments923-B
Nanojet Control BoxChemyx10050
Nanojet Коллектор насосаChemxy10051Присоединить к стереотаксическому устройству для введения биоматериала
Игла RN 30G PT STY 3, 0,5 дюймаFishcer Scientific
Неразрывные ушные накладки 60°ordm;Kopf Instruments922
PBS буфер pH 7,4VWR97062 338
Пигталированный лазер 520 нм, 100 мВт, 5G PinThorlabsLP520-MF100
Стеклянные слайды с положительным зарядомHaretaAHS90-WH
Мощность энгергометраThorlabsPM100DИспользуется для измерения мощности лазера
мощностью Puralube Vet OintmentDr. Foster Smith9N-76855
Ректальный зонд Мышьkopf InstrumentsRet-3-ISO
Розовый бенгальский краситель 95%Sigma-Aldrich330000-5G
Вал модифицированный 8-32 резьбовое отверстие 1/2" глубинаKopf Instruments1770-02Для подключения лазера к стеротаксическому устройству
Тонкий фотодиодный датчик мощностиThorlabsS130VCИспользуется с силовой энергией метр
SM1-Молотый 30 мм Клеточная пластина толщиной 0,35" 2 УдерживающийThorlabsCP02Для подключения лазерного экспандера
Sol-M U-100 Инсулиновый шприц с маркировкой 1/2 единицы 0,5 млVWR10002-726Для введения розового бенгалии
Система окрашивания слайдов StainTray Система окрашивания слайдовSimport ScientificM920-2Для окрашивания предметных стекол
Sterotaxic аппаратKopf Instruments940Маленькое животное Стереотаксический инструмент
Студенческие щипцы Адсона -1x2 зубаFine Science Tools91127-12
Студенческие тонкие щипцы - прямые/широкие хвостовикиFine Science Tools91113-10
Регулятор температурыKopf InstrumentsTCAT-2LV
Tissue-Tek OCT соединениеVWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
Зажим верхнего кронштейнаKopf Instruments1770-cДля подключения лазера к стеротаксическому устройству
Vetbond Tissue Adhessive 3mLSanta Cruz Biotechnologysc-361931
Vogue Professional Мой маникюрBargin Source6400Для жернов
VWR Стерилизаторы бусинVWR75999-328
Tissue Tek OCT КомпаундСакура4583Для встраивания в ткани
NC9459562

Ссылки

  1. National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke stati....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель фототромботического инсультапротокол инъекций в мозгтаргетирование ядра инсультаишемический инсульт у грызуновсистема доставки биоматериаловкриосекции тканей мозгасовместная доставка стволовых клетоканализ методом проточной цитометрииоценка улучшения поведенческих показателей