Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Инъекция гидрогелевых биоматериальных каркасов в мозг после инсульта

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61450

⸱

1 октября 2020 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

В этой статье

Краткое содержание

Инсульт является глобальной проблемой с минимальными вариантами лечения и отсутствием текущей клинической терапии для регенерации потерянной ткани мозга. Здесь описаны методы создания точного фототромботического инсульта в моторной коре грызунов и последующего введения гидрогелевых биоматериалов для изучения их влияния на регенерацию тканей после инсульта.

Аннотация

Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими инсультами и определяются как внезапная закупорка сосуда, снабжающего кровью мозг. В течение нескольких минут после блокировки клетки начинают умирать и приводить к непоправимому повреждению тканей. Современные терапевтические методы лечения сосредоточены на удалении сгустков или лизисе, чтобы обеспечить реперфузию и предотвратить более серьезное повреждение головного мозга. Хотя преходящая пластичность мозга может со временем спасти часть поврежденной ткани, значительная часть пациентов остается с неврологическим дефицитом, который никогда не разрешится. Существует нехватка терапевтических возможностей для лечения неврологического дефицита, вызванного инсультом, что подчеркивает необходимость разработки новых стратегий лечения этой растущей популяции пациентов. Инъекционные биоматериалы в настоящее время разрабатываются для повышения пластичности мозга и улучшения эндогенного восстановления за счет доставки активных агентов или стволовых клеток. Одним из методов проверки этих подходов является использование модели инсульта грызунов, введение биоматериала в ядро инсульта и оценка восстановления. Знание точного местоположения ядра инсульта является обязательным для точного лечения после инсульта, поэтому модель инсульта, которая приводит к предсказуемому расположению инсульта, предпочтительнее, чтобы избежать необходимости визуализации до инъекции. Следующий протокол будет охватывать, как вызвать фототромботический инсульт, как вводить гидрогель контролируемым и точным образом, а также как извлекать и криосекционировать мозг, сохраняя биоматериал нетронутым. Кроме того, мы расскажем, как эти же гидрогелевые материалы могут быть использованы для совместной доставки стволовых клеток. Этот протокол может быть обобщен на использование других инъекционных биоматериалов в сердцевину инсульта.

Введение

Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах1. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими, в то время как большинство из оставшихся 13% являются геморрагическими2. Ишемический инсульт определяется как закупорка кровотока в артерии к окружающим тканям. Эта окклюзия приводит к кислородному голоданию и последующему некрозу, что часто приводит к постоянной инвалидности у выживших пациентов. Несмотря на снижение смертности от инсульта3,ожидается, что к 2030 году его распространенность возрастет до 3,4 млнчеловек4. Это увеличение числа выживших инвалидов и последующее экономическое бремя привели к толчку к исследованиям инсульта, которые сосредоточены на механизмах восстановления нейронов. После инсульта возникает воспалительный период, который приводит к образованию рубца, препятствующего расширению некротической области. Область, окружающая некротическое ядро, называется «периинфарктом», и есть убедительные доказательства того, что пластичность в этой области, которая включает в себя повышенный ангиогенез, нейрогенез и аксональное прорастание, напрямую связана с наблюдаемым восстановлением у животных моделей и людей5. Поскольку не существует моделей in vitro, которые могут правильно воспроизвести сложные взаимодействия после инсульта, животные модели необходимы для исследований инсульта.

Существует несколько моделей in vivo, которые могут быть использованы для получения ишемического инсульта. Одной из наиболее распространенных моделей, используемых у мышей, является окклюзия средней мозговой артерии, или MCAo, через дистальную или проксимальную (через внутриартериальную нить) окклюзию. Проксимальная модель, также известная как нить MCAo (fMCAo), обычно приводит к большим ишемическим инсультам, которые охватывают от 5% до 50% полушария головного мозга, в зависимости от количества факторов6. В этих моделях шов или нить продвигается от внутренней сонной артерии к основанию средней мозговой артерии (MCA) и удерживается на месте в течение определенного периода времени. Этот метод окклюзии, который может быть сделан временным или постоянным, вызывает инфаркт, который сосредоточен в полосатом теле и может включать или не включать вышележащую кору6. Результирующий размер удара сильно варьируется, и методы визуализации, такие как лазерная допплерография, необходимы для подтверждения эффективности процедуры у каждой мыши. Внутриартериальная или внутрисветная окклюзия нити, которая длится более 30 минут, вызывает инсульты на большем конце диапазона размеров. Некоторые исследователи сосредоточились на более коротком времени окклюзии нити, которое требует значительного экспериментального фокуса и лабораторнойпроверки 7. Модели MCAo нити у мышей следуют аналогичным стадиям гибели клеток, ишемической прогрессии и формирования периинфарктной области, как это наблюдается в случаях инсульта у человека; однако более крупные инсульты более близко напоминают болезненное состояние злокачественных инфарктов головного мозга, которые являются менее распространенными, менее излечимыми инсультами человека6. Между тем, дистальная окклюзия MCA требует более сложной операции и краниэктомии. В этой модели дистальная часть MCA, которая проходит вдоль поверхности мозга, непосредственно закупоривается шовным галстуком или прижиганием. В некоторых вариациях методики сонные артерии закупориваются односторонне или временно-двусторонне. Преимущество дистального MCAo заключается в том, что он производит кортикальный инсульт, который менее изменчив по размеру, чем модель нити. Тем не менее, дистальная модель производит более плохой поведенческий выход из-за трансекции наружной сонной артерии (ECA), что также является проблемой для fMCAo6.

Альтернативной моделью инсульта, которая известна своей менее инвазивной, является фототромботическая (PT) модель. Модель PT приводит к четко определенному местоположению ишемии и связана с высокой выживаемостью8. Методика опирается на светочувствительный краситель, вводимый внутрибрюшинно, который позволяет осуществлять внутрисосудистое фотоокисление просто путем облучения желаемой ткани светом или лазером9. При возбуждении образуются кислородные радикалы, вызывающие повреждение эндотелия, что активирует агрегацию тромбоцитов и образование сгустков в облученнойобласти 8,9. Жесткий контроль над размером и расположением штриха, а также высокая воспроизводимость модели PT делают ее идеальной для изучения биоматериалов. Хотя точность становится возможной с помощью лазерных и стереотаксических координат, есть некоторые недостатки, которые могут сделать эту модель менее идеальной для нескольких исследований. В отличие от модели fMCAo, модель удара PT не может быть реперфузирована. Поэтому материалы для исследования нейропротекторных средств, специфичных для повреждений после реперфузии или механизмов после реперфузии, не были бы полезны здесь8. Кроме того, из-за микрососудистого повреждения модели PT наблюдается относительно небольшая ишемическая полутень. Вместо этого возникает локальный вазогенный отек, что нехарактерно для инсульта человека, что делает эту модель нежелательной для доклинических исследований лекарств, ориентированных на периинфарктнуюобласть 6,8.

Общая цель стратегий биоматериала при инсульте заключается в том, чтобы либо доставить биологически активные агенты, либо действовать как суррогатный внеклеточный матрикс для роста ткани мозга. Одна из стратегий, которую мы будем изучать с использованием наших методов, заключается в доставке гидрогеля непосредственно в ядро инсульта, в отличие от ткани периинфаркта, где многие современные клеточные терапии доставляются10. Обоснование этого подхода заключается в том, что доставка в некротическую ткань, обнаруженную в ядре, позволит избежать нарушения окружающей здоровой или восстанавливающейся ткани. Мы предполагаем, что диффузия любых активных агентов, входящих в состав биоматериала, сможет достичь периинфаркта из ядра, тем более что мы обнаруживаем, что доставка биоматериалов гидрогеля уменьшает толщину глиального рубца11. Это важно, поскольку было показано, что периинфарктная область демонстрирует нейропластичность после инсульта, что делает ее привлекательной мишенью. Кроме того, доставка суррогатной матрицы к инсультному ядру может быть загружена ангиогенными12 или нейрогенными13 факторами для руководства образованием новой ткани, а также клеток для доставки14. Доставка клеток значительно улучшается за счет использования матрицы, поскольку она защищает клетки от жестких сил инъекции и локальной среды, присутствующих во время доставки, а также способствует дифференцировке и приживлению15.

Эти инъекционные терапевтические биоматериалы имеют клиническое значение в приложениях для лечения инсульта, поскольку в настоящее время нет медицинских методов лечения, которые стимулируют восстановление нейронов после инсульта. Основные нейронные цепи, участвующие в восстановлении, лежат в ткани мозга, которая примыкает к ядру инсульта16,в то время как само ядро инсульта лишено жизнеспособной нервной ткани. Мы ожидаем, что доставка биоматериала в ядро некротического инсульта имеет потенциал для стимуляции прилегающей ткани к регенеративным процессам с помощью ряда ранее упомянутых механизмов, включая депо высвобождение факторов роста13,стимуляцию роста тканей и содействие развитию восстанавливающейся ткани мозга11,12,изменение иммунных реакций17и доставку терапевтических средств, полученных из стволовых клеток14, 18. Однако для эффективного изучения возможности этих применений необходим последовательный и воспроизводимый метод индуцирования инсульта и инъекций биоматериалов. Модель обводки PT использует методы, которые обеспечивают точный контроль над ориентацией и местоположением штриха. Лазер, прикрепленный к стереотаксическому устройству, направляет ориентацию, а насосы, прикрепленные к стереотаксическим устройствам, контролируют скорость впрыска материала без необходимости дополнительных форм визуализации. Поэтому мы решили описать методы выполнения инсульта ПТ в моторной коре мышей и для введения биоматериалов в ядро инсульта. Здесь мы используем микропористые отожженные частицы (MAP) гидрогели в качестве биоматериала для инъекций без добавления клеток или факторов роста. Кроме того, мы объясняем, как успешно извлечь мозг с неповрежденным биоматериалом, и мы обсуждаем иммунохимические анализы, используемые для анализа результатов инсульта с инъекцией биоматериалов и без нее.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты проводились в соответствии с IUCAC в Университете Дьюка и Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. В этом исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6J в возрасте от 8 до 12 недель. Животные содержались при контролируемой температуре (22 ± 2 ° C), с периодом 12-часового светло-темного цикла и доступом к гранулированной пище и воде ad libitum. Протоколы анальгезии и седации описываются как одобренные IUCAC, но могут отличаться от протоколов, используемых в других лабораториях.

Животные могут быть преждевременно усыплены, если они испытывают чрезмерное беспокойство, вокализацию (указывающую на неконтролируемую боль), самотравмирование, снижение или нарушение подвижности, физические признаки кожной инфекции, потерю аппетита и / или потерю веса более чем на 10-15% в результате операции по выживанию. Нет никаких ожидаемых побочных эффектов от инъекции геля, так как он состоит из естественного полимера в мозге. За животными следует следить ежедневно, включая выходные и праздничные дни, и перевешивать через день. Исследования, проведенные в нашей лаборатории и других, не обнаружили дефицита в груминге, потере массы тела или признаках / симптомах абстиненции или хронического стресса у мышей после этих небольших корковых или подкорковых инсультов. Если животные проявляют какие-либо признаки местной инфекции раны головы, они должны быть усыплены. Животные также должны контролироваться на предмет плохого ухода, состояния ран и признаков драки между животными (раны спины). Если есть признаки драки или дегисценции раны, животных следует сначала лечить после обращения к ветеринарам. Это часто включает антибиотик в воде и / или местное местное применение антибиотиков. Если эти меры не приводят к исцелению, животные должны быть усыплены.

1. Подготовка материалов и инструментов

  1. Подготовьте фототромботический краситель перед операцией. Взвесьте 15 мг розовой бенгальской розы в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл.
    ВНИМАНИЕ: Роза бенгальская может вызвать серьезное повреждение / раздражение глаз.
    1. Растворите розу бенгальскую в 1,5 мл стерильного фильтрованного 1x PBS, чтобы получить рабочую концентрацию 10 мг/мл.
    2. Вихрьте трубку до тех пор, пока не будут видны сгустки, указывая на то, что краситель полностью растворился, затем накройте фольгой до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимого красителя будет зависеть от количества мышей. Краситель вводят внутрибрюшинно IP в концентрации 10 мкл/г, например, 200 мкл для мыши весом 20 г.
  2. Включите грелку для поддержания температуры тела мыши во время анестезии (37 °C).
  3. Приготовьте автоклавные ножницы, щипцы, хлопок, ветеринарную глазную мазь, хирургический клей или шовной материал, синий или черный хирургический маркер, а также стерильные спиртовые и бета-йодные салфетки. Подготовьте сверло для костей со стерилизованными головками сверл.
  4. Включите стерилизацию шариков до 160 °C, чтобы обеспечить стерилизацию инструментов между операциями на мышах. Отложите коническую трубку стерильного физиологического раствора объемом 50 мл или 1 раствор PBS для последующего использования в поддержании гидратированной рабочей зоны.
  5. Подключите лазер к стереотаксическому устройству. Надев лазерные защитные очки, измерьте мощность лазера (мВт).
    ВНИМАНИЕ: Используйте лазерные защитные очки всякий раз, когда лазер включен во время процедуры.
    1. Отрегулируйте ток на лазерной консоли, следуя инструкциям по изготовлению лазера, до тех пор, пока выходная мощность лазера не достигнет 10 мВт, и установите ток в качестве предварительно установленного на консоли домашнего экрана. Затем снова отрегулируйте ток, чтобы установить другой предустановленный, где выходная мощность лазера составляет 40 мВт. Теперь выключите лазер до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мВт будут использоваться для ориентации лазера перед использованием.
  6. Подготовьте чистую клетку для мышей после операции. Затем поместите мышь в индукционную камеру с концентрацией изофлурана 4%, чтобы обезболить ее до тех пор, пока спонтанное движение не прекратится и ее дыхание не достигнет медленной, устойчивой скорости.
  7. После сна взвесьте мышь, чтобы определить, сколько красителя Rose Bengal ввести. Затем перенесите и закрепите мышь на стереотаксическом устройстве с поддерживающей концентрацией изофлурана 1,5%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение концентрации изофлурана может расширить сосуды и предотвратить достаточную окклюзию или удары постоянного размера между мышами.
  8. Нанесите ветеринарную глазную мазь на оба глаза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за дыханием и температурой на протяжении всей процедуры и время от времени сжимайте пальцы ног, чтобы мышь ничего не чувствовала.

2. Фототромботический инсульт модель9

  1. Сбрите мех с головы мыши и асептически подготовьте область, используя спиртовую салфетку, а затем салфетку из бета-йода. Повторите три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте дополнительную спиртовую салфетку в конце, чтобы очистить весь бета-йод, так как это вызывает раздражение кожи, что приводит к тому, что мыши чешут череп после операции.
  2. С помощью небольших ножниц делают боковой разрез между ушами к глазам, примерно на 1-2 см. Сделайте это, потянув кожу вверх щипцами, чтобы создать палатку, разрезав один раз вниз, затем вставив ножницы в отверстие и создав непрерывный разрез средней линии.
  3. Отделите кожу и слегка надавите на теменные кости щипцами, чтобы найти брегму. Пометьте брегму точкой с помощью хирургического маркера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Движение фрагментов кости подчеркивает лобную границу теменных костей. Брегма является центральной точкой, в которой встречаются фрагменты лобной и теменной костей(рисунок 1А).
  4. Надев лазерные защитные очки, переместите лазер над черепом мыши, зафиксировав стереотаксическое устройство под углом 90°. Выберите предустановленную мощность 10 мВт и включите лазер.
    1. Отрегулируйте оси X и Y лазера до тех пор, пока он не окажется непосредственно над брегмой. Сбросьте значения x и y на консоли цифрового дисплея, а затем переместите лазер на 1,8 мм влево от брегмы. Теперь поднесите лазер как можно ближе к черепу, не позволяя ему коснуться черепа.
    2. Переместите лазер на 2,2 мм влево от брегмы, чтобы он мог двигаться без каких-либо препятствий. Выключите лазер.
  5. Введите соответствующее количество красителя Rose Bengal внутрибрюшинно (IP) с помощью одноразовой иглы 29 г. Немедленно запустите таймер на 7 мин, чтобы краситель циркулировал системно. Выберите предустановленную мощность 40 мВт без включения лазера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как вы освоитесь с процедурой, краситель может быть введен перед асептической подготовкой мыши и закончен до истечения 7 минут, чтобы сэкономить время.
  6. Включите лазер (40 мВт), когда сработает 7-минутный таймер, надев лазерные защитные очки, и установите 10-минутный таймер.
    1. Через 10 мин переместите лазер на 2,2 мм влево от брегмы, не выключая его, и установите еще 10-минутный таймер.
    2. Как только второй 10-минутный таймер сработает, измените лазер обратно на 10 мВт и переместите лазер на 2,0 мм слева от брегмы. Отметьте это место хирургическим маркером. Затем выключите лазер.
    3. Поднимите лазер и разблокируйте его под углом 90°, чтобы его можно было отодвинуть от мыши. В этот момент нанесите стерильный физиологический раствор или PBS с хлопком, если хирургическая область сухая.
  7. Сверлите небольшими очередями на отметке 2,0 мм перпендикулярно поверхности черепа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы сверлить медленно, чтобы не сверлить слишком глубоко и не ударить по мозгу. После того, как сверло пройдет через череп, произойдет небольшое падение / изменение сопротивления, и сверление может вызвать кровотечение.
    1. Используйте хлопок, чтобы поглотить избыток крови. Типично видеть кровь из проколотых артерий в черепе после сверления - чрезмерная кровь означает, что сверло попало в мозг. В этом случае запишите идентификатор мыши и двигайтесь дальше.
  8. Поместите небольшую салфетку рядом с мышью. Используя щипцы, подтяните кожу близко друг к другу, чтобы подготовиться к склеиванию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо этого здесь можно сделать шов. Для наложения швов обычно требуется всего 3 шва.
    1. Используя щипцы, схватите две стороны кожи и потяните их вместе и вверх. Смажьте все большие капли хирургического клея в конце кончика на салфетке перед нанесением на мышь.
    2. Нанесите хирургический клей экономно и удерживайте кожу щипцами в течение 10 с. Продолжайте до тех пор, пока не появятся видимые отверстия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клей выходит быстро – не сжимайте бутылку. Избегайте приклеивания кожи к черепу или попадания клея в глаз.
  9. После склеивания или наложения швов поместите мышь в новую клетку, чтобы восстановиться после анестезии. Животному требуется 5-10 минут, чтобы восстановиться, и это помогает отдохнуть половине клетки на грелке.

3. Операция при фиктивном инсульте

  1. Выполняйте все процедуры идентично операции, описанной выше в разделе 2, за исключением инъекции 1x PBS или физиологического раствора вместо красителя Rose Bengal.

4. Инъекции гидрогеля или других биоматериалов

  1. Выполняйте инъекции биоматериалов в определенное пользователем время. В этом эксперименте инъекции выполнялись между 5- и 7-дневными днями после инсульта. Вводят 2 - 6 мкл гидрогеля (определяемого пользователем).
    1. Включите грелку для поддержания температуры тела мыши во время анестезии (37 °C).
    2. Приготовьте автоклавные ножницы, щипцы, хлопок, ветеринарную глазную мазь, хирургический клей или шовной материал, а также стерильные спиртовые и бета-йодные салфетки. Подготовьте костную дрель со стерильными наконечниками сверл и стеклянными шприцами Hamilton объемом 25 мкл с металлическими иглами 30 г.
    3. Включите стерилизацию шариков до 160 °C, чтобы обеспечить стерилизацию инструментов между мышами.
    4. Прикрепите насосы впрыска к стереотаксическому устройству. Установите скорость потока на 1 мкл/мин и установите объем на 4 мкл.
    5. Подготовьте чистую клетку для мышей после операции.
  2. Поместите мышь в индукционную камеру с концентрацией изофлурана 4%, чтобы обезболить ее до тех пор, пока спонтанное движение не прекратится и ее дыхание не достигнет медленной, устойчивой скорости.
    1. После сна перенесите и закрепите мышь к стереотаксическому устройству с поддерживающей концентрацией изофлурана 1,5%.
    2. Нанесите ветеринарную глазную мазь на оба глаза.
    3. Побрейте любой мех, который, возможно, отрос головы мыши, и асептически подготовьте область, используя спиртовую салфетку, а затем салфетку из бета-йода. Повторите три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте дополнительную спиртовую салфетку в конце, чтобы очистить весь бета-йод, поскольку он вызывает раздражение кожи и заставляет мышей чесать череп после операции.
  3. Используя небольшие ножницы и / или щипцы, снова откройте кожу над мозгом. Используйте хлопок со стерильным физиологическим раствором или PBS, чтобы очистить череп от любого мусора. Будет виден бело-желтый круг (штрих, рисунок 1B)и отверстие заусенца от сверла. Если омертвевшая ткань не видна, скорее всего, инсульта не произошло. Если отверстие для заусенцев не центрировано выше хода, повторно просверлите, чтобы центрировать его.
  4. Наведите насос впрыска на мышь и зафиксируйте на 90°. Очистите шприц стерильным физиологическим раствором или раствором PBS перед обратной загрузкой материала.
    1. После очистки разберите стеклянный шприц, чтобы не было иглы. Перегрузите шприц с помощью пипетки с положительным смещением 25 мкл с 10 мкл гидрогеля (или другого биоматериала здесь с клетками или без них).
    2. Используя шприц-поршень, протолкните гель до передней части шприца. Затем снова соберите шприц и продолжайте толкать, пока гель заметно не вытечет из иглы.
  5. Поместите шприц на насос. Заднюю часть насоса, возможно, потребуется отрегулировать, чтобы шприц подходил. Сделайте это, отрегулировав скорость потока до 30 мкл/мин, выберите Вывод или Впрыск в зависимости от направления движения, а затем нажмите кнопку Пуск. Нажмите «Стоп», когда задняя часть насоса находится в правильном месте.
    1. Прикрутите заднюю часть насоса, чтобы шприц был надежно закреплен. Если корректировки были сделаны ранее, убедитесь, что скорость потока установлена на уровне 1 мкл / мин и настроена на впрыск.
  6. Переместите насос в направлении x и y, чтобы сориентировать его над отверстием. Перемещайте насос вниз в направлении z до тех пор, пока игла шприца не коснется верхней части отверстия.
  7. Сбросьте z на консоли цифрового дисплея. Затем переместите шприц вниз в направлении z на 0,750 мм. Если шприц сгибается или есть сопротивление, череп либо зажил, либо не был полностью просверлен и нуждается в повторном просверлении.
  8. Нажмите кнопку Пуск на консоли насоса, чтобы впрыснуть 4 - 6 мкл гидрогеля со скоростью 1 мкл/мин.
  9. Установите 5-минутный таймер, когда насос перестает впрыскиваться, чтобы гель начал сшиваться.
  10. Через 5 мин медленно подтяните шприц, повернув z nob. Следите за тем, чтобы убедиться, что какой-либо материал случайно вытащился или просочился из отверстия. Разблокируйте насос и отодвиньте его от мыши, когда игла находится достаточно далеко от черепа.
  11. С помощью щипцов, хирургического клея или швов закройте кожу над головой. Поместите мышь в чистую клетку и наблюдайте за ее восстановлением. Мыши должно потребоваться около 5-10 минут, чтобы оправиться от анестезии.

5. Перфузия и отбор проб

  1. Обезболить мышь с помощью изофлурана.
  2. Зафиксируйте животное в положении лежа на спине и откройте брюшную полость срединным разрезом. Опционально зажмите нисходящую брюшную аорту, чтобы использовать меньше фиксаторов и PBS.
  3. Разрежьте диафрагму и переместите вверх по бокам грудной клетки, чтобы открыть грудную полость. Вставьте перфузионную канюлю в левый желудочек и вырежьте отверстие в правом предсердии. Начните медленно перфузить с 10-20 мл PBS или до тех пор, пока жидкость не станет полупрозрачной.
  4. После очистки переключитесь на 4% PFA для еще 10 – 20 мл. Открепление оружия позволяет им сжиматься по мере вливания PFA. Как только они перестанут двигаться, подождите еще 30 с.
  5. Обезглавить животное и оттянуть кожу, чтобы обнажить череп. Используя тупые, тонкие щипцы, осторожно удалите куски черепа, чтобы обнажить мозг. Особую осторожность нужно соблюдать при удалении черепа над местом инсульта. Небольшие хирургические ножницы могут быть использованы здесь, чтобы помочь отрезать череп. Самая большая проблема заключается в том, что гель прилипает к черепу и выходит из мозга при удалении черепа.
  6. Как только мозг отсоединится, поместите в 10-15 мл 4% PFA на ночь (не дольше 24 ч).
  7. Переместите мозг с PFA на 30% сахарозы на следующий день. Мозг готов к криосекции, как только он опускается на дно (около 2-3 дней). Его также можно оставить для хранения в этот момент.

6. Криосечение и окрашивание

  1. Выньте мозг из сахарозы и положите на стеклянную горку. Отрежьте небольшую часть задней части мозга лезвием бритвы, чтобы создать плоскую часть, которая будет установлена на патроне.
    1. Поместите кусочек соединения оптимальной температуры резки (OCT) на патрон, а затем поместите мозг плоской стороной вниз на патрон в OCT. Поместите этот образец на сухой лед до замерзания или в криостат на морозильной блоке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OCT может быть добавлен, чтобы полностью охватить мозг, чтобы помочь предотвратить отделение материала от мозга во время сечения.
  2. Последовательно разрезайте мозги на криостате при -20 °C на участках толщиной 30 мкм на 10 слайдах с желатиновым покрытием. Будьте осторожны при секционировании, чтобы не потерять гидрогель. Если эта часть затруднена, поместите немного ОКТ на верхнюю часть мозга над гелем(рисунок 3). Хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
  3. Выньте горки при температуре -80 °C и поместите на окрашивающий лоток, чтобы они высохли. Слайды, которые не были заморожены, а просто разделены, также могут быть немедленно окрашены.
  4. Используя гидрофобную ручку, нарисуйте круг вокруг срезов мозга на слайде. После высыхания регидратируйте ломтики мозга 1x отфильтрованным PBS и поместите на шейкер при комнатной температуре в течение 15 минут. Это занимает около 1 мл буфера на слайд с 9-12 участками мозга.
  5. Промыть слайды 1x фильтрованным PBS в течение 5 мин при комнатной температуре, повторить три раза.
  6. Блокируйте слайды на 30 мин-час с 10% ослиной сывороткой в 0,01% PBS-Triton X при комнатной температуре на животе танцовщицы. Это занимает около 200 мкл на слайд.
  7. Инкубировать первичное антитело в 10% ослиной сыворотке с 0,01% PBS-Triton X в течение ночи при 4°C на шейкере. Сначала проверьте первичные антитела, чтобы определить правильные концентрации. Здесь использовались GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500)(Рисунок 4).
  8. Вымойте слайды 1x фильтрованным PBS на следующий день в течение 5 мин при комнатной температуре, повторите три раза.
  9. Инкубировать с вторичным антителом в 10% ослиной сыворотке в 0,01% PBS-Triton X и DAPI в течение 2 ч на лабораторном шейкере при комнатной температуре. 1:1000 использовалось для всех вторичных и DAPI.
  10. Мойте слайды в течение 5 минут с 1x фильтрованным PBS.
  11. Дайте секциям высохнуть при комнатной температуре в темноте. Это может занять от 20 мин до 4 ч; размещение слайдов в осушителе может ускорить процесс.
  12. Обезвоживание скользит в возрастающих концентрациях алкоголя (1 мин на раствор) 50%, 70%, 95%, 100% и 100%.
  13. Обезжиривание в первой ванне ксилола в течение 1 мин, затем во второй ванне ксилола в течение 5 мин.
  14. Быстро вынимайте слайды один за другим и добавляйте монтажную среду, пока участки мозга мокрые от ксилола. Быстро добавьте стеклянную крышку сверху. Используйте крышку, которая имеет правильную длину и толщину, необходимую для слайда и микроскопа, используемых для визуализации, соответственно.
  15. Избавьтесь от пузырьков под крышкой, осторожно надавливая кончиком пипетки наружу от центра слайда. Дайте DPX высохнуть в течение 4 ч до ночи в темноте при комнатной температуре.
  16. Используйте лезвие бритвы, чтобы соскоблить любую высохшую монтажную среду, которая пролилась на горки. Протрите слайды с помощью очистителя объектива. Слайды теперь можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего хранить слайд в темноте или при 4 °C до тех пор, пока изображение не будет завершено.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью этого метода была демонстрация того, как вводить биоматериалы в мозг после инсульта. Фототромботическая модель с розовой бенгальской розой и лазером 520 нм использовалась для контролируемой ориентации поражений инсульта как по размеру, так и по местоположению. Через пять дней после инсульта инфаркт может быть визуализирован во время операции(рисунок 1B)и с помощью TTC и визуализации окрашенных слайдов IHC(рисунок 2). Увеличение диаметра лазера с 2-кратной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем легко воспроизводимую, минимально инвазивную, постоянную модель инсульта и описываем, как ввести биоматериал в инфаркт через пять дней после инсульта. Использование фототромботического красителя Rose Bengal и коллимированного лазера 520 нм, подключенного к стереотаксическому устройству, дает нам возможность позиционировать удар в моторной коре мыши с повышенной точностью. Через пять дней после инсульта расположение инфаркта видно на глаз в центре облучения, 2,0 мм медио-латерально к брегме. Затем г...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что TS является основателем Tempo Therapeutics, которая стремится коммерциализировать гидрогели MAP.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Национальные институты здравоохранения и Национальный институт неврологических расстройств и инсульта за финансирование (R01NS079691).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% Нормальная козья сывороткаVWR100504-028Для блокировки буфера
2-слойная спиртовая предварительная прокладка, стерильная, MediumMedlineMDS090735
25 мкл Шприц Hamilton 702RN, без иглыFishcer Scientific14824663Шприцы, используемые для введения биоматериалов
25 мкл Пипетка положительного смещенияGilsonM-25
2x Beam Expander, 400-650 нмThorlabsGBE02-AРасширитель лазерного луча
Регулируемая сценическая платформаKopf Instruments901
Анти-глюкозный транспортер GLUT1 антитело, кроликAbcamab13435
Антитело к Iba1, козаabcamab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Наборы для сбора крови. 25G, 12"Medsupply367294для перфузии
BKF12 - Матовая черная алюминиевая фольгаThorlabsBKF12Для покрытия всего, что является отражающим при использовании лазера.
Мини-ножницы Bone Iris - 3-1/2"Sklar хирургические инструменты64-2035
C57BL/6 мышиJackson Laboratory0006648-12 недель
Сборка клетки RobThorlabsER3-P43" Длина, диаметр 6мм, 4 упаковки - для крепления лазера к стеротаксу
Заусенцы из углеродистой стали диаметром 0,5 мм FineScience Tools19007-05Для создания отверстия для заусенцев
Хром(III) додекагидрат сульфата калияVWREM1.01036.0250
Компактный контроллер для лазеров с косичкамиThorlabsCLD1010LP
ватные палочкиVWR89031-288
CP 25 наконечники для пипетокGilsonF148012
Donkey anti-goat IgG H& L (488)abcamab150129
Ослик Анти-Кролик IgG H& L (647)abcamab150075
Donkey Anti-rat IgG H& L (555)abcamab150154
EMS DPX MountantElecron Microscopy Sciences13512Монтажное решение для слайдов
EMS Желатиновый порошок типа A 300 BloomElectron Microscopy Sciences16564Для желатинового покрытия слайдов
EMS Параформальдегид, гранулированныйVWR100504-162Для изготовления 45 PFA
ESD Worstation kitElmstatWSKK5324SBНеобходимость настройки лазерной
волоконной настольной настенной панели, без резьбыThorlabsHCA3Необходимость подключения лазера к валу Kopf
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC/APC & APC, f=4,6 мм, 350-700 нм, диаметр 0,75 мм
Тонкие ножницы - прямые/острые-тупые/10 смFine Science Tools14028-10
GFAP антитела, крысаThermo Fisher Scientific13-0300
Нагревательная пластинаKopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge Гидрофобная барьерная ручкаVector LaboratoriesH-4000Для окрашивания слайдов
IMPAC 6-Интегрированный центр анестезии для нескольких пациентовVetEquip901808
Йодные подушечкиMedx SuppleMED MDS093917H
Jewlers Щипцы #5GFS химикаты46085
Лазерные защитные очкиThorlabsLG10BЯнтарные линзы, 35% видимого света (доступны и версии Google)
M27-1084 Мощный светодиодный двойной прицел с гусиной шеейLED-11C
Медицинский USP Класс кислородаВоздушный газOX USP250
Miltex Adson Перевязочные щипцы, дисекционный классIntefraMiltex V96-118
Мини-шнур/беспроводной триммер для мелких животныхHarvard aparatus72-6110
Мини-насос с переменным расходомThomas Scientific70730-064Насос для перфузии
Mouse Brain Матрицы, корональные срезы, 1 ммKent ScientificRBMA-200cДля TTC срезов
мышь Газовая анестезия Держатель головкиKopf Instruments923-B
Nanojet Control BoxChemyx10050
Nanojet Коллектор насосаChemxy10051Присоединить к стереотаксическому устройству для введения биоматериала
Игла RN 30G PT STY 3, 0,5 дюймаFishcer Scientific
Неразрывные ушные накладки 60°ordm;Kopf Instruments922
PBS буфер pH 7,4VWR97062 338
Пигталированный лазер 520 нм, 100 мВт, 5G PinThorlabsLP520-MF100
Стеклянные слайды с положительным зарядомHaretaAHS90-WH
Мощность энгергометраThorlabsPM100DИспользуется для измерения мощности лазера
мощностью Puralube Vet OintmentDr. Foster Smith9N-76855
Ректальный зонд Мышьkopf InstrumentsRet-3-ISO
Розовый бенгальский краситель 95%Sigma-Aldrich330000-5G
Вал модифицированный 8-32 резьбовое отверстие 1/2" глубинаKopf Instruments1770-02Для подключения лазера к стеротаксическому устройству
Тонкий фотодиодный датчик мощностиThorlabsS130VCИспользуется с силовой энергией метр
SM1-Молотый 30 мм Клеточная пластина толщиной 0,35" 2 УдерживающийThorlabsCP02Для подключения лазерного экспандера
Sol-M U-100 Инсулиновый шприц с маркировкой 1/2 единицы 0,5 млVWR10002-726Для введения розового бенгалии
Система окрашивания слайдов StainTray Система окрашивания слайдовSimport ScientificM920-2Для окрашивания предметных стекол
Sterotaxic аппаратKopf Instruments940Маленькое животное Стереотаксический инструмент
Студенческие щипцы Адсона -1x2 зубаFine Science Tools91127-12
Студенческие тонкие щипцы - прямые/широкие хвостовикиFine Science Tools91113-10
Регулятор температурыKopf InstrumentsTCAT-2LV
Tissue-Tek OCT соединениеVWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
Зажим верхнего кронштейнаKopf Instruments1770-cДля подключения лазера к стеротаксическому устройству
Vetbond Tissue Adhessive 3mLSanta Cruz Biotechnologysc-361931
Vogue Professional Мой маникюрBargin Source6400Для жернов
VWR Стерилизаторы бусинVWR75999-328
Tissue Tek OCT КомпаундСакура4583Для встраивания в ткани
NC9459562

Ссылки

  1. National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229(2017).
  3. Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69(2017).
  4. Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
  5. Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
  6. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
  7. Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
  8. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  9. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794(2015).
  10. Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14(2018).
  11. Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
  12. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
  13. Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
  14. Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
  15. Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
  16. Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
  17. Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
  18. Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
  19. Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
  20. Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
  21. Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
  22. Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
  23. Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943(2017).
  24. Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
  25. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
  26. Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
  27. Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
  28. Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
  29. Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
  30. Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
  31. Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель фототромботического инсультапротокол инъекций в мозгтаргетирование ядра инсультаишемический инсульт у грызуновсистема доставки биоматериаловкриосекции тканей мозгасовместная доставка стволовых клетоканализ методом проточной цитометрииоценка улучшения поведенческих показателей
Инъекция гидрогелевых биоматериальных каркасов в мозг после инсульта
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.