Методическая статья

Оптимизированная высококачественная экстракция ДНК из фиксированных формалином парафинов атеросклеротических поражений человека

DOI:

10.3791/61452

⸱

12 февраля 2021 г.

 ,  , 
1Department for Vascular and Endovascular Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technical University Munich, 2partner site Munich Heart Alliance, Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung (DZHK), 3Department of Vascular Surgery, University Hospital Zurich, 4Department of Experimental Cardiology, German Heart Centre, Technical University Munich

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем протокол полуавтоматической экстракции ДНК из фиксированных формалином парафин-интегральных поражений сонных артерий человека. Лизис тканей выполняется без токсичного ксилола, за которым следует автоматизированный протокол экстракции ДНК, включающий второй этап лизиса, связывание ДНК с парамагнитными частицами для связывания на основе целлюлозы, этапы промывки и элюирования ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиксированные формалином ткани, залитые парафином (FFPE), представляют собой ценный источник для молекулярного анализа и клинических геномных исследований. Эти ткани часто бедны клетками или трудно поддаются обработке. Поэтому нуклеиновые кислоты нужно тщательно выделять. В последние годы были разработаны различные методы выделения ДНК для тканей от многих заболеваний, в основном от рака. К сожалению, геномная ДНК, извлеченная из тканей FFPE, сильно деградирует из-за перекрестных связей между нитями нуклеиновых кислот и белками, а также случайных разрывов последовательности. Таким образом, качество ДНК из этих образцов заметно снижается, что затрудняет проведение дальнейших молекулярных анализов. Другими проблемами сложных тканей являются, например, недостаток клеток в кальцинированных атеросклеротических поражениях человека и жировой ткани, небольшие биопсии кожи и, следовательно, низкая доступность желаемых нуклеиновых кислот, как это также имеет место в старых или фиксированных тканях.

В наших лабораториях мы разработали метод экстракции ДНК из фиксированных формалином атеросклеротических поражений с использованием полуавтоматической системы выделения. Мы сравнили этот метод с другими коммерчески доступными протоколами экстракции и сосредоточились на дальнейших анализах по технологической цепочке. Чистоту и концентрацию ДНК измеряли методами спектрометрии и флуориметрии. Оценивалась степень фрагментации и общее качество.

Наибольшее количество и качество ДНК было получено при использовании модифицированного протокола ДНК крови для автоматизированной системы экстракции, а не коммерческого протокола FFPE. Благодаря этому пошаговому протоколу выход ДНК из образцов FFPE был в среднем в четыре раза выше, и меньшее количество образцов не прошло процесс экстракции, что имеет решающее значение при работе с биопсией малых сосудов. Размеры ампликонов от 200–800.о. могут быть обнаружены с помощью ПЦР. Это исследование показывает, что, хотя ДНК, полученная из нашей ткани FFPE, сильно фрагментирована, она все же может быть использована для успешной амплификации и секвенирования более коротких продуктов. В заключение следует отметить, что в наших руках автоматизированная технология представляется лучшей системой для экстракции ДНК, особенно для небольших образцов тканей FFPE.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиксация формалина с последующим заделыванием парафина (FFPE) является стандартной процедурой для долгосрочного сохранения патологического образца в биобанке1. Эти образцы представляют собой ценный источник для гистологических исследований, а также молекулярных анализов, особенно генетических исследований2. Другими преимуществами тканей FFPE являются лучшее долгосрочное хранение, более низкие затраты и более простые условия хранения. Наша цель состоит в том, чтобы предоставить надежный и простой в использовании протокол для воспроизводимого выделения нуклеиновых кислот из небольших количеств срезов FFPE, поскольку высококачественная экстракция ДНК является первым важным шагом в широком спектре молекулярных методов, а ткани FFPE являются наиболее доступным источником образцов.

Новые научные подходы, такие как секвенирование нового поколения (NGS) и «омиксные» исследовательские подходы, требуют высокого качества нуклеиновых кислот 3,4,5. Извлечение ДНК из образцов тканей FFPE остается сложной задачей. ДНК из образцов FFPE может сильно различаться по качеству и количеству в зависимости от ее возраста и условий фиксации. Формалин, наиболее часто используемое соединение, приводит к сшивке ДНК-белка 6,7,8 и вызывает неспецифический случайный разрыв нуклеотидной последовательности9. Это может существенно повлиять на последующие геномные анализы, поскольку сшивание может привести к отключению амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР) 6,10. Из-за загрязнений в процессе фиксации чистота ДНК, выделенной из образцов FFPE, часто ограничена. В последние годы были разработаны различные методы выделения ДНК, в основном из образцов раковых тканей 2,11,12,13.

В целом, протоколы экстракции нуклеиновых кислот из ткани FFPE можно дифференцировать на три основные группы. Первая, наиболее часто используемая группа способов включает коммерчески доступные колонные системы14 на основе диоксида кремния. Вторая группа включает в себя методы ручной экстракции в органической фазе фенолом и хлороформом, впервые описанные Джозефом Сэмбруком и Дэвидом В. Расселом15. В качестве третьей группы в последние годы были созданы автоматизированные системы, такие как системы работы с жидкостями, а также системы на основе парамагнитныхчастиц16. Каждая из трех названных систем имеет различные преимущества и недостатки, такие как опасные химические вещества (например, ксилол, фенол, хлороформ), высокая стоимость17, рабочая сила18 и затраты времени19. В частности, для сложных образцов тканей, а также для высокопроизводительных анализов стандартизация, воспроизводимость, относительно низкие затраты времени, трудозатрат и затрат являются наиболее важными характеристиками при поиске подходящего метода выделения нуклеиновыхкислот20. Известно, что автоматизированные методы экстракции показывают лучшие воспроизводимые результаты и более чувствительны к небольшим биопсиям. Кроме того, требуется меньшее количество ткани или крови, а риск засорения системы из-за большого количества парафина снижается. Несмотря на то, что машины для автоматизированной экстракции нуклеиновых кислот и необходимые наборы стоят дороже по сравнению с ручными методами, они все же убедительны благодаря менее проблематичным процессам экстракции. Поиск литературы предоставляет множество публикаций, которые иллюстрируют прямое сравнение между ручными, колоночными и автоматизированными методами экстракции ДНК и РНК из различных тканей и организмов, таких как растения, животные и человек, а также клеток в культуре 20,21,22. В литературе также присутствуют доказательства того, что ДНК и РНК, выделенные из 10-летней замороженной ткани, могут быть использованы для последующих анализов, таких как ПЦР, количественная ПЦР, NGS, анализ метилирования и клонирование 9,23,24,25,26.

Основной проблемой, например, со стареющей сосудистой тканью человека, а также с небольшими биопсиями тканей, особенно с образцами FFPE, является нехватка клеток в сильно кальцинированных атеросклеротических поражениях, что, в свою очередь, приводит к низким концентрациям нуклеиновых кислот1. Несмотря на то, что уже разработано и широко используется несколько методов экстракции ДНК из тканей FFPE, ручные методы подготовки образцов требуют длительного времени работы27 , а для депарафинизациинеобходимы токсичные реагенты, такие как ксилол или фенол. Как уже было описано, процесс депарафинизации является важнейшим трудоемким этапом (например, около 30 минут), который заметно влияет на качество и количество экстрагированной ДНК (например, токсическое воздействие на ДНК, такое как фрагментация и деградация раствора депарафинизации и высокие температуры)28. Недавно разработанные новые протоколы экстракции ДНК сосредоточены на использовании других нетоксичных решений для депарафинизации, стратегий восстановления и автоматизированных технологий гранулирования. В частности, было показано, что автоматизированные и полуавтоматические методы успешны в экстракции ДНК с эффективным восстановлением, отсутствием перекрестного загрязнения и простотойработы. Мы разработали протокол, который преодолевает эти ограничения. В результате, наша технология позволяет сократить обработку и время работы при самых высоких количественных и качественных стандартах.

В частности, для воспроизводимых высокопроизводительных анализов, таких как генотипирование, эпигеномные исследования и секвенирование РНК, обработка образцов FFPE с помощью систем очистки на основе колонок часто является сложной и трудоемкой (например, длительные этапы депарафинизации, засорение колонки и длительное время ручного труда). Основной проблемой является засорение силикатных мембран из-за большого количества парафина. Другими обстоятельствами, которые могут ухудшить выделение высококачественных нуклеиновых кислот, являются небольшие количества тканей, таких как микробиопсия кожи, мелкая мышиная ткань, очень жирная или кальцинированная ткань в виде бляшек, окостенелая ткань и старые образцы. Особенно в диагностике и криминалистике, автоматизированные и полуавтоматические системы, такие как работа с жидкостями или методы экстракции на основе парамагнитных частиц, становятся все более и более важными за последниенесколько лет, в основном из-за относительно короткого времени работы и возможности стандартизации. Большинство уже опубликованных протоколов идеально подходят для гладких тканей с высоким или средним количеством клеток, таких как биопсия опухоли или растительная ткань 13,22,32. Литература о методах полуавтоматических методов на основе частиц, используемых для выделения ДНК из относительно труднообрабатываемых тканей, таких как неподвижные одиночные клетки, кальцинированные сосуды, богатые коллагеном ткани и жировые ткани с низким числом клеток, описана слабо33.

В данном исследовании описан оптимизированный полуавтоматический метод выделения ДНК из сосудистых парафиновых срезов, сравнивая его с двумя ручными протоколами на основе колонок. Для валидации использовались количество, чистота и степень фрагментации ДНК. Коммерчески доступный протокол анализа ДНК крови был использован в качестве отправной точки, а ручные этапы полуавтоматической системы были впоследствии оптимизированы для использования FFPE, а также свежезамороженных образцов тканей из тканей человека и животных, сочетая этапы из FFPE и тканевого протокола. Автоматизированный шаг этого протокола предустановлен на приборе и зависит от используемого набора (в данном случае набора ДНК крови). С помощью описанной полуавтоматической системы на основе картриджей можно выделять ДНК из крови, свежезамороженных тканей, фиксированных формалином тканей и даже отдельных клеток с помощью одного и того же протокола, машины, набора и расходных материалов, вместо использования разных протоколов и наборов для инструмента, как это рекомендует компания. Существуют лишь незначительные различия в протоколах, такие как один буфер и некоторое время инкубации для различных применений, что делает этот протокол очень полезным для извлечения ДНК из всех видов тканей. Наш протокол в первую очередь оптимизирован для кальцинированных, бедных клетками и фиброзной сосудистой ткани человека, но, конечно, может быть использован и дополнительно оптимизирован для всех видов сложных тканей, упомянутых выше.

Подводя итог, можно сказать, что для исследователей в области сердечно-сосудистых заболеваний, работающих с атеросклерозом (например, аорты, сонных артерий, коронарных артерий), мы предоставляем простой в использовании, пошаговый протокол для полуавтоматической экстракции ДНК из образцов сосудистых FFPE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разрешение на сбор образцов атеросклеротических сонных артерий человека в нашем биобанке было одобрено местным Комитетом по этике больниц (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Мюнхен, Германия). От всех пациентов было получено письменное информированное согласие. Эксперименты проводились в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

1. Подготовка тканей

  1. Подготовьте 5–8 срезов ткани размером 10 мкм из образца FFPE с помощью микротома и перенесите его в пробирку объемом 1,5 мл. Не стоит уменьшать избыток парафина из глыбы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более тонкие отдельные секции вместо одной большой секции ускоряют буферную реакцию. Откажитесь от первых секций из-завоздействия О2. Для больших образцов также можно использовать меньшее количество секций.
  2. Центрифугируйте эти пробирки в настольной центрифуге, установленной на 5 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре, чтобы собрать каждый образец на дне пробирки.
    ВНИМАНИЕ: Слишком длительное центрифугирование приводит к свертыванию образца и затрудняет лизис.

2. Растворение липидов и депарафинизация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходим для депарафинизации и переваривания липидов. Используемый буфер менее токсичен, чем коммерческие растворы депарафинизации.

  1. Добавьте 300 мкл коммерчески доступного инкубационного буфера и 6 мкл 1-тиоглицерина в каждую пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте более 300 μл, так как это максимальный объем картриджа системы автоматики.
  2. Ввергните в течение 10 с и инкубируйте образец в течение 10 мин при 80 °C и 500 об/мин в нагревательном блоке для растворения парафина.
    ВНИМАНИЕ: В конце концов ткань должна быть полностью растворена. При необходимости сделайте вихрь несколько раз за время инкубации.

3. Переваривание проб и белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Естественное пищеварение с протеазой К имеет решающее значение для получения чистых экстрактов ДНК без белков. Он также уменьшает количество загрязняющих белков. Кроме того, нуклеазы также разрушаются для сохранения ДНК34. Этот ночной этап также необходим для полного разложения образца.

  1. Дайте образцу остыть до 60 °C, а затем добавьте 30 мкл предоставленного раствора протеиназы К.
  2. Снова сделайте вихрь и инкубируйте смесь при температуре 65 °C и 500 об/мин в течение ночи (4–20 часов) в нагревательном блоке. Время от времени перебрасывайте образцы во время инкубации для полного переваривания образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ночная инкубация приводит к лучшим результатам. Этапы смешивания рекомендуется проводить каждые 30–60 минут. В конце концов, внутри трубки не должно быть никакого кусочка зрительной ткани.

4. Лизис клеток

  1. Добавьте 400 мкл буфера для лизиса, входящего в комплект для крови, и вскоре сведите вортекс.
  2. Снова инкубируйте образец при 65 °C в течение 30 минут при 500 об/мин.
  3. Дайте образцу остыть до комнатной температуры. Сверху парафин затвердеет.
    ВНИМАНИЕ: Не делайте повторный вихревой анализ, чтобы парафин отделился от образца. В противном случае парафин смешивается с тканью, что разрушает образец. Образец будет собран на шаге 6.1.

5. Подготовка предварительно выданных картриджей

  1. Включите устройство, а также соответствующий планшетный компьютер.
  2. Запустите программное приложение и нажмите кнопку «Дверь », чтобы открыть прибор.
  3. Снимите штатив с прибора и вставьте предварительно заполненный картридж в штатив для щупов. Убедитесь, что картридж дважды защелкнулся при вставлении на место, и снимите уплотнительную пленку.
  4. Добавьте поршень в последнее (8) отверстие картриджа. Он служит наконечником для пипетки в приборе.
  5. Заполните прилагаемые пробирки для элюирования объемом 0,5 мл 65 мкл элюирующего буфера, входящего в комплект поставки. Оставьте пробирки открытыми и вставьте их в специальное положение в передней части штатива после картриджа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем для элюирования составляет 60 μл. Система потеряет 5–10 μл добавленного объема элюирования.

6. Автоматизированная экстракция ДНК

  1. Осторожно проколите парафин в верхней части пробирки объемом 1,5 мл из шага 4.3, чтобы добраться до чистого образца на дне пробирки, не смешивая его с парафином снова.
  2. Перелейте всю смесь (730 μл) подготовленного образца в первую лунку картриджа.
  3. Вставьте штатив в автоматическую машину для извлечения ДНК. Убедитесь, что решетка фиксируется сначала в задней части машины, а затем в передней.
  4. Запустите прогон, нажав верхнюю левую оранжевую кнопку «Пуск » в программном обеспечении. Откроется окно с разными предустановленными протоколами. Выберите Протокол анализа ДНК крови на приборе. Подтвердите, что поршень, элюирующая трубка и образец были добавлены, нажав «Да» в программном обеспечении. Дверца прибора автоматически закроется, и начнется спуск (загорится зеленый свет). Забег займет примерно 38 минут. Дополнительная калибровка не требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, пока система не захватит поршни для всех образцов в штативе. Если этого не происходит, система автоматически останавливается, и протокол машины необходимо перезапустить.
  5. Убедитесь, что система выполняет этап автоматического лизиса в первой лунке картриджа, за которым следуют этапы промывки в лунках с 3 по 7. Никаких дополнительных этапов программирования не требуется. Полная программа предустановлена компанией.
  6. После этого убедитесь, что система вымывает ДНК в подготовленных элюирующих пробирках с помощью добавленного поршня. Магнитные частицы остаются в поршне. Поршень в конце концов возвращается к последней лунке картриджа.

7. Завершите забег

  1. Когда прогон будет завершен (на станке загорится зеленый мигающий свет), откройте прибор нажатием кнопки открытия (дверца-знак) и извлеките стойку из системы.
  2. Выбросьте картриджи.
  3. Снова вставьте пустую решетку в прибор и закройте дверцу с помощью кнопки дверцы в правом верхнем углу. Закройте программное приложение и выключите устройство, а также планшетный компьютер.
  4. Обладает элюированием при температуре -20 °C при длительном хранении или при 4 °C при кратковременном хранении или используется непосредственно для последующего анализа или измерения концентрации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для составления протокола использовали 5 тканевых блоков FFPE у пациентов с атеросклерозом сонной артерии. ДНК выделяли с помощью оптимизированного полуавтоматического протокола (набор С), а также с помощью двух коммерчески доступных ручных протоколов на основе колонок (набор А и набор В, см. Таблицу материалов). Экстракцию ДНК наборами А и В проводили в соответствии с протоколом производителя. Единственное изменение, которое было внесено в протокол двух коммерчески доступных наборов (набор А и набор Б):...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы экстракции ДНК из ткани FFPE различаются по качеству и количеству выделенной ДНК, что неизбежно влияет на эффективность дальнейших анализов. Таким образом, автоматизация становится императивом для улучшения рабочего процесса и стандартизации, а также управления качеством. Таким образом, в настоящем исследовании был оценен полуавтоматический метод экстракции ДНК из образцов FFPE, демонстрирующий лучшие результаты, чем другие тестируемые протоколы на основе ручных колонок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание протокола автоматизированной экстракции ДНК было поддержано доктором Паулем Мушлером из компании Promega. Мы благодарим Пауля Мушлера за его поддержку и научный вклад. Мы также благодарим нашего коллегу доктора Морица фон Шайдта (Немецкий кардиологический центр в Мюнхене) за предоставление нам инструмента Максвелла и за поддержку экспериментальной части. Все эксперименты проводились в лабораториях Немецкого кардиологического центра (Мюнхен, Германия) и Klinikum rechts der Isar (Мюнхен, Германия). Исследование финансировалось DFG (PE 900/6-1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл пробирки для инкубации образцовEppendorf, Гамбург, Германия30120086
1-тиоглицеринPromega, Вальдорф, ГерманияA208
Agilent tape station software 3.2Agilent, Вальдбронн, Германия
dsDNA HS KitThermoFisher Scientific, Schwerte, ГерманияQ32851
FFPE DNA Purification Kit (Kit A)Norgene Biotek, Гейдельберг, Германия47400
Образцы тканей FFPE n=5Мюнхенский сосудистый биобанк, Мюнхен, Германия
Набор для чтения генной ДНК FFPE (Kit B)Qiagen, Hilden, Германия180134
Нагревательные блоки, установленные на 80° C и 65° CVWR,Дармштадт,Германия460-0250
Высокочувствительный реагент D5000Agilent, Вальдбронн, Германия5067-5593
Высокочувствительный D5000 ScreenTapeAgilent, Вальдбронн, Германия5067-5592
Инкубационный буферPromega, Вальдорф, ГерманияD920
Maxwell Blood Kit RSC, включающий: Лизисный буфер, элюирующий буфер, протеиназа КPromega, Вальдорф, ГерманияAS1400
Maxwell RSC 48 InstrumentPromega, Вальдорф, ГерманияAS8500
МикроцентрифугаEppendorf, Гамбург, Германия
Спектрометр NanoDrop 2000cThermoFisher Scientific, Шверте,Германия ND-2000C
Оптические колпачкиAgilent, Вальдбронн, Германия401425
Полоски для оптических трубокAgilent, Вальдбронн, Германия401428
Пипетторы и наконечники для пипетокEppendorf, Гамбург, Германия
Prism 6 для статистики, версия 6.01GraphPad Inc., Сан-Диего, Калифорния
Qubit 3.0 ФлуориметрThermoFisher Scientific, Шверте, ГерманияQ33216
TapeStation 4200Agilent, Вальдбронн, Германия
Tecan Infinite M200 ProTecan, Mä nnedorf, ШвейцарияIN-MNANO

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelisek, J., et al. Biobanking: objectives, requirements, and future challenges-experiences from the munich vascular biobank. Journal of Clinical Medicine. 8 (2), 251(2019).
  2. Goelz, S. E., Hamilton, S. R., Vogelstein, B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications. 130 (1), 118-126 (1985).
  3. Busch, A., Eken, S. M., Maegdefessel, L. Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease. Annals of Translational Medicine. 4 (12), (2016).
  4. Kandpal, R. P., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. BioTechniques. 46 (5), 351-355 (2009).
  5. McDonough, S. J., et al. Use of FFPE-derived DNA in next generation sequencing: DNA extraction methods. PloS One. 14 (4), (2019).
  6. Gilbert, M. T. P., et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when. PloS One. 2 (6), (2007).
  7. Williams, C., et al. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. The American Journal of Pathology. 155 (5), 1467-1471 (1999).
  8. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  9. Gillio-Tos, A., et al. Efficient DNA extraction from 25-year-old paraffin-embedded tissues: study of 365 samples. Pathology. 39 (3), 345-348 (2007).
  10. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  11. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Experimental and Molecular Pathology. 94 (1), 121-125 (2013).
  12. Sarnecka, A. K., et al. DNA extraction from FFPE tissue samples–a comparison of three procedures. Contemporary Oncology. 23 (1), 52(2019).
  13. Kalmár, A., et al. Comparison of automated and manual DNA isolation methods for DNA methylation analysis of biopsy, fresh frozen, and formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal cancer samples. Journal of Laboratory Automation. 20 (6), 642-651 (2015).
  14. McCormick, S. F. Multilevel adaptive methods for partial differential equations. (SIAM). , (1989).
  15. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 4455(2006).
  16. Berensmeier, S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 73 (3), 495-504 (2006).
  17. Petrigh, R. S., Fugassa, M. H. DNA extraction and a cost-effective detection method for Echinococcus granulosus protoscoleces. Veterinary Parasitology. 198 (3-4), 410-413 (2013).
  18. Lee, J. H., Park, Y., Choi, J. R., Lee, E. K., Kim, H. S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Medical Journal. 51 (1), 104-110 (2010).
  19. Rohland, N., Siedel, H., Hofreiter, M. A rapid column-based ancient DNA extraction method for increased sample throughput. Molecular Ecology Resources. 10 (4), 677-683 (2010).
  20. Gutiérrez-López, R., Martínez-de la Puente, J., Gangoso, L., Soriguer, R. C., Figuerola, J. Comparison of manual and semi-automatic DNA extraction protocols for the barcoding characterization of hematophagous louse flies (Diptera: Hippoboscidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 40 (1), 11-15 (2015).
  21. Seiler, C., et al. Nucleic acid extraction from formalin-fixed paraffin-embedded cancer cell line samples: a trade off between quantity and quality. BMC Clinical Pathology. 16 (1), 17(2016).
  22. Harada, S. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples. , Springer. 125-138 (2016).
  23. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PloS One. 12 (6), 0178706(2017).
  24. Fujii, T., et al. Evaluation of DNA and RNA quality from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue for next-generation sequencing-Retrospective study in Japanese single institution. Pathology International. , (2020).
  25. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Archiv: An International Journal of Pathology. 460 (2), 131-140 (2012).
  26. Niland, E. E., McGuire, A., Cox, M. H., Sandusky, G. E. High quality DNA obtained with an automated DNA extraction method with 70+ year old formalin-fixed celloidin-embedded (FFCE) blocks from the indiana medical history museum. American Journal of Translational Research. 4 (2), 198(2012).
  27. Riemann, K., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 21 (4), 244-248 (2007).
  28. Steinau, M., Patel, S. S., Unger, E. R. Efficient DNA extraction for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 13 (4), 377-381 (2011).
  29. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. The Journal of Molecular Diagnostics. 10 (4), 311-316 (2008).
  30. Okello, J. B., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Analytical Biochemistry. 400 (1), 110-117 (2010).
  31. Witt, S., Neumann, J., Zierdt, H., Gébel, G., Röscheisen, C. Establishing a novel automated magnetic bead-based method for the extraction of DNA from a variety of forensic samples. Forensic Science International: Genetics. 6 (5), 539-547 (2012).
  32. Ivanova, N. V., Fazekas, A. J., Hebert, P. D. Semi-automated, membrane-based protocol for DNA isolation from plants. Plant Molecular Biology Reporter. 26 (3), 186(2008).
  33. Sengüven, B., Baris, E., Oygur, T., Berktas, M. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. International Journal of Medical Sciences. 11 (5), 494(2014).
  34. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16 (3), 1215(1988).
  35. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  36. Khokhar, S. K., Mitui, M., Leos, N. K., Rogers, B. B., Park, J. Y. Evaluation of Maxwell 16 for automated DNA extraction from whole blood and formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 50 (2), 267-272 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FFPE
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи