Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка клеточного целевого взаимодействия с помощью ингибиторов PHP2 (PTPN11) Фосфатазы

5.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61457

⸱

17 июля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

В этой статье

Краткое содержание

Способность оценивать целевое участие ингибиторов-кандидатов в нетронутых клетках имеет решающее значение для обнаружения наркотиков. Этот протокол описывает 384 хорошо формат клеточного теплового сдвига анализ, который надежно обнаруживает клеточной целевой взаимодействия ингибиторов ориентации либо дикого типа SHP2 или его онкогенных вариантов.

Аннотация

Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащих фосфатазы 2 (SHP2), закодированный PTPN11 прото-онкоген, является ключевым посредником рецептора тирозин киназы (RTK) управляемых клеточной сигнализации, содействие выживанию клеток и распространения. Кроме того, SHP2 набирается рецепторами иммунной точки проверки для ингибирования активации B и Т-клеток. Аномальные функции SHP2 был вовлечен в развитие, прогрессирование и метастазы многих видов рака. Действительно, небольшие молекулы SHP2 ингибиторы недавно вступили в клинические испытания для лечения твердых опухолей с Ras / Raf / ERK активации пути, в том числе опухолей с некоторыми онкогенных мутаций Рас. Тем не менее, текущий класс ингибиторов SHP2 не эффективен против онкогенных вариантов SHP2, которые часто встречаются при лейкемии, и развитие конкретных малых молекул, нацеленных на онкогенный SHP2, является предметом текущих исследований. Распространенной проблемой большинства кампаний по открытию лекарств с участием цитозоловых белков, таких как SHP2, является то, что первичные анализы, которые управляют химическим открытием, часто являются анализами в пробирке, которые не сообщают о клеточном целевом участии соединений кандидатов. Чтобы обеспечить платформу для измерения активности клеточных целевых, мы разработали как дикий тип, так и мутант SHP2 сотовых тепловых сдвиг анализов. Эти анализы надежно обнаруживают целевое взаимодействие ингибиторов SHP2 в клетках. Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол этого анализа, который является ценным инструментом для оценки и характеристики ингибиторов SHP2.

Введение

Тирозин фосфорилирование играет важную роль в трансдукции сигнала вклетках 1,,2. Эта пост-трансляционная модификация катализуется белковых тирозин-киназами (ПТК) и обращена вспять белковых тирозинфосфатов (ПТП). Таким образом, аномальные функции ПТК или ПТП приводит к многим наследственным или приобретенным заболеваниям человека3,,4,,5,,6. Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащий фосфатазы 2 (SHP2) является широко выраженным не-рецептор типа PTP кодируется прото-онкоген PTPN117 и является ключевымрегулятором многочисленных физиологических процессов, которые включают трансдукции сигнала путем активации Ras/ Raf/ ERK, PI3K/Akt, или JAK/STATсигнализации пути 8. Как правило, активность SHP2 жестко регулируется для предотвращения аномальной сигнализации. В базальных условиях SHP2 автоматически блокируется своим N-терминалом SH2 домена, который блокирует доступ к активному сайту в области каталитической фосфатазы(рисунок 1A)9,10. После активации клеток, тирозин фосфорилированные связывающие белки набирают SHP2, заставляя его принять его активную конформацию, в которой активный сайт теперь доступен для своих субстратов. Во многих видах рака активность SHP2 повышена. Соматические усиления функции (GOF) мутации в PTPN11 были выявлены в основном при лейкемии и предотвращения связывания N-SH2 домена фосфатазы домена, в результате чего составно активны sHP2 (Рисунок 1B)11. Мутации germline GOF в PTPN11 отвечают за 50% случаев синдрома Нунана, расстройства развития с повышенным риском злокачественности12. В твердых опухолях, где мутации PTPN11 редки, более высокие уровни фосфорилированных связывающих белков приводят к повышенной активности SHP2(рисунок 1C). SHP2 также имеет важное значение для сигнализации иммунной контрольно-пропускной пункт, как контрольно-пропускные рецепторы, такие как BTLA или PD-1 набирать SHP2 для дефосфорилата ключевых сигнальных молекул, предотвращаяактивацию иммунных клеток 13,14,15.

Нацеливание PTPs с небольшими молекулами было проблемой, потому что активное место PTPs высоки сохранено и высоки поручено; ингибиторы, нацеленные на активный участок, часто являются мощными, но обладают плохой избирательностью и устной биодоступностью16,,17,,18,,19,,20,,21,,22. Действительно, многие сообщили SHP2 ингибиторы страдают от плохой избирательности и отсутствие эффективности в клетках23. В последнее время были зарегистрированы алостерические ингибиторы SHP2 с хорошей потенцией и отличной избирательностью (например, SHP09924 и RMC-455025)и вызвали новый интерес к ингибиторам SHP2. Соединения на основе SHP099 и RMC-4550 в настоящее время находятся в фазе I клинических испытаний для лечения твердых опухолей с рецептором тирозинкиназы (RTK)активации пути 26,27. Хотя новаторские, эти соединения являются неэффективными против многих из онкогенных мутантов SHP2, которые управляют лейкемогенезом в значительном числебольных раком крови 28,29,30. Это отсутствие потенции SHP099-как соединения к SHP2 онкогенных вариантов проистекает из их уникального алостерического механизма, так как они подавляют активность SHP2 путем связывания и стабилизации неактивной, закрытой конформации, которая нарушается в SHP2 мутантов. Кроме того, на основенедавнего доклада 31, адаптивной устойчивости механизмов у пациентов, лечения с SHP099-как ингибиторы вполне мыслимы. Следовательно, разработка ингибиторов SHP2 нового поколения, нацеленных на его активное, открытое состояние, является предметом интенсивных исследований.

Характеристика новых ингибиторов SHP2 в клетках является важным аспектом процесса оптимизации свинца. Критически, доказано целевое участие ингибитора в физиологических условиях обеспечивает дополнительный уровень уверенности в том, что ресурсы для лекарственной химии эффективно развернуты на соединениях с перспективной клеточной эффективностью. В прошлом было разработано несколько методов оценки привязки малых ингибиторов молекул к их целям, в первую очередь для белковых киназы32. Для разработки SHP2 клеточной целевой взаимодействия анализа, мы использовали сотовый тепловой сдвиг анализ33. Этот анализ, похожий на термальный сдвиг in vitro (PTS) дляанализа белков 34, отслеживает тепловую стабильность целевого белка, который обычно изменяется связыванием малых молекул. Первоначальный анализ является низкой пропускной способностью анализа, который использует антитела для количественной оценки целевых уровней белка. Кроме того, мы выбрали недавно сообщили вариант теплового сдвига анализ, который использует β-галактозидазы фермента фрагмента дополнения (EFC) анализ (Рисунок 2)35. Для этих экспериментов, белок интереса выражается в клетках как N- или C-терминал синтеза белка проведения расширенной ProLabel теги (ePL, 42 аминокислоты фрагмент β-галактозидазы). Клетки затем передаются в 384-хорошо PCR совместимых пластин и инкубируется с соединениями, представляющими интерес. Термоциклер используется для применения градиента температуры к клеткам, белки которых будут денатурировать и агрегировать по мере повышения температуры в зависимости от их тепловой стабильности. Способность соединения кандидата связывать и стабилизировать белок интереса приведет к повышенной тепловой стабильности этого белка. Таким образом, после лиза клеток, те помеченные белки, которые были стабилизированы соединением кандидата, останутся в растворе при более высоких температурах, чем помеченные белки клеток, инкубированных с контролем транспортного средства. Репортер фермента acceptor (EA) способен дополнить растворимые ePL-тегами белков, в результате чего обнаруживается β-галактозидазы деятельности с помощью люминесценции субстрата.

Недавно мы разработали надежный клеточный тепловой сдвиг анализ для дикого типа SHP2 (SHP2-WT) и частые SHP2 онкогенный вариант (SHP2-E76K) в миниатюрном формате 384-ну36. Здесь мы сообщаем подробный протокол этого анализа, который надежно обнаруживает целевое взаимодействие ингибиторами SHP2 в клетках и демонстрирует высокую степень корреляции между потенцией ингибитора и данными о клеточном тепловом сдвиге. Общий рабочий процесс анализа иллюстрируется на рисунке 3. Наша платформа использует N-терминированно помеченные полнометражные белки синтеза ePL-SHP2. Для генерации соответствующих pICP-ePL-N-SHP2-WT и pICP-ePL-N-SHP2-E76K выражения плазмидов, пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации36. Этот анализ может быть выполнен с использованием теплового градиента для создания тепловых профилей SHP2 и определения температуры плавления SHP2 при наличии или отсутствии ингибитора. После того, как тепловые профили были установлены, он также может быть выполнен в изотермальных условиях, что позволяет ингибитор доза-ответ оценки. Оба типа экспериментов описаны ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка клеточной культуры и реагентов

  1. Сформулируйте бутылку 500 мл средств роста с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 1x антибиотиком/антимикотикой, 20 мМ HEPES и 1 м натрийным пируватом. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
  2. Реагенты клеточного теплового сдвига оттепели (реагент EA, буфер лиза и субстрат) из замороженных оригинальных бутылок.
  3. Распределять реагенты и буфер в качестве 2 мл aliquots и хранить при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте замораживания/оттепели для воспроизводимости и используйте только тот объем реагента, необходимый для процедуры анализа.

2. Рост и обслуживание клеток HEK293T

  1. Получить низкий проход приверженец HEK293T клеток из крио хранения.
  2. Поддержание HEK293T клеток в средствах массовой информации роста при 37 кк, 5% CO2.
  3. Разделение ячеек каждые 4 дня в соотношении 1:14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей производительности, HEK293T клетки не допускаются к прохождению более 25 раз.

3. Подготовка клеток HEK293T для преходящей трансфекции

  1. Отсоедините клетки HEK293T от 16 мл пластин с использованием 3 мл реагента клеточного отслоения.
  2. Разбавить 12 мл средств массовой информации роста. Соберите клетки путем центрифугации при 1400 х г в течение 4 мин.
  3. Повторное производство гранул в 10 мл средств роста. Измерьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью трипан-голубого и клеточного счетчика.
  4. Плита 7.0 x 105 экспоненциально растущих heK293T клеток на колодец в 6 хорошо пластины культуры клеток примерно 24 ч до трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зарезервировать один колодец для каждого плазмида, чтобы быть трансфицированы.
  5. Инкубационный в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.

4. Трансфекция клеток HEK293T

  1. Из очищенного плазмидного запаса pICP-ePL-N-SHP2-WT или pICP-ePL-N-SHP2-E76K (200 нг/Л) разбавляют 2 мкг плазмидной ДНК в 200 л трансфектического буфера.
  2. Вихрь на 10 с и центрифугу при 1400 х г в течение 4 мин.
  3. Добавьте 4 МКЛ трансфектного реагента в разбавленную ДНК. Вихрь на 10 с и центрифугу при 1400 х г в течение 4 мин.
  4. Инкубировать при 23 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
  5. Удалите 6 хорошо пластины, содержащие растущие HEK293T клеток из инкубатора. Добавьте смесь трансфекции к прикрепленным клеткам в пластине 6-хорошо. Инкубационный для 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.

5. Подготовка анализных пластин

  1. Подготовка 10 мМ фондовых решений в DMSO соединений для тестирования.
  2. Распределять растворы ингибитора в 384-ну низкой мертвой пластины источника объема для немедленного использования.
  3. Определить желаемый объем ингибиторов или транспортного средства (DMSO) с помощью жидкого обработчика в 384-ну в режиме реального времени ПЦР пластин на целевой конечный объем менее 0,5% DMSO (v/v). Печать пластины с помощью пластины герметика с инертной очистки газа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа дозы ингибитора, убедитесь, что backfill DMSO соответственно, так что равное количество DMSO используются для каждой концентрации ингибитора. Для получения наилучших результатов храните тарелки при 23 градусах Цельсия и используйте пластины в пределах 24 ч.

6. Трансфицированный клеточный отряд и подготовка

  1. Предустановляют средства роста и реагент клеточного отслоения в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Удалите трансфектные клетки из инкубатора. Аккуратно аспирировать средства массовой информации из колодцев пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый аспиратор для каждой колодец, который содержит различные трансфицированные плазмиды.
  2. Добавьте 0,3 мл реагента клеточного отслоения. Аккуратно раскачивайте пластину вперед и назад, чтобы тщательно покрыть поверхность дна пластины. Инкубировать при 23 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
  3. Добавьте 1 мл средств роста к каждой хорошо. Аккуратно пипетки и клетки в колодец и передать в 15 мл Сокол центрифуги трубки. Соберите клетки путем центрифугации при 1400 х г в течение 4 мин.
  4. Аккуратно, но тщательно аспирировать от средств массовой информации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный фенол красный в реагенте отслоения клетки может помешать анализу.
  5. Тщательно resuspend ячейки гранулы в 2 мл средств массовой информации роста. Измерьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью трипан-голубого и клеточного счетчика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток должна быть на 90% выше для наилучших результатов.
  6. Разбавить клетки до концентрации 125 клеток/КЛ. Например, для анализа 5 МКЛ это 625 ячеек/йл. Для оптимальной жизнеспособности держите клетки в подвеске не более 2 ч.

7. Инкубация клеток ингибиторами SHP2

  1. Распределять клетки в стерильный одноканальные растворы корыта.
  2. Центрифуга 384-хорошо в режиме реального времени ПЦР пластины, которая была x g предварительно подготовлена SHP2 ингибитор осаждения на 2500 х г в течение 5 мин при 23 градусов по Цельсию.
  3. Снимите уплотнение с составной пластины. Используя многоканальный пипетку 125 МКЛ, добавьте 5 МКЛ разбавленных ячеек в нужные скважины.
  4. Центрифуга пластины на 42 х г на 30 с без крышки на пластине. Прикрепите уплотнение крышки к пластине после того, как пластина закружилась вниз и инкубировать анализ пластины при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 для 1 ч.

8. Подготовка смеси химлюминесцентных реагентов

  1. Удалите необходимое количество реагентов обнаружения (реагент EA, буфер лиза и субстрат) из хранилища -20 градусов по Цельсию после покрытия ячеек. Реагенты оттепели при 23 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства при передаче подготовьте объем, который в 1,5x от общего объема ячеек, которые были депонированы на тарелку. Не используйте реагенты повторно после использования.
  2. Подготовьте мастер-микс реагентов с использованием состояния EA-10, которое состоит из компонента и фракции объема следующим образом: реагент EA (0,17), буфер лиза (0,17), субстрат (0,67).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты реагентов основаны на экспериментах по оптимизации, выполненных, как указано в руководстве поставщика.

9. Изотермальный или тепловой профиль градиентного теплового импульса

  1. Запрограммировать градиент способный термоциклер для доставки теплового импульса.
    1. Для экспериментов с градиентом теплового профиля предварительно программируйте термоциклер со следующими спецификациями:
    2. Тепловой импульс: 3 мин желаемой температуры плавления (вертикальный или горизонтальный градиент No/- 15 градусов по Цельсию; пример 38-68 градусов по Цельсию, разбросанный по 24 скважинам, дает температуру приращения 1,25 градусов по Цельсию).
  2. Шаг восстановления эквилибрации: 3 мин 20 градусов по Цельсию со скоростью рампы
    1. Для изотермальных экспериментов настроить протокол, установленный следующим образом:
    2. Тепловой пульс: 3 мин. 55 градусов по Цельсию. Шаг восстановления эквилибрации: 3 мин 20 градусов по Цельсию со скоростью рампы
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышенной воспроизводимости, так как это может быть трудно разместить пластину именно в то время, когда термоциклер достигает желаемой температуры, настроить программу, чтобы отсчитать 15 с до начала 3 мин импульса. Для термоциклера, используемого в этом эксперименте, см. Таблицуматериалов, крышка держится во время теплового импульса.

10. Обнаружение и измерение лиза

  1. Дополнение анализных пластин с лизом обнаружения мастер смеси путем добавления равных объемов (5 йл) к каждой хорошо для анализа с помощью многоканальной пипетки.
  2. Центрифуга пластины 42 х г на 30 с. Хранить при 23 градусов по Цельсию в темноте в течение 30-60 мин.
  3. Измерьте хемилюминесценцию с помощью микропластиного считыватель, способный обнаруживать люминесценцию в формате 384-колодец. Выполните измерение люминесценции с оптимизированным типом пластины и оптимизированным временем интеграции (время интеграции 1000 мс, время схладения 0 с). Измерьте значения как количество/ы и выход для дальнейшего анализа.

11. Анализ данных

  1. Проанализируйте данные люминесценции с помощью научного программного обеспечения для 2D-графики и статистики.
  2. Создание тепловых профилей путем анализа нормализованных данных о люминесценции (нормализованных для управления транспортным средством) с использованием нелинейной регрессии и сигмоидной модели Больцмана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В тепловых экспериментов профиля, рассчитывается V50, температура, которая является на полпути между нижней и верхней части кривой, определяет температуру плавления SHP2. В изотермальных экспериментах EC50 определяет концентрацию ингибитора, который дает полу максимальную реакцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Тепловой градиентный эксперимент для SHP2-WT привел к сигмоидно-клеточному тепловому профилю с узким плавильным переходом, который является типичным и последовательным для сложенногобелка (рисунок 4A). SHP2 состоит из трех независимых доменов: двух доменов SH2 и каталитического домена(рисунок 1). В autoinhibited закрытой конформации эти домены self-associate; переход плавления, наблюдаемый в эксперименте с тепловым профилем, предположительно отражал это состояни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представили анализ целевого взаимодействия, который может подтвердить прямую привязку малых молекул к фосфатазе SHP2 в клетках. Анализ может различать ингибиторы низкого и высокого сродства и, что важно, подтвердить отсутствие потенции со стороны алостерических ингибиторов типа SHP099 для онкогенного мутанта GOF SHP2-E76K. Сила этого миниатюрного анализа заключается в его способности быть интегрированы в SHP2 ингибитор скрининга кампании. Способность анализа подтвердить внутриклеточную привязку к SHP2 неизвестным хими...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Грант 1R21CA195422 (К Л. Т.), Эпштейн Семьи Фонд премии (N. D. P.C.), и NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199. Кроме того, этот проект финансировался в целом или частично за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, в соответствии с контрактом Консорциума химической биологии No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает мнения или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и не упоминает торговые названия, коммерческие продукты или организации, подразумевающие одобрение правительством США. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Термоциклер с уклоном 384 скважиныEppendorf AGX50h
Микропластина Echo с низкой мертвым объёмом с 384 яками квалифицированаBeckman Coulter, Inc.LP-0200
Пластины с 6-ячественной клеточной культуройGreiner Bio-One657 160Стерильная с крышкой
Антибиотик-антимикотик (анти-анти) 100 XТермо Фишер Сайентифик15240-062
Счётчик ячеекТермо Фишер СайентификГрафиня II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXТермо Фишер Сайентифик10566-016500 мл
Echo — акустический обработчик жидкостиBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Электронная многоканальная пипеткаТермо Фишер СайентификE1 ClipTip
Сыворотка плода крупного рогатого скотаТермо Фишер Сайентифик26140-079500 мл
Буфер HEPESТермо Фишер Сайентифик15630-680100 мл
Стартовый набор InCell PulseEurofins DiscoverX Corp.94-4007Компоненты включают буфер ЭА, буфер лизиса и подложку
Считыватель микропластинTecan Trading AGИскра
Одноканальный растворТермо Фишер СайентификS253012005
Пируват натрияТермо Фишер Сайентифик11360-010100 мМ
Термомикропластинный герметикAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Реагенты для трансфекцииТрансфекция PolyplusjetPRIME
Трипан-синийТермо Фишер СайентификT10282
Реагент TrypLE ExpressТермо Фишер Сайентифик12605-010
ПЦР-пластины Twin.tec 384 в реальном времениEppendorf AG30132734

Ссылки

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ингибиторы SHP2клеточный анализ теплового сдвигаклетки HEK293 Tэксперимент с температурным градиентомизотермическое титрованиеаллостерический ингибитор SHP099онкогенные мутанты SHP2хемилюминесцентная детекция
Оценка клеточного целевого взаимодействия с помощью ингибиторов PHP2 (PTPN11) Фосфатазы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.