Способность оценивать целевое участие ингибиторов-кандидатов в нетронутых клетках имеет решающее значение для обнаружения наркотиков. Этот протокол описывает 384 хорошо формат клеточного теплового сдвига анализ, который надежно обнаруживает клеточной целевой взаимодействия ингибиторов ориентации либо дикого типа SHP2 или его онкогенных вариантов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка клеточного целевого взаимодействия с помощью ингибиторов PHP2 (PTPN11) Фосфатазы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащих фосфатазы 2 (SHP2), закодированный PTPN11 прото-онкоген, является ключевым посредником рецептора тирозин киназы (RTK) управляемых клеточной сигнализации, содействие выживанию клеток и распространения. Кроме того, SHP2 набирается рецепторами иммунной точки проверки для ингибирования активации B и Т-клеток. Аномальные функции SHP2 был вовлечен в развитие, прогрессирование и метастазы многих видов рака. Действительно, небольшие молекулы SHP2 ингибиторы недавно вступили в клинические испытания для лечения твердых опухолей с Ras / Raf / ERK активации пути, в том числе опухолей с некоторыми онкогенных мутаций Рас. Тем не менее, текущий класс ингибиторов SHP2 не эффективен против онкогенных вариантов SHP2, которые часто встречаются при лейкемии, и развитие конкретных малых молекул, нацеленных на онкогенный SHP2, является предметом текущих исследований. Распространенной проблемой большинства кампаний по открытию лекарств с участием цитозоловых белков, таких как SHP2, является то, что первичные анализы, которые управляют химическим открытием, часто являются анализами в пробирке, которые не сообщают о клеточном целевом участии соединений кандидатов. Чтобы обеспечить платформу для измерения активности клеточных целевых, мы разработали как дикий тип, так и мутант SHP2 сотовых тепловых сдвиг анализов. Эти анализы надежно обнаруживают целевое взаимодействие ингибиторов SHP2 в клетках. Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол этого анализа, который является ценным инструментом для оценки и характеристики ингибиторов SHP2.
Введение
Тирозин фосфорилирование играет важную роль в трансдукции сигнала вклетках 1,,2. Эта пост-трансляционная модификация катализуется белковых тирозин-киназами (ПТК) и обращена вспять белковых тирозинфосфатов (ПТП). Таким образом, аномальные функции ПТК или ПТП приводит к многим наследственным или приобретенным заболеваниям человека3,,4,,5,,6. Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащий фосфатазы 2 (SHP2) является широко выраженным не-рецептор типа PTP кодируется прото-онкоген PTPN11....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка клеточной культуры и реагентов
- Сформулируйте бутылку 500 мл средств роста с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 1x антибиотиком/антимикотикой, 20 мМ HEPES и 1 м натрийным пируватом. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
- Реагенты клеточного теплового сдвига оттепели (реагент EA, буфер лиза и субстрат) из замороженных оригинальных бутылок.
- Распределять реагенты и буфер в качестве 2 мл aliquots и хранить при -20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте замораживания/оттепели для воспроизводимости и используйте только тот объем реагента, необходимый для процедуры анализа.
2. Рост и обсл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Тепловой градиентный эксперимент для SHP2-WT привел к сигмоидно-клеточному тепловому профилю с узким плавильным переходом, который является типичным и последовательным для сложенногобелка (рисунок 4A). SHP2 состоит из трех независимых доменов: двух доменов SH2 и каталитического домена(рисунок 1). В autoinhibited закрытой конформации эти домены self-associate; переход плавления, наблюдаемый в эксперименте с тепловым профилем, предположительно отражал это состояни.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представили анализ целевого взаимодействия, который может подтвердить прямую привязку малых молекул к фосфатазе SHP2 в клетках. Анализ может различать ингибиторы низкого и высокого сродства и, что важно, подтвердить отсутствие потенции со стороны алостерических ингибиторов типа SHP099 для онкогенного мутанта GOF SHP2-E76K. Сила этого миниатюрного анализа заключается в его способности быть интегрированы в SHP2 ингибитор скрининга кампании. Способность анализа подтвердить внутриклеточную привязку к SHP2 неизвестным хими.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Грант 1R21CA195422 (К Л. Т.), Эпштейн Семьи Фонд премии (N. D. P.C.), и NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199. Кроме того, этот проект финансировался в целом или частично за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, в соответствии с контрактом Консорциума химической биологии No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает мнения или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и не упоминает торговые названия, коммерческие продукты или организации, подразумевающие одобрение правительс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Термоциклер с уклоном 384 скважины | Eppendorf AG | X50h | |
| Микропластина Echo с низкой мертвым объёмом с 384 яками квалифицирована | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| Пластины с 6-ячественной клеточной культурой | Greiner Bio-One | 657 160 | Стерильная с крышкой |
| Антибиотик-антимикотик (анти-анти) 100 X | Термо Фишер Сайентифик | 15240-062 | |
| Счётчик ячеек | Термо Фишер Сайентифик | Графиня II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Термо Фишер Сайентифик | 10566-016 | 500 мл |
| Echo — акустический обработчик жидкости | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Электронная многоканальная пипетка | Термо Фишер Сайентифик | E1 ClipTip | |
| Сыворотка плода крупного рогатого скота | Термо Фишер Сайентифик | 26140-079 | 500 мл |
| Буфер HEPES | Термо Фишер Сайентифик | 15630-680 | 100 мл |
| Стартовый набор InCell Pulse | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Компоненты включают буфер ЭА, буфер лизиса и подложку |
| Считыватель микропластин | Tecan Trading AG | Искра | |
| Одноканальный раствор | Термо Фишер Сайентифик | S253012005 | |
| Пируват натрия | Термо Фишер Сайентифик | 11360-010 | 100 мМ |
| Термомикропластинный герметик | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Реагенты для трансфекции | Трансфекция Polyplus | jetPRIME | |
| Трипан-синий | Термо Фишер Сайентифик | T10282 | |
| Реагент TrypLE Express | Термо Фишер Сайентифик | 12605-010 | |
| ПЦР-пластины Twin.tec 384 в реальном времени | Eppendorf AG | 30132734 |
Ссылки
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
