Количественная оценка зоны сцепления cell-substrate и распределения формы клеток в монолиях клеток MCF7

Summary

В статье описывается количественная оценка 1) размера и количества фокусных спаек и 2) индекса формы клеток и его распределения от конфокальных изображений слияние моноселей клеток MCF7.

Abstract

Методы, представленные здесь количественно некоторые параметры слияния адептов клеток монослой из нескольких соответствующим образом окрашенных конфокальных изображений: прилипание к субстрату в качестве функции числа и размера фокусных спаек, и форма клеток, характеризующаяся индексом формы клетки и другими дескрипторами формы. Фокусные спайки были визуализированы при окрашивании паксилина, а клеточные границы были отмечены стыковым плакоглобином и актином. Методы клеточной культуры и окрашивания являются стандартными; изображения представляют собой единые фокусные плоскости; анализ изображений проводился с использованием общедоступного программного обеспечения для обработки изображений. Представленные протоколы используются для количественной оценки количества и размера фокусных спаек и различий в распределении формы клеток в монослоях, но они могут быть перепрофилированы для количественной оценки размера и формы любой другой клеточной структуры, которая может быть окрашена (например, митохондрии или ядра). Оценка этих параметров имеет важное значение в характеристике динамических сил в адептов клеточного слоя, в том числе клея клеток и актомиозин контрактистойности, которая влияет на форму клеток.

Introduction

Эпителиальные клеточные монослой действуют как коллектив, в котором ячейка-клетка и клеточный субстратный спайка, а также контрактные силы и напряжения представляют важные параметры, и их надлежащий баланс способствует общей целостности блока^1,2,3. Таким образом, оценка этих параметров представляет собой способ установить текущее состояние слоя ячейки.

Два описанных здесь метода представляют собой двумерный анализ слияние монослой адептов, эпителиальных клеток (в данном случае линия клеток рака молочной железы MCF7). Анализ проводится с использован....

Protocol

1. Подготовительные шаги

1. Сотовый посев для получения слияние монослой
   1. Перед посевом, пальто колодцы 4-колодцы камерной слайд с коллагеном I (или другой компонент ECM выбора). Для покрытия коллагена I, следуйте коммерческому протоколу: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html с концентрацией 8 мкг/см².
   2. Семя 400000 клеток к одному колодцу 4-хорошо камерной слайд.
   3. Культура клеток на 24 ч (или больше, в зависимости от экспериментальных конечных точек) перед окрашивания, в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂. Этот шаг позволяет созревания клеточ....

Results

Анализ фокусной адгезии
Нокдаун гена HAX1 ранее было показано, влияют на фокусные спайки⁶. Клетки были культивируются на поверхности коллагена I-покрытием для 48 h. Изображения клеток управления MCF7 и клеток MCF7 с нокдауном HAX1 (HAX1 KD) из трех независимых экспериментов, окрашенных с фокусной клей белка paxillin были получены с помощью конфокального микроскопа (изображение из одной фокусной плоскости / К-ломтик из базальной области). FAs от около .......

Discussion

Клеточная и клеточно-субстратная адгеция являются неотъемлемыми атрибутами эпителиальных клеток и играют решающую роль в морфогенезе ткани и эмбриогенезе. В взрослых тканях правильное регулирование механических свойств клеточного слоя имеет решающее значение для поддержания гомеостаза и предотвращения патологических реакций, таких как прогрессирование опухоли и метастазы. Размер и количество фокусных спаек зависят от силы клеточной субстратной спайки, в то время как форма клеток зависит от сократительных сил и связана со.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	козий анти-кролик, 1:500
Хлорид аммония	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Коллаген из кожи теленка	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (запас 1 мг/мл в H2O), нуклеиновая кислота окрашивание
DMEM + GlutaMAX, 1 г/л D-глюкоза, пируват	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction плакоглобин	Cell Signaling	2309S	кролик, 1:400
Ламинарный шкаф класс 2	Alpina		стандартное оборудование
MCF7-basedHAX1KD клеточная линия	Клеточная линия, созданная в Национальном институте онкологии, Варшава, описана в Balcerak et al., 2019<		em>MCF7 клеточная линия сHAX1knockdown
MCF7 клеточная линия (контроль)	ATCC	ATCC HTB-22	эпителиальная, адгезивная клеточная линия рака молочной железы
Olympus CK2 световой микроскоп	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	кролик, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
фаллоидин-ТРИТК конъюгат	Sigma	P1951	1:400 (запас 5 мг/мл в ДМСО), актиновое мечение
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – База Тризма	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Конфокальный микроскоп	Zeiss