Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод проточной цитометрии для характеристики фагоцитарных свойств остро изолированной микроглии взрослого человека и макрофагов головного мозга in vitro

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61467

⸱

23 июня 2020 г.

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

В этой статье

Краткое содержание

Оценка фагоцитарных свойств микроглии и макрофагов головного мозга может обеспечить ценный функциональный аспект для исследований молекулярного профилирования. Мы описываем валидированный протокол, в котором проточная цитометрия используется для быстрой и надежной количественной оценки фагоцитоза флуоресцентных микросфер и бета-амилоидных фибрилл с помощью остро изолированной микроглии и макрофагов мозга из мышиных моделей.

Аннотация

Микроглия и инфильтрирующие центральную нервную систему (ЦНС) макрофаги, называемые мононуклеарными фагоцитами ЦНС (ЦНС-МП), играют центральную роль при неврологических заболеваниях, включая нейродегенерацию и инсульт. ЦНС-МП участвуют в фагоцитарном клиренсе патологических белков, мусора и нейрональных синапсов, каждый из которых имеет различные молекулярные пути. Характеристика этих фагоцитарных свойств может обеспечить функциональное считывание, которое дополняет молекулярное профилирование микроглии с использованием традиционных подходов проточной цитометрии, транскриптомики и протеомики. Фагоцитарное профилирование микроглии основывалось на микроскопической визуализации и культурах in vitro неонатальной микроглии мышей. Первый подход страдает от ограниченной выборки, в то время как второй подход по своей сути плохо отражает истинное состояние in vivo взрослых ЦНС-МП. В данной работе описаны оптимизированные протоколы фенотипа фагоцитарных свойств остро изолированных ЦНС-МП мышей методом проточной цитометрии. ЦНС-МП остро выделяют из мозга взрослой мыши с помощью механической диссоциации с последующей центрифугированием градиента плотности, инкубируют с флуоресцентными микросферами или флуоресцентными Aβ-фибриллами, промывают и затем мечут панелями антител против поверхностных маркеров (CD11b, CD45). Используя этот подход, можно сравнить фагоцитарные свойства резидентной микроглии головного мозга с макрофагами, инфильтрирующими ЦНС, а затем оценить влияние старения и патологии заболевания на эти фагоцитарные фенотипы. Этот быстрый метод также обладает потенциалом для функционального фенотипирования остро изолированных ЦНС-МП человека из посмертных или хирургических образцов мозга. Кроме того, специфические механизмы фагоцитоза субпопуляциями ЦНС-МП могут быть исследованы путем ингибирования отдельных фагоцитарных путей.

Введение

Клетки врожденного иммунитета центральной нервной системы (ЦНС) в основном состоят из микроглии и инфильтрирующих моноцитов/макрофагов, называемых мононуклеарными фагоцитами ЦНС-МНП (ЦНС-МП)1. МП ЦНС связаны с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера (БА), нейровоспалительные расстройства и инсульт 2,3,4. ЦНС-МП, наряду с астроцитами, перицитами и эпендимальными клетками, обладают фагоцитарными функциями 5,6. В своем гомеостатическом состоянии ЦНС-МП участвуют в постоянном наблюдении за местным микроокружением, наряду с фагоцитарным клиренсом апоптотического клеточного мусора и белков, а также синаптической обрезкой для ремоделирования нейронных связей 7,8,9,10. При нейродегенеративных состояниях, таких как болезнь Альцгеймера, МП ЦНС принимают различные молекулярные и функциональные фенотипы, связанные с заболеванием, которые могут играть патологические роли, включая клиренс агрегированного бета-амилоида (Aβ) и нейрональных элементов, а также воспалительные цитокины и высвобождение факторов, что приводит к комплексным провоспалительным, вредным, а также противовоспалительным, защитным ролям 11,12,13,14. Фагоцитоз макрочастиц, клеточного мусора, белков и других инфекционных частиц ЦНС-МП опосредован различными рецепторами, экспрессируемыми на их поверхности9. Нарушение этих фагоцитарных путей может привести к дефектному клиренсу и прогрессирующему накоплению Aβ, что в конечном итоге приводит к прогрессирующему повреждению нейронов при AD 4,9. В то время как достижения в молекулярном профилировании ЦНС-МП с использованием транскриптомного и протеомного подходов позволили получить бесценную информацию о молекулярной гетерогенности ЦНС-МП при неврологических заболеваниях15,16, функциональная характеристика фагоцитарных свойств ЦНС-МП и их подмножеств в настоящее время отсутствует. Функциональная характеристика фагоцитарных свойств ЦНС-МП может дополнить стратегии молекулярного профилирования, способствовать лучшему функциональному фенотипированию и помочь в оценке эффективности терапевтических средств, которые могут исправить дефектный фагоцитоз в моделях заболеваний17.

Традиционные анализы фагоцитоза для ЦНС-МП включают инкубацию первичной микроглии вместе с флуоресцентными субстратами, такими как Aβ или частицы латекса/полистирола. Затем фагоцитоз изучают как функцию поглощения флуоресцентного субстрата с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии 18,19,20. Хорошо известно, что ЦНС-МП при сохранении в длинных культурах могут резко изменять свою морфологию и транскрипционные профили21,22. Это затрудняет изучение фагоцитарных свойств ЦНС-МП в их репрезентативном состоянии в ЦНС. Анализ функциональной проточной цитометрии для профилирования остро изолированных живых ЦНС-МП может обеспечить быструю оценку фагоцитарных свойств и может обеспечить выборку гораздо большего пула ЦНС-МП, чем подходы микроскопии 9,23. Кроме того, проточная цитометрия устраняет необходимость в поддержании ЦНС-МП в культуре, а также обеспечивает платформу для изучения фагоцитозных свойств в различных субпопуляциях ЦНС-МП. В данной рукописи описаны оптимизированные протоколы фенотипа фагоцитарных свойств остро изолированных ЦНС-МП мышей методом проточной цитометрии. Адаптация анализов фагоцитоза с помощью проточной цитометрии позволяет быстро мультиплексировать фагоцитарный фенотип ЦНС-МП в сочетании с иммунным фенотипированием, тем самым давая представление о гетерогенности фагоцитарных свойств в ЦНС-МП при разрешении одной клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на мышах проводились после получения одобрения от Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори и в строгом соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения.

1. Подготовка в день изоляции

  1. Приготовьте ведро со льдом, чтобы все реагенты, буферы и клеточные суспензии оставались холодными на протяжении всей процедуры изоляции.
  2. Поместите флакон с 1× фосфатно-солевого буфера (PBS) (не менее 1 л) при температуре 4 °C на 30 минут до 1 часа до перфузии и держите 1× PBS на льду во время процедуры перфузии и изоляции.
  3. Готовят рабочую концентрацию градиентной среды плотности (обозначается как 35% СИП, см. Таблицу материалов).
  4. Промаркируйте все конические и проточные цитометрические пробирки, используемые в эксперименте, перед выделением клеток, чтобы избежать задержек во времени обработки. Кроме того, перед перфузией соберите все другие принадлежности, необходимые для изоляции, такие как клеточные фильтры 40 мкм, шприцы и иглы.

2. Острая изоляция микроглии взрослой мыши

  1. Обезболите взрослую мышь, поместив ее в стеклянную индукционную камеру с изофлураном (5 мл) до тех пор, пока мышь не перестанет дышать и не перестанет реагировать на защемление задней конечности лапой.
  2. С помощью иглы 26 G и шприца 10 мл выполните перфузию сердца с 30 мл ледяного 1× PBS до тех пор, пока не исчезнет видимая кровь.
  3. Обезглавите мышь хирургическими ножницами. С помощью маленьких ножниц разрежьте кожу, обнажив череп. Удалите череп, не повреждая ткани мозга, как описано24. Немедленно извлеките мозг и переложите его в стерильное клеточное ситечко размером 40 мкм, помещенное поверх конической трубки объемом 50 мл.
  4. Используйте заднюю сторону поршня шприца объемом 3 мл, чтобы протолкнуть мозг через сетчатое фильтр и механически диссоциировать всю мозговую ткань. Периодически промывайте сетчатый фильтр и поршень клеток во время диссоциации 2 мл ледяного холода 1× PBS каждый раз, чтобы убедиться, что вся ткань проходит через ситечко.
  5. Соскребите дно сетчатого фильтра с помощью поршня, чтобы собрать остатки взвеси в конусе. Тщательно промойте сетчатый фильтр ледяным 1× PBS и вылейте суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При последовательной обработке нескольких животных поместите клеточные суспензии на лед до дальнейшей обработки.
  6. Добавьте ледяной 1× PBS, чтобы довести объем клеточной суспензии до 30 мл, и центрифугируйте при 800 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  7. Слейте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, и повторно суспендируйте гранулу в 6 мл 35% SIP с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Перенесите суспензию клеток + смесь 35% SIP в новую коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 800 × г в течение 25 минут при 15 °C без тормоза.
    ВНИМАНИЕ: Будьте особенно осторожны, чтобы не допустить появления пузырьков во время повторного суспензирования. Чрезмерное количество пузырьков может нанести ущерб выходу клеток.
  8. Осторожно извлеките коническую пробирку объемом 15 мл из центрифуги, не потревожив слои, и аспирируйте верхний плавающий слой миелина.
  9. Перенесите клеточную суспензию + смесь 35% SIP с помощью серологической пипетки объемом 10 мл в новую коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл ледяного 1× PBS, и центрифугируйте при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно слейте надосадочную жидкость, оставив после себя клеточную гранулу вместе с 500\u2012800 мкл 1× PBS.
  10. Повторно суспензируйте клеточную гранулу, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки p1000, и переложите в пробирку с круглым дном объемом 5 мл. Добавьте 2 мл ледяного 1× PBS в пробирку с круглым дном и центрифугируйте при 1 400 × г в течение 2 минут при 4 °C. Быстро слейте надосадочную жидкость, оставив клеточную гранулу, содержащую ЦНС-МП, примерно в 100 мкл 1× PBS (рис. 1).

3. Постановка фагоцитоза и проточное цитометрическое окрашивание

  1. Перенесите 20 мкл (≈200 000 клеток) ресуспендированных ЦНС-МП в свежую трубку с круглым дном объемом 5 мл и добавьте 80 мкл ледяного 1× PBS. Не добавляйте в эту пробирку флуоресцентные субстраты или антитела для проточной цитометрии. Эти клетки служат в качестве отрицательного контроля для определения фоновой флуоресценции ЦНС-МП для анализов проточной цитометрии.
  2. Чтобы установить жизнеспособность выделенных ЦНС-МП, используйте живые/мертвые красители на основе аминов (например, Fixable Blue UV).
    1. Ресуспендируйте оставшуюся часть клеточной гранулы в 500 мкл 1× PBS и добавьте 1 мкл восстановленного красителя в каждую пробирку с образцом, за исключением отрицательного контроля.
    2. Аккуратно перемешайте, накройте трубки пленкой и выдержите их при комнатной температуре в течение 30 минут. Впоследствии добавьте по 1 мл 1× PBS в каждую пробирку и аккуратно перемешайте.
    3. Центрифугируйте клетки при 1 400 × г в течение 2 мин при 4 °C. Быстро слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл 1× PBS.
      Красители на основе аминов связываются с внеклеточными фибриллами Aβ, искажая результаты фагоцитоза. Другие живые/мертвые индикаторы могут влиять на флуоресценцию Aβ-фибрилл/микросфер. Следовательно, индикатор «Живой/мертвый» рекомендуется использовать только в предварительных экспериментах для установления жизнеспособности изолированных ЦНС-МП.
  3. Пробирку с микросферами ПЭ-полистирола тщательно протравить и добавить 2 мкл (≈200 микросфер/ячейка) в 100 мкл клеточной суспензии в проточных трубках, за исключением отрицательного контроля. Осторожно проведите по вихревому слою каждую пробирку, чтобы обеспечить равномерное распределение субстрата с клетками, и поместите пробирки с круглым дном в стерильный увлажненный инкубатор на 30 минут при температуре 37 °C с 5%CO2.
    1. Осторожно сделайте вихревую и инкубируйте отрицательную контрольную трубку, чтобы обеспечить одинаковые экспериментальные условия для положительных и отрицательных образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании Aβ-фибрилл вместо PE-микросфер приготовьте флуоресцентные фибриллы HiLyte488 Aβ, как описано ранее9. Конечная концентрация фибрилл Aβ составляет 200 μМ, которые затем разбавляют для получения свежего запаса 20 μМ в PBS флуоресцентных мономеров Aβ. Добавьте 12,5 мкл 20 мкМ стоковых мономеров Aβ в каждую пробирку, содержащую выделенные клетки.
  4. Выньте клетки из инкубатора и добавьте по 1 мл 1× PBS в каждую пробирку и аккуратно перемешайте. Центрифугируйте клетки при 1400 × г в течение 2 мин при 4 °C и быстро слейте надосадочную жидкость. Повторите промывку с 1 мл 1× PBS, центрифугируйте при 1400 × г в течение 2 минут, слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл 1× PBS.
    Примечание: После каждого спина важно держать клетки на льду, чтобы подавить продолжающееся поглощение фагоцитов.
  5. Вихревые антитела проточной цитометрии и центрифугирование их в микроцентрифуге в течение 10 с. В каждую пробирку клеточной суспензии добавляют по 1 мкл CD11b-APC/Cy7 и CD45-PE/Cy7 для анализа на Aβ-фагоцитоз или CD45-FITC для фагоцитоза PE-микросферы. Аккуратно переверните каждую трубку и инкубируйте в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре.
    Примечание: Пользователи также могут включить отдельную пробирку, содержащую мощные фагоцитарные клетки, такие как культивируемая микроглия BV2 или перитонеальные макрофаги, в качестве положительного контроля и обрабатывать их ПЭ-микросферами и проточно-цитометрическими антителами, как описано выше. Данные из этого образца могут быть использованы для определения положительного контроля, обозначающего истинный фагоцитоз в предварительных экспериментах.
  6. Пока клетки находятся в процессе инкубации, установите компенсационные трубки с помощью четырех проточных трубок с круглым дном объемом 5 мл. Тщательно перебейте компенсационные шарики и добавьте по 1 капле в каждую трубку. Добавьте 1 мкл CD11b-APC/Cy7 в первую пробирку и CD45-FITC во вторую пробирку. Добавьте 1 μл полиэтиленового полистирола в третью пробирку и оставьте незагрязненные компенсационные шарики в четвертой пробирке. Используйте эту четвертую пробирку в качестве отрицательного контроля для установки компенсационной панели на проточном цитометре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда Aβ-фибриллы используются для изучения фагоцитоза, добавьте CD45-PECy7 во вторую пробирку вместо CD45-FITC. Добавьте 1 мкл отдельного меченного FITC антитела для проточной цитометрии или вторичного антитела FITC (любого вида) в третью компенсационную пробирку. Это важно, так как шарики не могут связываться с фибриллами Aβ и будут смываться при промывке компенсационных трубок.
  7. Дайте компенсационным шарикам инкубироваться с соответствующими антителами в течение не менее 10 минут. После инкубации добавьте 1 мл 1× PBS в каждую пробирку, центрифугируйте при 1400 x g в течение 2 минут при 4 °C и быстро слейте надосадочную жидкость. Поместите компенсационные пробирки на лед и накройте их фольгой до проточной цитометрии.
  8. После инкубации с антителами проточной цитометрии промойте окрашенные клетки 1 мл 1× PBS. Аккуратно переведите в вортбол и центрифугируйте клетки при давлении 1 400 × г в течение 2 минут при 4 °C. Быстро слейте надосадочную жидкость и повторите промывку с 1 мл 1× PBS. После центрифугирования слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл 1× PBS.
  9. Поместите пробирки с образцами на лед и накройте их алюминиевой фольгой до проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1× PBS (pH 7,0) без Ca2+/Mg2+ в качестве буфера для потока на протяжении всего эксперимента. Убедитесь, что фетальная бычья сыворотка (FBS) исключена из буфера потока, чтобы избежать возможной активации микроглии.

4. Проточная цитометрия и анализ

  1. Настройка прибора и компенсация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты в данной рукописи проводились на проточном цитометре с ультрафиолетовым, фиолетовым, синим, желто-зеленым и красным лазерами. Этот эксперимент также может быть адаптирован к трехлазерным проточным цитометрам только с синим, желто-зеленым и красным лазерами. Пользователи должны пройти формальное обучение перед обращением с прибором.
    1. Наполните буферную емкость проточной оболочки и включите цитометр. «Заправьте» цитометр круглой проточной трубкой объемом 5 мл, содержащей ddH2O. Войдите в программное обеспечение для анализа на компьютере, подключенном к проточному цитометру. Создайте «эксперимент» и выберите FSC, SSC, FITC, PECy7 и APC-Cy7 в качестве параметров. Если вы используете PE-микросферы, выберите PE вместо PECy7 на панели параметров.
    2. Создайте соответствующую панель компенсации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В наших экспериментах обычно напряжение FSC/SSC для компенсационных шариков составляет около 350/280, в то время как напряжение FSC/SSC для CNS-MPS составляет около 320/260. Эти значения могут варьироваться между любыми двумя разными цитометрами и должны быть откалиброваны перед фактическим экспериментом.
    3. Восстановите каждую компенсационную и подвесную трубку с 500 мкл 1× PBS, кратковременно завихрите, и поместите на лед. Запустите трубку с отрицательным контролем / неокрашенными шариками, чтобы установить соответствующее напряжение таким образом, чтобы пик на каждой гистограмме флуорофора был ниже 102. Запустите другие одноцветные компенсационные трубки, чтобы определить их отчетливые положительные пики.
      Примечание: Между положительными и отрицательными пиками каждого флуорофора должна быть по крайней мере половина логарифма (основание 10).
    4. Запишите 5000 событий с каждой компенсационной трубки, чтобы компьютер мог автоматически рассчитать настройку компенсации. Свяжите установку компенсации с текущим экспериментом25.
    5. Создайте новую «трубку» на вкладке образца. Осторожно сделайте вихрь и проведите по отрицательной контрольной трубке, содержащей неокрашенные CNS-MP. Отрегулируйте напряжение прямого и бокового рассеяния, чтобы захватить интересующую популяцию. Записывайте события и подворота в прямом эфире CNS-MPS, как указано ниже.
    6. Захватывайте и записывайте события со всех последующих ламп в виде отдельных файлов с сохранением постоянных параметров и напряжений. Осторожно проведите по каждой пробирке перед тем, как провести их по проточному цитометру.
  2. Стратегия стробирования и измерение фагоцитоза
    1. Нарисуйте начальный моноядерный затвор для захвата всех CNS-MP. Эти живые мононуклеарные клетки должны быть забиты на следующем графике, чтобы включать только одиночные клетки, исключая двустишия и тройки.
    2. Проецируйте закрытую одиночную живую популяцию CNS-MPS на последующий график, отображающий флуорофоры CD11b и CD45.
      Примечание: Резидентная микроглия головного мозга обычно являетсяпромежуточным CD11b + CD45, в то время как инфильтрирующие макрофаги имеютвысокий уровень CD11b + CD45. Дополнительные маркеры, такие как Ly6c, могут быть включены в панель для дальнейшего уверенного отделения воспалительных моноцитов (высокий уровень Ly6c ивысокий уровень CD45) от микроглии (промежуточный показатель Ly6cс низким уровнем CD45).
    3. Примените соответствующие ворота для дальнейшего изучения фагоцитоза в соответствующих популяциях, как показано на рисунке 2F.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фагоцитоз в ЦНС-МП измеряется в зависимости от поглощения ими флуоресценции Hilyte488/Alexa488 (Aβ) или PE (микросфера). Отчетливый положительный пик на соответствующих гистограммах указывает на то, что ЦНС-МП фагоцитировали субстрат. Количество фагоцитированного материала прямо пропорционально интенсивности флуоресценции. Следовательно, наличие множественных пиков следует интерпретировать как более высокий фагоцитоз. Впоследствии они могут быть подтверждены иммуногистохимическим методом.
    4. После записи всех пробирок с образцами на проточный цитометр экспортируйте файлы данных в формат .fcs для дальнейшего анализа.
  3. Статистический анализ данных
    1. Используйте любое программное обеспечение для анализа проточной цитометрии вместе с электронными таблицами и программным обеспечением для статистического анализа для всех анализов данных.
    2. Добавьте файлы .fcs в программное обеспечение для анализа и дважды щелкните по первому файлу. График, отображающий все записанные
      События появятся. Следуйте аналогичной стратегии гейтирования, как показано на рисунке 2, чтобы впоследствии гейтировать одиночные живые мононуклеарные клетки и изучить фагоцитоз на конкретной популяции, например,на промежуточных микроглиальных клетках CD11b + CD45 (рисунок 2H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фагоцитарный индекс оценивается на основе доли клеток, интернализующих флуоресцентные Aβ-фибриллы или ≥1 микросферы. Как было определено ранее, фагоцитоз низкого уровня — это поглощение не менее 1 микросферы, а фагоцитоз высокого уровня — поглощение >1 гранул 8,9. Согласно ранее проведенным экспериментам, ингибирование актин-зависимых процессов цитохалазином D полностью ингибирует поглощение >1 шарика и частично ингибирует поглощение 1 шарика9, а также полностью ингибирует поглощение Aβ, подтверждая актин-зависимое фагоцитарное поглощение, а не пассивное связывание с поверхностью клетки. Иммуноцитохимия также подтверждает, что каждый последовательный пик в микросферном анализе является репрезентативным для унитарного увеличения числа фагоцитированных гранул 8,9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для иллюстрации типичных результатов фагоцитарного поглощения микросфер и фибрилл Aβ42 остроизолированными ЦНС-МП были получены остроизолированные ЦНС-МП из ипсилатерального полушария после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (ОКАО)8. Для получения подробной информации о фагоцитарных свойствах ЦНС-МП в модели MCAO, пожалуйста, обратитесь к предыдущим публикациям8. Вкратце, после 72-часового восстановления МП ЦНС были остро выделены из свежего мозга с помощью меха...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Проточная цитометрия — это метод, который может обнаруживать экспрессию белков или маркеров, представляющих интерес, на поверхности клетки или во внутриклеточных компартментах с помощью флуоресцентно меченых зондов (обычно антител) для обозначения этих представляющих интерес маркеров. Антитела клеточной поверхности или внутриклеточные антитела обычно конъюгированы с возбуждаемыми лазером флуорохромами, которые имеют уникальные эмиссионные спектры. Клетки, инкубированные с этими антителам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование было поддержано наградами NIH доктору Рангараджу (NINDS K08 NS099474-1 и R01 NS114130-01A1) и доктору Раяпролу (NIA F32AG064862). Это исследование было частично поддержано Emory Flow Cytometry Core (EFCC), одним из Emory Integrated Core Facility (EICF) и субсидируется Медицинской школой Университета Эмори. Дополнительная поддержка была оказана Альянсом клинических и трансляционных наук Джорджии NIH (UL1TR002378). Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x сбалансированный раствор соли Хэнка (10x HBSS)ThermoFisher14065056хранения при 4 °C. Используется для приготовления SIP, как описано в протоколе
1x сбалансированный раствор соли Хэнка (1x HBSS)ThermoFisher14175095хранить при 4 °C. Используется для получения 35% SIP, как описано в протоколе
1x Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Храните 10xPBS при комнатной температуре. Приготовьте свежий 1xPBS, разбавив одну часть 10xPBS до девяти частей MilliQ dH20 и храните его при температуре 4 °°; C за час до использования. Перед охлаждением убедитесь, что pH 1xPBS составляет 7,0.
35% SIPЧтобы сделать 20 мл 35% SIP, используйте 7 мл SIP и 13 мл ice-cold 1 раз; HBSS. Держать на льду до дальнейшей обработки
APC-Cy7 крысы анти-CD11bBD Pharmingen557657Хранить при 4° C или держать на льду во время использования. Шилд от света. Разведение проточной цитометрии - 1:100
FITC rat anti mouse CD145BD Pharmingen553080Хранить при 4 ° C или держать на льду во время использования. Шилд от света. Разведение проточной цитометрии - 1:100
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Исправляемый набор для окрашивания синими мертвыми клеткамиThermoFisherL34961Хранить при -20 °C. Добавьте 50 мкл ДМСО в одну пробирку с красителем, сделайте вихрь и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 1 мин. Сделайте 10&м; L аликвоты и храните их при -20 °C. Используйте свежую аликвоту для каждого эксперимента и добавляйте в образцы в разведении 1:500.
OneComp eBeads компенсационные бусиныThermoFisher01-1111-42Магазин по адресу 4 ° C, тщательно промотать пробирку перед добавлением в пробирку (пробирки) с образцом, держать на льду во время использования.
PE-Cy7 крысиный антимышиный CD145BD Pharmingen552848хранить в 4 ° C или держать на льду во время использования. Шилд от света. Разведение проточной цитометрии - 1:100
Percoll pH8.5-9.5SigmaP1644Хранить при 4°C. Чтобы сделать 10 мл стандартного изотонического Percoll (SIP): используйте 9 мл холодного Percoll и 1 мл холодного 10 раз; HBSS.
Фикоэритрин-конъюгированные микросферыThermoFisherF13083хранятся при температуре 4° C или держать на льду во время использования.
β-амилоид (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - меченый, HumanAnaSpecAS-60479-01Конечная концентрация Ab фибрилл составляет 200&микро; M, который затем разбавляется перед использованием. Хранить при -20 °C. Готовьте свежий рабочий раствор для каждого эксперимента.

Ссылки

  1. Jordan, F. L., Thomas, W. E. Brain macrophages: questions of origin and interrelationship. Brain Research. 472 (2), 165-178 (1988).
  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
  3. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of Leukocyte Biology. 87 (5), 779-789 (2010).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
  6. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 6(2013).
  7. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial Phagocytosis and Its Regulation: A Therapeutic Target in Parkinson's Disease. Frontiers in molecular neuroscience. 11, 144(2018).
  8. Gao, T., et al. Temporal profiling of Kv1. 3 channel expression in brain mononuclear phagocytes following ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 116(2019).
  9. Rangaraju, S., et al. Differential Phagocytic Properties of CD45(low) Microglia and CD45(high) Brain Mononuclear Phagocytes-Activation and Age-Related Effects. Frontiers in Immunology. 9, 405(2018).
  10. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  11. Dubbelaar, M. L., Kracht, L., Eggen, B. J. L., Boddeke, E. The Kaleidoscope of Microglial Phenotypes. Frontiers in Immunology. 9, 1753(2018).
  12. Ransohoff, R. M., El Khoury, J. Microglia in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (1), 020560(2015).
  13. Venegas, C., et al. Microglia-derived ASC specks cross-seed amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nature. 552 (7685), 355-361 (2017).
  14. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  17. Rangaraju, S., et al. Identification and therapeutic modulation of a pro-inflammatory subset of disease-associated-microglia in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 24(2018).
  18. Mutzke, E., Chomyshyn, E., Nguyen, K. C., Blahoianu, M., Tayabali, A. F. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Analytical Biochemistry. 483, 40-46 (2015).
  19. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. Journal of Neuroscience. 25 (36), 8240-8249 (2005).
  20. Pul, R., Chittappen, K. P., Stangel, M. Quantification of microglial phagocytosis by a flow cytometer-based assay. Methods in Molecular Biology. 1041, 121-127 (2013).
  21. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  23. Grasse, M., Rosenkrands, I., Olsen, A., Follmann, F., Dietrich, J. A flow cytometry-based assay to determine the phagocytic activity of both clinical and nonclinical antibody samples against Chlamydia trachomatis. Cytometry A. 93 (5), 525-532 (2018).
  24. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, (2011).
  25. Szalóki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  26. Chen, M. J., et al. Microglial ERK activation is a critical regulator of pro-inflammatory immune responses in Alzheimer's disease. J bioRxiv. , 798215(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD11b CD45
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.