Методическая статья

Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification

DOI:

10.3791/61478

⸱

25 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station, University of Georgia, 2University of Georgia Cooperative Extension, 3Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center, University of Florida, 4Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center, Tennessee State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали метод обнаружения Phytophthora capsici zoospores в источниках воды с помощью метода извлечения ДНК фильтровальной бумаги в сочетании с циклом опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, который может быть проанализирован в полевых условиях или в лаборатории.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora capsici является разрушительным патогеном oomycete, который влияет на многие важные соланацеозные и кукурбитовые культуры, ежегодно причиняющие значительные экономические потери в производстве овощей. Phytophthora capsici является почвенной и постоянной проблемой на овощных полях из-за его долгожил структур выживания (oospores и chlamydospores), которые сопротивляются выветривания и деградации. Основным методом рассеивания является производство зооспоров, которые являются одноклеточные, флагеллированные споры, которые могут плавать через тонкие пленки воды, присутствующие на поверхностях или в заполненных водой пор почвы и может накапливаться в лужах и прудах. Таким образом, ирригационные пруды могут быть источником патогена и первоначальными точками вспышек болезней. Обнаружение P. capsici в оросительной воде трудно использовать традиционные методы, основанные на культуре, потому что другие микроорганизмы, присутствующие в окружающей среде, такие как Pythium spp., обычно перерастают P. capsici, что делает его необнаружимым. Чтобы определить наличие спор P. capsici в источниках воды (оросительная вода, сток и т.д.), мы разработали ручной насос на основе фильтровальной бумаги (8-10 мкм) метод, который захватывает споры патогена (zoospores) и позже используется для усиления ДНК патогена через новый цикл опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, предназначенный для конкретного усиления P. capsici. Этот метод может усилить и обнаружить ДНК из концентрации, как низко как 1,2 х10 2 зооспоров / мл, что в 40 раз более чувствительны, чем обычные ПЦР. При тестировании близко связанных видов не было получено перекрестного усиления. LAMP также была выполнена с помощью цветометрического LAMP мастер смеси красителя, отображение результатов, которые могут быть прочитаны невооруженным глазом для быстрого обнаружения на месте. Этот протокол может быть адаптирован к другим патогенным микроорганизмам, которые обитают, накапливаются или рассредоточены через загрязненные ирригационные системы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переработка воды на фермах и в детских садах становится все более популярной в связи с ростом цен на воду и экологическими проблемами, связанными с использованием воды. Для производителей было разработано множество методов орошения для сокращения распространения и возникновения болезней растений. Независимо от источника воды (орошения или осадков), сток генерируется, и многие овощеводы и питомники имеют пруд для сбора и переработки стока1. Это создает резервуар для возможного накопления патогенов в пользу распространения патогенных микроорганизмов, когда переработанная вода используется дляорошения сельскохозяйственных культур 2,,3,,4. Oomycete растительных патогенов особенно извлечь выгоду из этойпрактики,как зооспоры будут накапливаться в воде и первичной диспергаторной споры является самодвижительным, нотребует поверхностных вод 5,6,7. Phytophthora capsici является патогеном oomycete, который влияет на значительное количество соланацезных и cucurbit культур по-разному8. Часто симптомы демпфирования-офф саженцев, корнеплодов и коронки гнили; однако, в таких культурах, как огурец, тыква, дыня, тыква, арбуз, баклажаны и перец, целые урожаи могут быть потеряны из-за фруктовойгнили 9. Хотя Есть известные методы обнаружения этого патогена растений, большинство требуют инфекции уже имели место, которое слишком поздно для любых профилактических фунгицидов, чтобы иметь значительныйэффект 10.

Традиционный метод проверки оросительной воды для выявления и диагностики целевых микроорганизмов является устаревшим подходом, когда скорость и чувствительность имеют решающее значение для успеха иприбыльного производства сельскохозяйственных культур 11,,12. Ткань растений, восприимчивая к целевому патогену (например, баклажаны для P. capsici) крепится к модифицированной ловушке, которая приостанавливается в оросительном пруду в течение длительного периода времени, прежде чем быть удалены и проверены на инфекцию. Образцы из растительной ткани затем помылись на полу селективных средств массовой информации (PARPH) и инкубируется для роста культуры, то морфологическая идентификация выполняется с помощьюсоединения микроскопа 13. Есть и другие аналогичные методы обнаружения для других патогенных микроорганизмов растений с использованием селективных средств массовой информации и покрытие небольшое количество загрязненнойводы до суб-культа 14,15. Эти методы требуют от 2 до 6 недель, несколько раундов суб-культирования, чтобы изолировать организм, и опыт по фитофторы диагностики, чтобы иметь возможность распознавать ключевые морфологические символы каждого вида. Эти традиционные методы не работают хорошо для обнаружения оросительной воды, загрязненной P. capsici из-за таких факторов, как вмешательство других микроорганизмов, которые также присутствуют в источниках воды. Некоторые быстрорастущие микроорганизмы, такие как Pythium spp. и бактерии, передающие воду, могут разрастаться на пластине, делая P. capsici необнаружимым16,,17.

Целью данного исследования была разработка чувствительного и специфического молекулярного метода, который может быть использован как в полевых, так и в лабораторных условиях для обнаружения зооспоров P. capsici в оросительной воде. Протокол включает в себя разработку нового цикла опосредованного изотермального усиления (LAMP) грунтовки набор, способный специально усилить P. capsici, на основе 1121-базовой пары (bp) фрагмент P. capsici18,19. Ранее разработанная грунтовка LAMP от Dong et al. (2015) была использована по сравнению с анализом, который был разработан для этого исследования20.

Анализ LAMP является относительно новой формой молекулярного обнаружения, которая была продемонстрирована как более быстрая, чувствительная и специфичная, чем обычная полимераза цепная реакция (PCR)21. В целом, обычные анализы ПЦР не могут обнаружить менее 500 копий (1,25 пг/ОЛ); в отличие от этого, предыдущие исследования показали, что чувствительность LAMP может быть от 10 до 1000 раз выше, чем обычные ПЦР и может легко обнаружить даже 1 fg/L геномнойДНК 22,23. Кроме того, анализ может быть проведен быстро (часто в 30 мин) и на месте (в поле) с помощью портативного нагревательного блока для усиления и колоритетрического красителя, который меняет цвет для положительного образца (удаление необходимости электрофореза). В этом исследовании мы сравнили чувствительность анализов ПЦР и LAMP с помощью метода извлечения фильтра. Предлагаемый метод обнаружения позволяет исследователям и агентам расширения легко обнаружить наличие спор P. capsici из различных источников воды менее чем за два часа. Анализ оказался более чувствительным, чем обычные ПЦР и был проверен на месте, обнаружив наличие патогена в оросительной воде, используемой производителем. Этот метод обнаружения позволит производителям оценить наличие и плотность популяции патогена в различных источниках воды, которые используются для орошения, предотвращая разрушительные вспышки и экономические потери.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обнаружение фитофторы капсиди из оросительной воды с использованием портативного опосредованного петлей изотермального усиления

  1. Настройка насоса и фильтра
    1. Прикрепите фильтруя колбу к трубке, которая подключена к ручной насос, так что, когда насос активирован, воздух будет вытащил через рот фильтровальной колбы.
    2. Fit Buchner воронки в резиновой пробкой в рот фильтровальной колбы и подходят соответствующим размером лист фильтровальной бумаги в воронку Buchner так, что воздух вытащил через фильтровальную бумагу. Фильтровальную бумагу должен иметь размер удержания 15 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтровая бумага должна соответствовать краям воронки Buchner так, чтобы минимальная вода текла вокруг фильтровальной бумаги.
  2. Отбор проб воды и фильтрация
    1. Возьмите пробы воды из целевого источника. Вода может иметь небольшое количество мусора, но не значительные осадки или почвы.
    2. Налейте до 1000 мл (1 литр) испытательной воды над фильтровальной бумагой, помещенной внутри воронки Buchner достаточно медленно, чтобы предотвратить переполнение, в то время как ручной насос (или вакуум) используется для создания всасывания, чтобы вытащить воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует не минимальное количество воды, которые могут быть проверены с помощью этого метода, и, хотя это по крайней мере 50 мл предлагается, 1000 мл является максимальным для этого метода.
    3. Используя типсы, удалите фильтровальную бумагу из воронки Бухнера и разрежьте ее на мелкие кусочки стерильными ножницами. Добавьте как можно больше частей (8-12), которые могут быть погружены в буфер извлечения (400 мл для извлечения на основе магнитного бисера), требуемого протоколом, в трубку объемом 1,5 мл. Сохраните оставшиеся кусочки фильтровальной бумаги для обработки после извлечения первого набора.
    4. Vortex или иным образом агитировать куски фильтровальной бумаги и извлечения буфера в течение 10 с каждую минуту в течение 5 минут. Затем, используя типсы, удалите фильтровальную бумагу, теряя как можно меньше буфера извлечения. Повторите этот шаг с оставшимися кусочками фильтровальной бумаги до тех пор, пока все части не будут вихревые/возбужденные и пропитанные буфером извлечения.
  3. Добыча ДНК из фильтровальной бумаги на основе магнитного шарика
    1. К трубе объемом 1,5 мл (которая в настоящее время содержит примерно 200-300 МКЛ буфера экстракции) добавьте 20 МКЛ протеиназы K и 10 МКЛ из 10 нг/йл RNase.
    2. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут, вихрь или встряхнуть трубку каждые 3 минуты.
    3. Добавьте 500 МКЛ магнитных бусин с связывающим буфером к образцу и хорошо перемешайте, встряхивая. Затем инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
    4. Поместите трубку в магнитную стойку сепаратора в течение 2 минут, пока все бусы не будут вытащили к магниту. Удалите и отбросьте супернатант.
    5. Удалите трубку из магнитного сепаратора. Добавьте 500 МКЛ из Wash Buffer 1 и повторно приостанавливайте бисер, энергично встряхивая трубку. Подождите 30 с, а затем поместите трубку обратно в магнитный сепаратор. Подождите 2 мин, пока все бусы были вытащил к магниту, прежде чем удалить и отбрасывая supernatant.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При ожидании магнитных бусин намагничить к сепаратору, мы рекомендуем инвертировать трубку, которая может выбить магнитные бусы, прилипающие к крышке и бокам трубки и привести к большему количеству бисера прилагается.
    6. Повторите шаг 1.3.5 с 500 йл Wash Buffer 2.
    7. Повторите шаг 1.3.5 с 500 л 80% этанола.
    8. Airdry магнитные гранулы шарика в течение 15 мин при комнатной температуре (18-27 градусов по Цельсию) с открытой крышкой. Если температура не позволяет, инкубировать в перчатке руку с крышкой открытой в течение 15 минут.
    9. Удалите трубку из магнитного сепаратора. Добавьте 50 МКЛ буфера элюции и повторно приостановить шарики, трубя вверх и вниз в течение 1 мин.
    10. Поместите трубку обратно в магнитный сепаратор. Подождите 2 минуты, прежде чем передать супернатант, не нарушая бисер в отдельную трубку для хранения ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент может быть приостановлен, прежде чем двигаться дальше. Извлеченная ДНК должна храниться на льду или в морозильной камере -20 градусов по Цельсию.
  4. Применение недавно разработанного анализа LAMP
    1. Подготовка LAMP грунтовка смесь с использованием 0,2 МКМ каждого F3 и B3 грунтовка, 0,8 МКМ каждого Loop-F и Loop-B грунтовка, и 1,6 МКМ каждого FIP и BIP грунтовка (Таблица 2).
    2. Добавьте следующее решение LAMP в одну трубку ПЦР или в каждую индивидуальную трубку в 8-трубной полосе: 2,5 л грунтовки (шаг 1.4.1), 12,5 л мастер-микса LAVA LAMP, 1 л извлеченной ДНК и 9 л ddH2O. Общий объем составляет 25 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании портативного инструмента усиления (например, Genie III) с колориметрическим красителем (например, Warmstart), обратитесь к разделу 2.4.2- 2.4.3.
    3. Назначьте две трубки как положительный и отрицательный контроль. Для положительного контроля используйте либо контроль, предоставляемый комплектом LAVA LAMP, либо известный положительный образец ДНК. Для отрицательного контроля используйте ddH2O. Для обоих замените 1 МКЛ извлеченной ДНК на 1 МКЛ положительного контроля или ddH2O.
    4. Установите образцы в тепловой блок (или портативный инструмент усиления), установленный до 64 градусов по Цельсию в течение 45 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы извлечения могут быть использованы здесь вместо магнитной добычи на основе бисера. CTAB и коммерческий набор для извлечения ДНК были успешно протестированы с использованием стандартных протоколов и замены кусочков фильтровальнойбумаги для образца растения 24,25. Результаты были сопоставлены в таблице 2. Если концентрация ДНК может быть количественно, используйте между 1-10 нг геномной ДНК.
  5. Визуализация результатов
    1. Если выполняется в лабораторных условиях, просматривать продукты усиления, загрузив 5 МКЛ каждого образца в 1% агарозный гель, запуская их в гель электрофорез машины, и визуализации их в УФ-изображения машины.
    2. Если использовался колоритетрический краситель (например, Warmstart), просмотрите изменение цвета, чтобы определить результаты как положительные или отрицательные.
    3. Если использовался портативный инструмент усиления (например, Genie III), просмотрите график усиления на экране для определения результатов.
  6. Применение ранее разработанного анализа ПЦР
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании обычного анализа ПЦР шаги 1-3 остаются прежними, и следующие шаги должны применяться вместо шагов 1.4 и 1.5.
    1. Добавьте 1 йл каждой экстракции ДНК в отдельные трубки, содержащие следующие компоненты: 12,5 МКЛ смеси Зеленого ПЦР, 9,5 мл ddH2O и 1 МКЛ вперед и обратного грунтовки(таблица 2).
    2. Спин вниз каждый образец с помощью микроцентрифуга и место труб в тепловой циклер.
    3. Используйте следующие настройки теплового цикла в соответствии с предыдущими публикациями: 94 градуса по Цельсию в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 градусов по Цельсию на 30 с, аннеалирование при 54 градусов по Цельсию на 30 с, расширение при 72 градусов по Цельсию в течение 1 мин, и окончательное расширение при 72 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
    4. Запустите продукт в 1% агарозный гель. Наблюдайте за наличием полос под ультрафиолетовым светом, где положительные реакции будут иметь размер полосы 508 bp.
  7. Традиционный метод обнаружения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько методов селективного покрытия для обнаружения патогенов, и ниже приводится общий протокол для P. capsici.
    1. Во-первых, получить здоровые плоды баклажанов (восприимчивый хозяин для P. capsici)и поверхности стерилизовать путем мытья поверхности плода с 70% изопропилового спирта.
    2. Поместите плоды баклажанов в молочные ящики с флотационным устройством (полиэтиленовая пена или другие) и разверните в оросительных прудах. Защитите каждую приманку ловушку в одной точке и оставить ловушки в водохранилище (рециркулированных оросительных вод) по крайней мере 7 дней или до тех пор, пока плод гнили симптомы наблюдаются. Соберите фрукты и транспорт их в лабораторию.
    3. Промыть и высушить фрукты в стерильном капюшоне перед удалением мелких кусочков инфицированных тканей и поместить их на тарелку PARPH среды изменены с 25 мг / Л пентахлоронитробензен, 0,0005% пимарицин, 250 мг / л ампициллина, 10 мг / л рифампицин и 50 мг / Л hymexazol. Инкубационые пластины при 25 градусов по Цельсию в течение 5 дней.
    4. Просмотр пластин под составным микроскопом для традиционной морфологической идентификации через 4 дня после изоляции.

2. Определение предела обнаружения концентрации зооспора

  1. Изготовление подвески зооспора
    1. Инкубировать P. capsici на V8 агар (100 мл сока V8, 900 мл ddH2O, 1 г CaCO3) пластины в течение 1 недели при 26 градусов по Цельсию. Несколько пластин могут быть использованы для получения большего количества подвески зооспора.
    2. Инкубировать пластины под непрерывным светом при комнатной температуре в течение 3 дней, чтобы стимулировать споруляцию.
    3. Затопляйте пластины, добавляя 15 мл ddH2O к каждой тарелке и поместите их в холодильник 4 градусов по Цельсию в течение 25 минут. Затем вернуться к комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Агитировать пластины, чтобы выбить зооспоры и пипетки раствор в одну трубку 50 мл из всех пластин.
    5. Чтобы получить точную оценку концентрации зооспора, добавьте 10 йл суспензии споры на гемоцитометр и наблюдайте под микроскопом, чтобы подсчитать зооспоры и оценить среднюю концентрацию.
  2. Серийное разбавление
    1. Добавьте 1 мл суспензии споры и 9 мл ddH2O в отдельную трубку. Повторите этот шаг для столько 10-кратного разбавления по желанию.
    2. Споры решения затем представлены для извлечения ДНК на основе предыдущего протокола с использованием метода фильтрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании больший объем подвески удвоит объем: 2 мл подвески споры и 18 мл ddH2O.
  3. Обнаружение предела концентрации зооспора
    1. Оцените предел обнаружения спор, запуская каждое последовательное разбавление индивидуально через анализ, пока четко положительные результаты больше не наблюдаются. Как только окончательное разбавление получено, разбавлять в 2 раза (4,8 до 2,4 в этом примере) и запустить анализ снова, чтобы получить более точный предел обнаружения.
  4. Разработка и оптимизация метода LAMP
    ПРИМЕЧАНИЕ: LAMP грунтовки были разработаны на основе 1121-базовой пары (bp) фрагмент P. capsici (Li et al.19), как показано на дополнительном рисунке 2.
    1. Если используется колориметрический краситель (например, Warmstart), используйте следующее решение: 2,5 МЛ грунтовой смеси, 12,5 мл колориметрического красителя, 0,5 МЛ зеленого флуоресцентного красителя, 1 МКЛ извлеченной ДНК и 8,5 мл ddH2O. Общий объем составляет 25 мкл.
    2. При использовании портативного инструмента усиления с LAVALAMP mastermix, есть начальный шаг 95 градусов по Цельсию в течение 3 минут, как это рекомендовано производителем, но это не требуется. Окончательный шаг по аннеализации не требуется для наблюдения за изменением цвета или графиком усиления. Не запускать шаг warmstart, если коммерческий колоритометрический краситель должен быть использован.
    3. Просмотр анализа LAMP приводит к одному из следующих методов: запустить образцы на 1% агарозный гель или просматривать с помощью УФ-изображения машины невооруженным глазом или зрения на Genie III в режиме реального времени усиления экрана.
    4. Оптимизация температуры анализа LAMP с помощью портативного инструмента усиления и проанализированы с использованием графика усиления в режиме реального времени для скорости и уровня чувствительности. Запустите образцы с уникальной температурой, чтобы определить самое быстрое усиление с самым высоким уровнем чувствительности.
    5. Определите предел обнаружения LAMP разработанного анализа, сделав серийное разбавление извлеченной ДНК (как с подвеской споры в шаге 2.2.1) и поддерживая условия реакции, как описано ранее для реакции LAMP для каждого разбавления.
  5. Определение предела обнаружения и сравнение с обычным методом ПЦР
    1. Используйте ДНК, извлеченную шагами в разделе 1.3, чтобы сравнить уровень обнаружения обычного ПЦР с уровнем анализа LAMP.
    2. Добавьте 1 МКЛ ДНК в трубку ПЦР, содержащую 1 МКЛ как вперед, так и с обратной стороны ПЦР-праймеров (таблица2),12,5 МКЛ Зеленого ПЦР Мастермикса и 9,5 МЛ ddH2O в общей сложности 25 КЛ.
    3. Усильте образцы в тепловом циклере, используя следующие условия: 94 градуса по Цельсию в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 градусов по Цельсию на 30 с, аннеалирование при 54 градусов по Цельсию на 30 с, расширение при 72 градусов по Цельсию в течение 1 мин.
    4. Вы пробежка образцов в электрофорезной машине на 1% агарозном геле и просмотр УФ-изображения машины. Размер исключенной полосы составил 508 б.п.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимизация метода LAMP
В этом исследовании, мы обнаружили наличие Phytophthora capsici в оросительной воде с помощью портативной петли опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ. Во-первых, предлагаемый анализ LAMP был оптимизирован путем тестирования различных концентраций грунтовки LAMP (F3, B3 (0,1-0,5 МКМ каждая); ЛФ, ЛБ (0,5–1,0 мкм каждый) и ФИП, БИП (0,8–2,4 м каждый)», продолжительность (30–70 мин.) и температура (55–70 градусов по Цельсию). Окончательный LAMP грунтовка см...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тестирование оросительной воды для фитопатогенов является важным шагом для производителей, использующих ирригационные пруды и переработанную воду27. Ирригационные пруды обеспечивают водохранилище и питательную пластырь для ряда фитопатогенов, так как избыточная оросительная вода направляется с поля в пруд, неся с собой любые патогенные микроорганизмы, которыемогли присутствовать 16,,27. Традиционный метод обнаружения патогенных микрооргани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать или какие-либо конфликты интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа получила финансовую поддержку Грузинской товарной комиссии по овощам проекта ID' FP00016659. Авторы благодарят д-р Pingsheng Цзи, Университет Джорджии и д-р Энн Дорранс, Университет штата Огайо за предоставление чистой культуры Phytophthora spp. Мы также благодарим Ли Ван и Делорис Вени за их техническую помощь на протяжении всего исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Порошок агарозного геляThomas ScientificC997J85
воронка БюхнераSouthern LabwareJBF003
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Centrifuge 5430Eppendorf22620509
хлороформFischer ScientificC298-500
CTAB растворBiosciences786-565
Набор для экстракции DneasyQiagen69104
Фильтр-колбаUnitedFHFL1000
фильтровальная бумагаUnited Scientific SuppliesFPR009
Гель зеленый 10000XThomas ScientificB003B68 (1/EA)
Genie IIIOptiGene
Ручной насосThomas Scientific1163B06
Изоамиловый спиртFischer ScientificBP1150-500
LAVA LAMP мастер-миксLucigen30086-1
Магнитная экстракция ДНК в шарикахGenesiggenesigEASY-EK
Магнитный сепараторgenesiggenesigEASY-MR
поливинилпирролидонSigma AldrichPVP40-500G
ПраймерыSigma Aldrich
Prism Мини центрифугаLabnetC1801
T100 ТермоамплификаторBio-Rad1861096
УФ гель DocAnalytik Jena849-00502-2
Warmstart Колориметрический красительLucigenE1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT CellBio-Rad1704489EDU
70% изопропанолFischer ScientificA451-1

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
  2. Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
  3. Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
  4. Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
  5. Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
  6. Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
  7. Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
  8. Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
  9. Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
  10. Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
  11. Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
  12. Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
  13. Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
  14. Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
  15. Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655(1990).
  16. Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
  17. Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
  18. Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
  19. Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
  20. Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
  21. Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089(2018).
  22. Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
  23. Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903(2019).
  24. Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
  25. Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
  26. Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
  27. Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
  28. Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50(2019).
  29. Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
  30. Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LAMP

Похожие статьи