Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification

Owen Hudson; Sumyya Waliullah; Justin Hand; Romina Gazis-Seregina; Fulya Baysal-Gurel; Md Emran Ali

doi:10.3791/61478

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification

5.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61478

⸱

25 июня 2020 г.

Owen Hudson¹ , Sumyya Waliullah¹ , Justin Hand² , Romina Gazis-Seregina³ , Fulya Baysal-Gurel⁴ , Md Emran Ali¹

¹Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station, University of Georgia, ²University of Georgia Cooperative Extension, ³Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center, University of Florida, ⁴Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center, Tennessee State University

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали метод обнаружения Phytophthora capsici zoospores в источниках воды с помощью метода извлечения ДНК фильтровальной бумаги в сочетании с циклом опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, который может быть проанализирован в полевых условиях или в лаборатории.

Аннотация

Phytophthora capsici является разрушительным патогеном oomycete, который влияет на многие важные соланацеозные и кукурбитовые культуры, ежегодно причиняющие значительные экономические потери в производстве овощей. Phytophthora capsici является почвенной и постоянной проблемой на овощных полях из-за его долгожил структур выживания (oospores и chlamydospores), которые сопротивляются выветривания и деградации. Основным методом рассеивания является производство зооспоров, которые являются одноклеточные, флагеллированные споры, которые могут плавать через тонкие пленки воды, присутствующие на поверхностях или в заполненных водой пор почвы и может накапливаться в лужах и прудах. Таким образом, ирригационные пруды могут быть источником патогена и первоначальными точками вспышек болезней. Обнаружение P. capsici в оросительной воде трудно использовать традиционные методы, основанные на культуре, потому что другие микроорганизмы, присутствующие в окружающей среде, такие как Pythium spp., обычно перерастают P. capsici, что делает его необнаружимым. Чтобы определить наличие спор P. capsici в источниках воды (оросительная вода, сток и т.д.), мы разработали ручной насос на основе фильтровальной бумаги (8-10 мкм) метод, который захватывает споры патогена (zoospores) и позже используется для усиления ДНК патогена через новый цикл опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, предназначенный для конкретного усиления P. capsici. Этот метод может усилить и обнаружить ДНК из концентрации, как низко как 1,2 х^{10 2} зооспоров / мл, что в 40 раз более чувствительны, чем обычные ПЦР. При тестировании близко связанных видов не было получено перекрестного усиления. LAMP также была выполнена с помощью цветометрического LAMP мастер смеси красителя, отображение результатов, которые могут быть прочитаны невооруженным глазом для быстрого обнаружения на месте. Этот протокол может быть адаптирован к другим патогенным микроорганизмам, которые обитают, накапливаются или рассредоточены через загрязненные ирригационные системы.

Введение

Переработка воды на фермах и в детских садах становится все более популярной в связи с ростом цен на воду и экологическими проблемами, связанными с использованием воды. Для производителей было разработано множество методов орошения для сокращения распространения и возникновения болезней растений. Независимо от источника воды (орошения или осадков), сток генерируется, и многие овощеводы и питомники имеют пруд для сбора и переработки стока¹. Это создает резервуар для возможного накопления патогенов в пользу распространения патогенных микроорганизмов, когда переработанная вода используется для^{орошения сельскохозяйственных культур....}