Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Пациент-производные Ксенотрансплантат Модель для венозной мальформации

4.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61501

⸱

15 июня 2020 г.

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем подробный протокол для создания murine xenograft модель венозной мальформации. Эта модель основана на подкожной инъекции эндотелиальных клеток, полученных пациентом, содержащих гиперактивные мутации генов TIE2 и/или PIK3CA. Поражения ксенотрансплантата тесно резюмируют гистопатологические особенности ткани пациента VM.

Аннотация

Венозная мальформация (ВМ) является сосудистой аномалией, которая возникает в результате нарушения развития венозной сети, что приводит к расширенным и часто дисфункциональным венам. Цель этой статьи состоит в том, чтобы тщательно описать создание модели ксенотрансплантата murine, которая имитирует человеческий VM и способна отражать неоднородность пациента. Гиперактивные ненаследуемые (соматические) мутации ТЭК (TIE2) и ПИК3КА в эндотелиальных клетках (ЭК) определены в качестве основных факторов расширения патологических сосудов в ВМ. В следующем протоколе описывается изоляция, очистка и расширение ЕК, полученной пациентом, выражают мутант TIE2 и/или PIK3CA. Эти EC вводятся подкожно в спину иммунодефицитных атимических мышей для генерации эктатических сосудистых каналов. Поражения, генерируемые TIE2 или PIK3CA-мутантом EC, заметно сосудизируются в течение 7-20129 дней после инъекции и подытося гистопатологические особенности ткани пациента VM. Эта модель Ксенотрансплантата VM обеспечивает надежную платформу для исследования клеточных и молекулярных механизмов, движущих образованием и расширением VM. Кроме того, эта модель будет иметь важное значение для трансляционных исследований тестирования эффективности новых кандидатов наркотиков в предотвращении аномального расширения сосудов видели в человеке VM.

Введение

Дефекты в развитии сосудов являются основной причиной многих заболеваний, включая венозную мальформацию (ВМ). ВМ является врожденным заболеванием, характеризующимся аномальным морфогенезом и расширениемвен 1. Важные исследования на ткани VM и эндотелиальных клеток (EC) определили усиления функции мутаций в двух генах: ТЭК, который кодирует рецептор тирозинкиназы TIE2, и PIK3CA, который кодирует p110 "(каталитический субъединица) изоформ PI3-киназы (PI3K)2,3,4.5 Эти соматические мутации приводят к лиганд-независимой гипер-активации ключевых ангиогенных/рост сигнальных путей, включая PI3K/AKT, что приводит к расширенным эстатическимвенам 3. Несмотря на эти важные генетические открытия, последующие клеточные и молекулярные механизмы, запускающие аномальный ангиогенез и образование увеличенных сосудистых каналов, до сих пор не до конца изучены.

Во время нормального и патологического ангиогенеза, новые сосуды прорастают из уже существующей сосудистой сети и EC проходят последовательность важных клеточных процессов, включая пролиферацию, миграцию, внеклеточную матрицу (ECM) ремоделирование и образованиелюмена 6. Двух- и трехмерные (2D/3D) культуры in vitro EC являются важными инструментами для исследования каждого из этих клеточных свойств в отдельности. Тем не менее, существует явный спрос на модель мыши, резюмируемую расширение патологических сосудов в рамках микроокноронности хозяина, обеспечивая при этом эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов для трансляционных исследований.

До настоящего времени не сообщалось о трансгенной модели murine VM, связанной с мутациями усиления функции TIE2. Текущие трансгенные модели мышей VM опираются на повсеместное или ограниченное в тканях выражение активизировавшейся мутации PIK3CA p.H1047R3,5. Эти трансгенные животные дают значительное представление о воздействии этой мутации PIK3CA на все тело или ткани. Ограничением этих моделей является формирование высоко патологической сосудистой сети, приводящей к ранней летальности. Таким образом, эти мышиные модели не в полной мере отражают спорадическое возникновение мутационных явлений и локализованный характер патологии ВМ.

Напротив, модели ксенотрансплантата, полученные пациентом, основаны на трансплантации или инъекции патологических тканей или клеток, полученных от пациентов в иммунодефицитныхмышей 7. Ксенотрансплантат модели являются мощным инструментом для расширения знаний о развитии болезни и открытие новых терапевтическихагентов 8. Кроме того, использование клеток, полученных пациентами, позволяет ученым резюмировать неоднородность мутаций для изучения спектра фенотипов пациентов.

Здесь мы описываем протокол, в котором полученные пациентом VM EC, которые выражают мутант constitutively-активную форму TIE2 и/или PIK3CA вводятся подкожно в задней части атимических обнаженных мышей. Инъекционные сосудистые клетки подвешиваются в рамках ЭКМ для содействия ангиогенезу, как описано в предыдущих сосудистых моделях ксенотрансплантата9,,10,,11. Эти ВМ EC проходят значительный морфогенез и генерируют увеличенные, проникнутые патологические сосуды при отсутствии поддерживающих клеток. Описанная ксенотрансплантатная модель ВМ обеспечивает эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов на их способность препятствовать неконтролируемому расширению люмена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы тканей пациентов были получены от участников после информированного согласия от сбора и хранения образцов тканей и данных от пациентов с опухолями и сосудистыми аномалиями в соответствии с утвержденным Институциональным советом по обзору (IRB) в рамках институциональной политики в Медицинском центре детской больницы Цинциннати (CCHMC), Институте рака и заболеваний крови и с одобрения Комитета по клиническим исследованиям. Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных CCHMC.

1. Подготовка материалов и фондовых решений

  1. Подготовка полной эндотелиальной среды роста клеток (EGM)
    1. Дополнение эндотелиальной базальной среды (EBM) со следующими факторами роста, присутствующими в комплекте (см. Таблицу материалов ):фактор роста фибробласта человека -бета (hFGF-я), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), Long Arg3 Инсулин-как фактор роста - I (R3-IGF-I), аскорбиновая кислота, эпидермальный фактор роста (EGF), гентамицин сульфат и амфотерицин-B, и гепарин. Добавьте 1% раствор пенициллина/стрептомицина/L-глютамина (PSG) и 20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не рекомендуем добавлять гидрокортизон.
    2. Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока через 0,2 мкм бутылки верхний фильтр в автоклав стеклянной бутылке и aliquot средств массовой информации в 50 мл конических трубок и хранить при 4 градусов по Цельсию до недели или при -20 градусов по Цельсию на срок до одного года.
  2. Подготовка коллагеназы фондовый раствор
    1. Подготовка 50 мг/ мл коллагеназы фондовый раствор в 1x фосфат буфера солевого раствора (PBS).
    2. Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока с фильтром 0,2 мкм и шприцем, и хранить 100 йл aliquots при -20 градусов по Цельсию.
  3. Подготовка среды сбора тканей (Buffer A)
    1. Приготовьте растворбульонаCa 2 '/Mg2' путем добавления 0,927 г дигидрата хлорида кальция (CaCl2.2H2O) и 1 г г г гептагидрата сульфата магния (MgSO4.7H2O) до 500 мл дистиллированной воды. Стерильный фильтр решения через 0,2 мкм бутылки верхний фильтр в автоклав стеклянной бутылке и хранить при комнатной температуре (RT).
    2. Дополнение Dulbecco Модифицированный Eagle Medium (DMEM) с 10% Ca2"/Mg2" решение и 2% FBS.
    3. Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока с фильтром 0,2 мкм и шприцем и хранить aliquots 5 мл при -20 градусов по Цельсию.
  4. Фибронектиновое покрытие тканевых пластин культуры
    1. Подготовка буфера покрытия (Buffer B) путем растворения 5,3 г карбоната натрия (Na2CO3; 0.1 M) в 500 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН буфера до 9,4 с использованием 1 М соляной кислоты (HCl). Фильтр под капотом потока ламинара через фильтр верхней бутылки 0,2 мкм в автоклав стеклянную бутылку и хранить на RT.
    2. Для покрытия пипетка 2 мл/5 мл/10 мл буфера B на 60 мм/100 мм/145 мм пластины культуры ткани, соответственно. Добавьте 1 мкг/см2 раствора очищенного белка плазмы человека и аккуратно распределите жидкость по пластине.
    3. Инкубационая пластина при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 20 мин.
    4. Аспират Буфер B и мыть пластину с PBS до культивирования клеток.

2. Изоляция эндотелиальных клеток из ткани пациента VM

  1. Изоляция ЕС от твердой ткани VM
    ПРИМЕЧАНИЕ: VM ткани resected путем debulkingхирургии 12,13 в соответствии с протоколом IRB утвержденных.
    1. Вымойте VM ткани (вес образца ткани обычно колеблется от 0,5 г до 1,5 г) в 5% PSG в PBS.
    2. Передача ткани в 100 мм клеточной культуры блюдо, фарш ткани образца на мелкие кусочки с помощью стерильных хирургических инструментов вскрытия, и передать в 50 мл конической трубки.
    3. Добавьте 100 л коллагеназы стокового раствора в 5 мл буфера А для окончательной концентрации 1 мг/мл, затем добавьте это в ткань и перемешайте рубленую ткань при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, встряхивая содержимое каждые 5 минут.
    4. Тщательно измельчите переваренную ткань в RT с помощью 6 мм гладкой поверхности молоть шлифовальной машины в 50 мл конической трубки.
    5. Продолжайте тщательно молоть переваренной ткани с помощью пестика при добавлении 5 мл холодного PBS дополняется 0,5% бычьего альбумин сыворотки (BSA) и 2% PSG. Повторите этот шаг четыре раза.
    6. Фильтр раствор через 100 мкм ситечко клеток в 50 мл конической трубки для удаления фрагментов тканей.
    7. Центрифуга клеточной подвески в течение 5 мин при 400 х г на RT. Продолжить шаг 2,3.
  2. Изоляция ВМ ЭК от пораженной крови, полученной в результате склеротерапии пациента
    1. Получить человека VM поражения крови от склеротерапии в соответствии с протоколом IRB утвержденных.
    2. Разбавленная пораженная кровь (объем образца обычно колеблется от 0,5 мл до 5 мл) в PBS до конечного объема 40 мл.
    3. Центрифуга клеточной подвески в течение 5 мин при 200 х г на RT.
  3. Начальное покрытие ячейки
    1. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелайте одноклеточную гранулу в 1 мл EGM.
    2. Добавьте 9 мл полного EGM на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) 100 мм пластин и семян 1 мл клеточной подвески.
    3. Инкубационные клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере 5% CO2.
    4. Каждый день удалите 2 мл мультимедиа и добавьте 2 мл стерильной фильтрованной FBS.
    5. Как только клеточные культуры достигают слияния 40-u201250% изменить средний для завершения EGM. Это обычно занимает от 2'u20123 недель для клеток, чтобы достичь этого слияния.
    6. Ежедневно наблюдайте за появлением колоний ЕС. Они могут быть признаны по их типичной "булыжник-как" морфология (рисунок 1A). В каждой выборке отображаются между 3-20125 EC-колониями.
    7. Изменение среды через день в течение еще 5'u20127 дней, пока отдельные колонии ЕС начинают касаться друг друга.
  4. Ручная изоляция отдельных колоний ЕС
    1. Чтобы собрать колонии ЕС, мыть пластину с 5 мл PBS и вручную аспирировать с серологическим пипеткой.
    2. Возьмите пластину к микроскопу и круг местах нескольких колоний ЕС с помощью маркировки перо как на крышке и дне, прежде чем вернуть его в ламинарный капюшон потока.
    3. Отсоедините колонии ЕС путем трубопроводного раствора 50 МКЛ из 0,05% трипсина-ЭДТА на отмеченных участках.
    4. Используя небольшой сотовый скребок или наконечник пипетки, аккуратно соскрепайте клетки с тарелки.
    5. Наклоните пластину до ближайшего края и промойте 1 мл EGM на отмеченную область и соберите ячейки.
    6. Подсчитайте количество ячеек с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
    7. Плита собранных колоний ЕС при плотности 1 х 104 клеток/см2 на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) клеточной культуры блюда, содержащие свежие EGM. На следующий день измените средний для завершения EGM.
    8. Изменение среды для завершения EGM через день в течение 2'u20123 недель, пока клетки не достигнут 80% слияния.
    9. Трипсинизировать EC с 2 мл предварительно разогретого 0,05% трипсина-ЭДТА на 100 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин и нейтрализовать трипсин, добавив 4 мл EGM.
    10. Соберите подвеску клетки в одну коническую трубку 15 мл и центрифугу при 400 x g в RT в течение 5 минут. Аспиратировать сверхнатантные и повторное течение клеток в 2 мл EGM.
    11. Подсчитайте количество ячеек с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Типичные числа клеток, полученных являются 1 х10 6 клеток на 60 мм пластины культуры клеток или 2 х10 6 клеток на 100 мм пластины культуры ткани.
    12. Пеллет клеток центрифугации на 400 х г на RT в течение 5 мин и аспирировать супернатант. Приступайте к шагу 3.2.1.

3. Эндотелиальный отбор клеток и расширение

  1. Подготовка противо-CD31-спряженных магнитных бусин
    1. Вихрь флакон, содержащий анти-CD31-конъюгированных магнитных бусин для 30 с. Количество необходимых бусин 8 х 106 бусин/2 х 106 клеток.
    2. Вымойте нужное количество анти-CD31-конъюгированных магнитных бусин с 1 мл раствора для мытья, содержащего 0,1% BSA в PBS в 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
    3. Поместите трубку микроцентрифуга в магнит изоляции клеток в течение 1 мин.
    4. Аспирировать супернатант и повторить шаг стирки.
  2. Эндотелиальная очистка клеток и покрытие
    1. Гранулы повторного производства клеток, полученные в 2.4.12 в 500 йл раствора для мытья, содержащего 0,1% BSA в PBS.
    2. Добавьте клеточный раствор в микроцентрифугную трубку, содержащую магнитные бусы, и тщательно будем повторно использоваться.
    3. Инкубировать в течение 20 минут при 4 градусов по Цельсию с нежным наклоном.
    4. Добавьте 500 МЛ 0,1% BSA в PBS и хорошо перемешайте.
    5. Поместите трубку на магнит изоляции клеток в течение 1 мин.
    6. Аккуратно аспирировать всю жидкость, которая содержит CD31-отрицательную долю клеток, не касаясь бисера.
    7. Вымойте шарик гранулы, содержащие CD31-положительной фракции клеток с 1 мл 0,1% BSA в PBS и повторить магнитное разделение.
    8. Повторите стирку и магнитное разделение шаг как минимум в 3 раза, чтобы очистить CD31-положительной фракции клеток.
    9. Resuspend очищенные эндотелиальные клетки в 15 мл конической трубки и спина вниз в течение 5 мин при 400 х г на RT.
    10. Удалить супернатант и повторное течение ячейки гранулы в 1 мл EGM.
    11. Добавьте 9 мл полного EGM на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) 100 мм пластин и семян 1 мл клеточной подвески. Обратите внимание, что некоторые магнитные бусины по-прежнему прикреплены к клеткам в этом первом шаге посева. Большинство бусин смываются во время расширения клеток, но небольшое количество бисера может сохраняться в ранних проходах.
    12. Инкубационные клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере 5% CO2.
    13. Изменение среды через день, пока клетки не достигнут 80% слияния(рисунок 1B).
  3. Расширение эндотелиальных клеток
    1. Как только клетки достигают 80% слияния, отсоедините с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА на 100 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
    2. Нейтрализуй трипсин, добавив 4 мл EGM и соберите клетки в одну коническую трубку 15 мл.
    3. Центрифуга при 400 x g в RT в течение 5 мин.
    4. Аспирировать сверхнатантные, повторное течение клеток в 2 мл EGM, и подсчитать количество клеток с гемоцитометром или автоматизированного подсчета клеток.
    5. Семенные клетки с плотностью 1 х 104 клетки/см2 в 145 мм фибронектин покрытием (1 мкг/см2) пластины культуры ткани.
    6. Продолжайте прохождение ячеек до тех пор, пока не будет выполнен желаемый номер ячейки. Учти, что в культуре ткани диаметром 145 мм содержится около 8-20129 х 106 клеток, а количество необходимых клеток составляет 2,5 х 106 клеток на инъекцию. Только клетки между проходом 3 и 8 должны быть рассмотрены для ксенотрансплантата.

4. Протокол ксенотрансплантата, полученный пациентом VM

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы используем 5'u20126 неделю, мужской иммунодефицит, athymic обнаженной Foxn1ню мышей.

Все процедуры для животных должны быть одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC).

  1. Подготовка материалов за день до инъекции
    1. Предварительно холод шприцы, иглы, и пипетки советы в -20 градусов по Цельсию морозильник на ночь.
    2. Медленно оттаивать мембрану подвала внеклеточной матрицы (BMEM) на ночь на ведро со льдом размещены при 4 градусов по Цельсию, чтобы избежать повышенной вязкости геля.
  2. Подготовка клеточной суспензии к инъекциям
    1. Трипсинизировать EC с 5 мл предварительно разогретого 0,05% трипсина-ЭДТА на 145 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
    2. Нейтрализуй трипсин, добавив 5 мл EGM и соберите клетки в одну коническую трубку 15 мл.
    3. Центрифуга при 400 x g в RT в течение 5 мин.
    4. Аспирировать сверхнатантные, повторно использовать клетки в 3 мл EGM, и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированной счетчика клеток.
    5. Определите общее количество клеток, необходимых для всех запланированных инъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое количество клеток составляет 2,5 х 106 клеток на инъекцию. В общей сложности 2 инъекции, как правило, выполняются в каждой мыши для технических дубликатов. Необходимо рассчитать 10% превышение количества клеток, чтобы учесть потери при передаче в шприц.
    6. Перенесите объем, содержащий расчетный номер клетки, в новую коническую трубку 50 мл и гранулированные клетки путем центрифугации при 400 x g в RT в течение 5 минут.
    7. Аспирировать супернатант, оставляя небольшой объем (около 50'u201270 L), чтобы ослабить гранулы.
  3. Подготовка шприца
    1. Рассчитайте избыточный объем в 20 йл/инъекцию с учетом потерь при переводе в шприц. Повторное использование клеточной гранулы с 220 МЛ БМЭМ на инъекцию на льду. Инъекционный объем клеточной суспензии будет 200 МКЛ за поражение.
    2. Смешайте подвеску клетки тщательно на льду, чтобы получить однородную подвеску клетки и избежать создания пузырьков.
    3. Используя 1 мл пипетки и 1 мл шприца, одновременно трубят BMEM-клеточной смеси в шприц открытия всасывающей силой, потянув поршень шприца.
    4. Luer блокировки 26G х 5/8 дюйма стерильной иглы к шприцу и держать подготовленные шприцы плашмя на льду до инъекции.
  4. Подкожная инъекция в мышь
    1. Обезболить мышей с 5% изофлюран / кислородной смеси со скоростью потока 1 л / мин с помощью изофлюран испарителя. Обеспечить надлежащее сеяние животных (например, безответственность на щипать щипец). Поддерживайте анестезию через непрерывное администрирование 1,5% изофлюран/кислород, поставляемый через носовой конус.
    2. Поместите мышей на живот, подвергая задней области, где прививки будет происходить и дезинфицировать область инъекций с 70% этанола.
    3. Аккуратно свернуть подготовленный шприц, чтобы повторно использовать любые урегулированные клетки. Флик пузыри иглы конце шприца и изгнать небольшой объем клеточной подвески для обеспечения удаления всех пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две инъекции могут быть выполнены для каждой мыши - на левой и правой стороне мыши назад.
    4. Pinch и создать "палатка-как" структура с помощью большого пальца и указательного пальца и вставить иглу подкожно прямо под кожей. Убедитесь, что игла только глубокой кожи, выпустив ущипнул кожи для предотвращения инъекций в мышечную ткань.
    5. Держа иглу под углом 45 градусов, тщательно ввишайте 200 мкл клеточной подвески, чтобы создать небольшую сферическую массу(рисунок 1С).
    6. Запись веса мыши с шкалой, ухо теги мыши, и вернуться в клетку.
    7. Мониторинг мышей после сеяния, чтобы убедиться, что они возвращаются к нормальной деятельности.
  5. Мониторинг роста поражений
    1. Используя калипер, измерьте длину и ширину каждой вилки(рисунок 1D).
    2. Замеры документов через день вплоть до сбора поражений.

5. Сбор и обработка тканей

  1. Euthanize мышей 9 дней после имплантации в камере CO2 и проверить жизненно важные признаки, чтобы подтвердить смерть. Выполните вывих шейки матки на мышах в качестве вторичного метода усыпляния мыши.
  2. Урожай ксенотрансплантата поражения / штепсельной вилки с фланга мыши путем вскрытия с помощью хирургических типсов и ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы предотвратить разрыв заполненных кровью сосудов в штепсельной вилке, важно, чтобы избежать прикосновения к вилке поражения с инструментами вскрытия и оставить чрезмерно окружающие ткани, такие как кожа прилагается к вилке.
  3. Погрузите повторное поражение в PBS для мытья.
  4. Настройка камеры сцены с камерой. Выравнивание штепсельной вилки на разделольную доску с линейкой. Возьмите изображение всех пробок для записи валовой васкулярности поражений (Рисунок 1E).
  5. Исправить пробки, погружаясь в 10% формалин ночь на RT.
  6. Вымойте пробки в PBS на следующий день и переместить их в 70% этанола.
  7. Процесс поражения пробки для встраивания парафина (патологическое ядро).

6. Раздел поражения

  1. Используйте микротом, чтобы вырезать 5 мкм разделов из собранных поражений мурина на положительно заряженных слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего анализа, разделы в центре штепсельной вилки (около 50'u201270 мкм в ткани) имеют важное значение.
  2. Растопить парафин при 60 градусах Цельсия за 1 ч до окрашивания.
  3. Де-парафинизировать и повторно гидратировать ткани последовательно под капотом потока химического дыма. Таким образом, инкубировать слайд в ксилен в течение 10 мин, 100% этанола (EtOH) в течение 5 мин, 90% EtOH в течение 3 мин, и 80% EtOH в течение 3 мин.
  4. Промыть горку в дейонизированной воде в течение 5 минут.

7. Гематоксилин и эозин (Н И Е)

  1. Инкубационые секции в гематоксилине в течение 2 мин.
  2. Поместите слайды в окрашивание банку и промыть в раковине устойчивый поток водопроводной воды, пока вода не будет ясной.
  3. Де-гидрат слайды путем инкубации тканей последовательно в 70% EtOH в течение 1 мин, 80% EtOH в течение 1 мин, 90% EtOH в течение 1 мин, 100% EtOH в течение 1 мин, и свежие 100% EtOH в течение 1 мин.
  4. Пятна разделов в Eosin Y для 30 с.
  5. Промыть свежим 100% EtOH, пока решение не будет ясным.
  6. Инкубационный слайд в ксиленах в течение 2 мин. Пусть слайды сухие в течение 5'u201210 мин под капотом дыма.
  7. Обойтись капли постоянных, не-aqueous монтажа среды над ксенотрансплантами разделов и место coverslip на вершине.
  8. Разрешить слайды высохнуть на ночь перед изображением.

8. Иммуногистохимия

  1. Подготовка антигена поиска буфера (Tris-EDTA) путем взвешивания 0,6 г Tris-базы и 1 мл 0,5 М EDTA до 500 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 9.0 с помощью 1 M HCl. Добавьте 250 МКЛ Tween-20.
  2. Инкубировать де-парафинизированные слайды тканей (как получено в шаге 6.2'u20126.3) в стакане с буфером поиска антигена, помешивая на нагревательном блоке, в течение 20 минут при 95 градусов по Цельсию.
  3. Снимите стакан с нагревательного блока, дайте раствору остыть до 35 градусов по Цельсию, затем промойте в PBS в течение 3 минут.
  4. Блок тканей разделов в 5% нормальной сыворотки лошади в PBS в течение 30 минут на RT.
  5. Подготовка биотинилированных Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) рабочий раствор путем разбавления 20 мкг / мл биотинилированных UEA-I в 5% нормальной сыворотки лошади в PBS.
  6. Pipet 50'u2012100 ЗЛ рабочего решения UEA-I на секцию и инкубировать в течение 1 ч на RT в увлажняющей камере.
  7. Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
  8. Утолить слайд разделы в 3% перекиси водорода в течение 5 мин на RT.
  9. Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
  10. Приготовьте 5 мкг/мл стрептавидина хрена пероксидаса, конъюгированных в 5% нормальной конной сыворотки в PBS.
  11. Pipet 50'u2012100 L на каждой ткани слайд и инкубировать в течение 1 ч на RT в увлажняющей камере.
  12. Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
  13. Приготовьте решение 3,3'Diaminobenzidine (DAB) в соответствии с инструкциями производителя и добавьте 50-2012100 йл на секцию.
  14. Инкубационые секции в течение 10-201215 мин, проверка и мониторинг развития пятен каждые 2'u20125 мин.
  15. Вымойте слайды три раза в PBS в течение 3 минут.
  16. Добавить каплю гематоксилина и инкубировать в течение 3 мин.
  17. Поместите слайды в окрашивание банку и промыть в раковине устойчивый поток водопроводной воды, пока вода не будет ясной.
  18. Последовательно инкубировать слайд в 80% EtOH в течение 1 мин, 90% EtOH в течение 1 мин, 100% EtOH в течение 1 мин, и ксилена в течение 2 мин.
  19. Пусть слайды сухие в течение 5'u201210 мин под капотом дыма.
  20. Обойтись капли постоянных, не-aqueous монтажа среды над ксенотрансплантами разделов и место coverslip на вершине.
  21. Разрешить слайды высохнуть на ночь перед изображением.

9. Анализ сосудистых каналов, полученных человеком

ПРИМЕЧАНИЕ: Васкулярность поражений ВМ количественно измеряется путем измерения сосудистой области и плотности сосудов. Только UEA-I положительные, полученные человеком сосудистые каналы рассматриваются для количественной оценки.

  1. Сделай от четырех до пяти изображений на секцию поражения с ярким полевым микроскопом при увеличении в 20 раз (поля высокой мощности (HPF). Возьмите HPF изображения в X-самолет шаблон в разделе поражения, чтобы избежать перекрытия(рисунок 1F-H). Включите планку масштаба на сделанных снимках.
  2. Откройте изображения HPF в изображении J Open(Файл Калибруйте пиксели бара масштаба следующим образом. Используйте инструмент прямой линии и перейдите планку масштаба. Чтобы преобразовать измеренные пиксели в мм, Set scaleнажмите на Analyze
  3. Нажмите на анализ и установите измерения и выберите область и добавьте к наложению.
  4. Измерьте общую площадь поля в HPF с помощью анализа. Сохраните это измерение для количественной оценки в шаге 9.8.
  5. Используя инструмент для выбора от руки, вручную наметите UEA-Iи сосудистые каналы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистый канал определяется как любая область,+ которая выровнена с UEA-I - EC, которые могут содержать клетки крови.
  6. Нажмите на анализ и меру количественной оценки изложенной области UEA-I и сосудистой области(мм 2/ HPF).+
  7. Повторите это измерение для всех пяти HPF, принятых в пределах одной вилки.
  8. Средняя общая площадь сосудов всех пяти HPF. Полученная сосудистая область на HPF впоследствии делится на область поля HPF(в мм 2, шаг 9.5) и выражается в процентах (%).
  9. Для количественной оценки плотности сосудов подсчитайте количество принятых UEA-I+ и сосудистых каналов каждого взятого HPF. Плотность сосудов – это среднее количество+ сосудистых каналов UEA-I, подсчитанных в области HPF (сосуды/мм2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает процесс генерации мурин ксенотрансплантата модели VM на основе подкожной инъекции пациента полученных EC в спину иммунодефицитных обнаженных мышей. Эндотелиальные клеточные колонии могут быть собраны в течение 4 недель после первоначальной изоляции клеток от ткани VM или пораженной крови(рисунок 1A,B). На следующий день после инъекции, ксенотрансплантат поражения штепсельная вилка охватывает площадь поверхности около 80'u2012100 мм2. В наших руках, поражения пробки с TI...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем метод создания ксенотрансплантатной модели VM, полученной пациентом. Эта модель murine представляет отличную систему, которая позволяет исследователям получить более глубокое понимание расширения патологического люмена и будет играть важную роль в разработке более эффективных и целенаправленных методов лечения ВМ. Это может быть легко адаптирована для исследования других типов сосудистых аномалий, таких как капиллярная лимфатическая венозная мальформация16. Есть несколько шагов,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов для раскрытия информации.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Нора озер для корректирования. Исследования, о них сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом сердца, легких и крови под номером R01 HL117952 (E.B.), в составе Национальных институтов здравоохранения. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Атимические обнаженные мыши, (Foxn1-nu); 5-6 недель, самцыEnvigo069(nu)/070(nu/+)Подкожное введение
Биотинилированный Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)Vector LaboratoriesB-1065Гистологический анлайз
Бутылочный фильтр (500 мл; 0,2 &; M)Thermo Fisher974106Клеточная культура
Альбумин сыворотки крупного рогатого скота (BSA)BSAA7906-50MGКлеточная культура; Гистологический анализ
Дигидрат хлорида кальция (CaCl2.2H2O)SigmaC7902-500GКлеточная культура
КалиперЭлектронная микроскопияНауки 50996491Измерение пробки поражения
CD31-сопряженные магнитные шарики (Dynabeads)Life Technologies11155DEC сепарация
Клеточный фильтр (100 μ M)Greiner542000Клеточная культура
коллагеназа ARoche10103578001Клеточная культура
Коническая трубка; полипропилен (15 мл)Greiner07 000 241Коническая трубка для клеточной культуры
; полипропилен (50 мл)Greiner07 000 239Клеточная культура
Банка для окрашивания коплинаTed Pella21029Гистологический анлайз
Покровное стекло (50 X 22 мм)Fisher Scientific12545EГистологический анлайз
DAB: 3,3'Диаминобензидиновый реагент (ImmPACT DAB)Vector LaboratoriesSK-4105Гистологический анлайз
Модификация Дульбекко орлиной среды (DMEM)Corning10-027-CVКлеточная культура
DynaMag-2Life Technologies12321DEC разделение
Ушной проколVWR10806-286Подкожное введение
ЭДТА (0,5М, pH 8,0)Life Technologies15575-020Гистологический анлайз
Среда для роста эндотелиальных клеток-2 (EGM2) Bulletkit (базальная среда и добавки)LonzaCC-3162Клеточная культура
Eosin Y (на спиртовой основе)Thermo Scientific71211Гистологический анлайз
EthanolDecon Labs2716Гистологический анлайз
фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), HyCloneGE HealthcareSH30910.03клеточных культур
1,250 μ LMidSciAV1250-HМногоступенчатый
фильтрующий наконечник 20 μ LVWR10017-064Многоступенчатый
фильтрующий наконечник 200 LVWR10017-068Многоступенчатый
буферный раствор формалина (10%)SigmaF04586Гемацитометр для диссекции пробки поражения
(INCYTO; Одноразовый)SKC FILMSDHCN015Клеточная культура
ГематоксилинВектор ГематоксилинH-3401Гистологический анлайз
Фибронектин очищенный белок плазмы человека (1 мг/мл)SigmaFC010-10MGКлеточная культура
Раствор перекиси водорода (30% по мас.)SigmaH1009Гистологический анлайзис
ImageJ Программное обеспечениеАнализ
Изофлуран, USPAkorn Animal Health59399-106-01Подкожное введение
сульфата магния гептагидрат (MgSO4.7H2O)SigmaM1880-500G
Матрица базальной мембраны для клеточной культуры (фенол без красного; LDEV-free)Corning356237Подкожная инъекция
Микроцентрифужная трубка (1,5 мл)VWR87003-294EC разделительный
микроскоп Предметное стекло Superfrost (75 мм x 25 мм)Fisher Scientific1255015-CSИглы для гистологического анлайза,
26G x 5/8 дюйма Sub-Q стерильные иглыBecton Dickinson (BD)BD305115Подкожная инъекция
Нормальная Сыворотка для лошадейVector LaboratoriesS-2000Гистологический анлайз
Пенициллин-Стрептомицин-L-Глютамин (100X)Corning30-009-CIКлеточная культура
Постоянная среда для монтажа (VectaMount)Vector LaboratoriesH-5000Гистологический анлайз
Пестик Размер C, PlainThomas Scientific3431F55EC изоляция
Фосфат Buffered Физиологический раствор (PBS)Весыклеточных культурScientific BP3994
VWR65500-202
Серологические пипетки для подкожного введения (10 мл)VWR89130-898
Серологические пипетки для клеточных культур (5 мл)VWR89130-896Клеточная культура
карбонат натрия (Na2CO3)Sigma223530Клеточная культура
Стрептавидин, пероксидаза хрена, концентрат, для IHCVector LaboratoriesSA-5004Шприц для клеточной культуры
(60 мл)BD Biosciences309653Cel культура
ШПРИЦ ФИЛЬТР (0,2 &; M)Шприцы дляклеточных культурCorning 431219
(1 мл с замком Люэра)Becton Dickinson (BD)BD-309628подкожного введения
обработкой культуры тканей (100 X 20 мм)Greiner664160Пластина
для обработки культуры клеток (145X20 мм)Greiner639160Пластины
, обработанные культурой тканей для клеточной культуры (60 X 15) ммEppendorf30701119Клеточная культура
Трис-основание (основание Тризмы)SigmaT6066Гистологический анлайзис
Трипановый синий раствор (0.4 %)Life Technologies15250061Клеточная культура
Трипсин ЭДТА, 1X (0.05% Трипсин/0.53mM ЭДТА)Corning25-052-ClКлеточная культура
Tween-20Biorad170-6531Гистологический анлайз
Уитон флаконVWR16159-798Клеточная культура
КсилолыFisher ScientificX3P-1GALГистологический анлайз
Фильтрующий наконечник для для Fisher Пластина для с

Ссылки

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889(2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель венозных мальформацийизоляция эндотелиальных клетокмутация TIE2мутация PIK3CAиммунодефицитные мышиподкожная инъекциягистологический анализокрашивание UEA-1количественный анализ сосудистых каналов
Пациент-производные Ксенотрансплантат Модель для венозной мальформации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.