Прогнозирование ампутации с использованием местных циркулирующих моноядерных клеток-предшественников в ангиопластике пациентов с критической ишемией конечностей

Периферические артериальные заболевания (ПАД) характеризуются хронической и прогрессирующей сосудистой обструкцией с ограничением кровоснабжения^1. В глобальном масштабе, PAD нижних конечностей затрагивает около 10% пожилого населения, в то время как до 7% таких случаев представлены^{ампутации конечностей 2,3}.

Критическая ишемия конечностей (CLI) представляет собой наиболее серьезную презентацию PAD¹. Пациенты обычно испытывают боль в покое, язвы, или гангрена связано с окклюденых артерий; в то время как клинический прогноз неблагоприятный и характеризуется 30% риск ампутации конечностей и смертности в течение^{1 года 3,4,5}.

Ангиопластика является минимально инвазивной эндоваскулярной процедурой, которая может восстановить приток крови к нижней конечности у пациентов с КЛИ; однако, некоторые пациенты неизбежно потребуется серьезная ампутация конечностей, даже после ангиопластики^1,5. Раннее выявление неблагоприятных исходов после ангиопластики является весьма ценным, в связи с возможностью терапии органов.

Традиционные факторы риска могут обеспечить ограниченную прогностический способность для серьезной ампутации конечностей у пациентов с CLI, проходящих ангиопластику^6. Патофизиологически-ориентированные биомаркеры представляют собой новые методы с потенциальными клиническими применениями, которые могут привести к особенно полезным при заболеваниях, связанных с сосудистой^{травмой 7.} В настоящее время участие сотовых популяций, владеющих эндотелиальными ремонтными свойствами, на месте атеросклеротической бляшки, все^{чаще признается 8,9.}

Моноядерные клетки-предшественники (MPC) получены из костного мозга и имеют структурные и функциональные характеристики стволовых клеток с сосудистыми регенеративными способностями. Из-за способности MPC размножаться, мигрировать и проявлять сосудистую приверженность; эти клетки стали хорошими кандидатами, чтобы отразить эндотелиальный ремонт в ответ на^{ишемию 10,11,12}. Кроме того, непрерывный интерес к механизмам, лежащим в основе сосудистой травмы побудило изучения прогностический роль местных происходящих биомаркеров, так как они считаются отражением повреждения^{сосудов и ремонт 7,13,14}.

Цель настоящего исследования заключается в том, чтобы описать, как определить количество МПЦ, которые циркулируют близко к сосудистой обструкции у пациентов с КЛИ, проходящих ангиопластику; и как оценить связь между МПЦ с показателями эндотелиальной дисфункции и ампутации конечностей.

По сравнению с прогнозом, основанным на сопутствующих заболеваниях и внутренних сосудистых особенностях, количество местных МЦК показывает специфическую способность прогнозировать клинический исход в отношении эндотелиальной дисфункции и ампутации конечностей. Последовательно, некоторые исследования описали прогностический роль аналогичных биомаркеров во время оценки пациентов с PAD^15,16.

На основе^{предыдущих результатов 7}, метод, описанный здесь может быть полезным для раннего выявления населения с риском неблагоприятных сосудистых исходов в нескольких клинических условиях, таких как нижние конечности и ишемической ишемии, инсульт, васкулит, венозный тромбоз и другие, связанные с сосудистой травмы и ремонта.

Институциональный комитет по этике исследований из Национального центра "20 де Новиембре" ISSSTE одобрил этот перспективный протокол, все зачисленные пациенты предоставили письменное информированное согласие.

1. Оценка сосудистого блока нижних конечностей, взятия проб крови и ангиопластики воздушного шара

ПРИМЕЧАНИЕ: Образец исследования, используемый для этого эксперимента, состоял из 20 больных сахарным диабетом, в возрасте 68 лет и 10 из 20 были мужчинами. Половина выборки были курильщики и наиболее распространенными со-заболеваемости были типа 2 сахарный диабет, системная артериальная гипертензия и / или дислипидемия. Выборка должна была быть стандартизирована для возрастных, половых и со-заболеваемости. Нельзя исключать возможную предвзятость из-за клиническо-демографического влияния на отношения между МПЦ и КЛИ.

1. Оцените клиническую тяжесть ишемии конечностей в соответствии с классификацией^{Резерфорда 13} (см. Дополнительную таблицу 1).
2. Выполните ангиографию нижних конечностей, отбор проб крови и ангиопластику воздушного шара.
   1. Перед операцией используйте антикоагулянтные и анестетические препараты.
   2. Поместите 18 G иглы в кровеносный сосуд на пах сайте выбраны.
   3. Поместите введение и заранее гибкий направляющий провод. Затем, первоначальное руководство дополнительно изменено для 6 Fr введение.
   4. Используйте периодические инъекции контрастных средств массовой информации или CO_{2 под} флюоскопическим руководством для определения траектории артерий и заблокированных сосудистых участков(рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте контрастные средства массовой информации 40 см, разбавленные 1:1 в 0,9%_{солевого раствора, или} CO 2 при 10-20 мл за выстрел под давлением 12 пси.
   5. Введайте два провода навигационного гида 0.014 Fr и два провода поддержки 0.014 Fr в судно и передайте их к заблокированной площадке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Два 0.014 Fr направляющий провод (260 см в длину) используются для навигации и два 0.014 Fr направляющий провод (260 см в длину) используются для поддержки, во время одной процедуры.
   6. Ввеми 5 о. и 3 катетера Fr последовательно и соберите 10 мл крови из ближайшего участка к сосудистой обструкции. Поддерживайте образцы крови на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры катетеров могут быть 5 Fr и 3 Fr, и они изменены во время процедуры.
   7. Заранее направляющий провод снова. Затем ввести катетер ангиопластики шар, который содержит надувной шар, расположенный в конце катетера. Заранее катетер ангиопластики шар и поместите воздушный шар прямо в месте поражения. Выполните ангиопластику, надувая воздушный шар против блокирующего налета, расположенного на сосудистой стенке. Проверить восстановление кровотока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: стент может быть помещен в заблокированной области, чтобы помочь сохранить артерию открытой после процедуры.
   8. Ввести катетер и заранее до ближайшего участка к сосудистому блоку. Соберите 10 мл крови с интервалом в 30 минут после ангиопластики. Поддерживайте образцы крови на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор образцов крови до и после ангиопластики рекомендуется для дальнейшей оценки влияния ангиопластики на количество МПЦ.
   9. Удалите все провода под флюоскопическим руководством.
   10. Обеспечить послеоперационные процедуры ухода, в том числе антикоагуляционной терапии с использованием эноксапарина на 1 мг/кг подкожной каждые 12 ч, аспирин 100 мг, статинов и анальгезии. Сжатие в месте прокола сосудов в течение 24 ч.

2. Количественная оценка циркулирующих моноядерных клеток-предшественников (MPCs)(рисунок 2)

1. В свежую коническую трубку 15 мл, перенесите 6 мл собранной крови и разбавьте 1:1 (v/v) с PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обработать кровь в течение 1 ч от сбора.
2. Подготовка к разделению градиента плотности, добавив 2 мл градиентной среды плотности до 3 пробирок каждый. Затем добавьте 3 равного объема aliquots разбавленной крови в каждой пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать три четверти максимальной емкости пробирки.
3. Центрифуга при 1800 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите слой интерфейса, присутствующий в качестве кольца с помощью пипетки, и перенесите в новую трубку. Добавить 2 мл PBS и спина при 1800 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию. Сохранить гранулы, как это будет содержать MPCs.
4. Вымойте гранулы, содержащие MPCs с PBS центрифугации, как описано в шаге 2.3. Используйте свежие PBS для каждого мытья и спина при 1800 х г в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию. Повторите процесс в течение 6 раз.
5. После последней стирки используйте 1 мл PBS для повторного использования клеточных гранул. Разбавить 20 МКЛ клеточной подвески с 20 МКЛ 0,4% трипан синий, 1:1 (v/v). Используйте 10 МКЛ этой клеточной подвески для подсчета клеток с помощью гемоцитометра и светового микроскопа.
6. Aliquot 1 x 10⁶ MPCs в ранее обозначенных 5 мл потока цитометрии труб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка соответствующих изотип-соответствующих антител контроля.
7. Центрифуга труб при 1800 х г в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Аспирировать и отказаться от супернатанта.
8. Разбавить первичное антитело в 100 МКЛ раствора инкубации антитела «1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%» и добавить в трубку. Повторное течение 10 с и инкубации в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию, в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации первичных антител, используемых в настоящем протоколе были CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Протокол может быть остановлен на этом этапе путем фиксации лимфоцитов в 4% параформальдегида в PBS и хранения образцов до 24 ч при 4 градусов по Цельсию.
9. Центрифуга при 1800 х г в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант. Resuspend в 500 МКЛ 1x PBS, рН 7,4, EDTA 2 мМ.
10. Выполните анализ цитометрии потока.
    1. Навеять фон с изотипом-соответствует контрольных антител. Затем на участке FSC/SSC выберите распространение лимфоцитов, пытаясь исключить клеточный мусор, остаточные гранулоциты и другие частицы. Такое распределение считается 100%.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфоциты обычно распространяются в левом нижнем левом регионе участка.
    2. Используйте ворота с общим иммунофенотипом, содержащим большое количество клеток CD45 и^CD34. Затем выберите для двойного положительного иммунофенотипа, используя^{ворота,}которые ранее идентифицировали CD45^,CD34 , и добавляя либо KDR (VEGFR-2), CD133^илиCD184 . Определите субпопуляции MPC по их специфическим маркерам поверхности клеток. Отчет в процентах от закрытых событий.
11. Определить основные субпопуляции МПЦ. В настоящем исследовании проанализированы иммунофенотипы:^CD45и CD34, CD133; CD45^-CD34^-CD184; CD45^-CD34^-CD133^-CD184 ; CD45^иCD34-^KDR; CD45- CD34^-KDR - CD133 - и CD45 , CD34^-KDR^-CD184^7,17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти маркеры поверхности клеток были использованы для исследования: CD45 (лимфоциты), CD34 (эндотелиальные и/или сосудистые клетки), KDR (VEGFR-2) (мембранный маркер эндотелиальных клеток), CD133 (эндотелиальные клетки-предшественники) и CD184 (гематопоэтические стволовые клетки и эндотелиальные клетки).

3. Отношение МПЦ с модификацией эндотелиальной функции и гемодинамическим испытанием (FMD)

1. Определите расширение опосредованного потока (FMD), пред- и постангиопластику.
   1. Используйте сосудистый линейный предудер для измерения диаметра брахиальной артерии.
   2. Поместите манжету сфигмоманомометра над местом измерения в предплечье и инуффлат на 50 мм рт. ст. выше систолического артериального давления в течение 5 мин и сдуть.
   3. Определите еще раз диаметр брахиальной артерии в течение следующих 60 с. Используйте уравнение ниже для оценки FMD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте степень дилатации с помощью уравнения (%) (максимальный диаметр после преходящей ишемии - базального диаметра) × 100 / базальный диаметр.
2. Соотносить количество МПЦ с базовым значением FMD и дельтой FMD после ангиопластики.

4. Прогностические способности MPCs для ампутации конечностей

1. Расписание периодических медицинских назначений после ангиопластики воздушного шара и выписки пациента, чтобы оценить качество притока крови к нижней конечности.
2. Оцените клиническую тяжесть ишемии конечностей через 2 недели после ангиопластики. Оцените разрешение боли в отдыхе, нижнюю ишемию и сохранение функциональной стопы, согласно классификации Резерфорда¹³.
3. Сравните клиническую тяжесть ишемии конечностей, на базовом уровне по сравнению с последующей деятельности. Определите те случаи, которые требуют серьезной ампутации из-за неблагоприятного исхода.
4. Соотносить количество МПЦ с долей пациентов, нуждающихся в серьезной ампутации нижней конечности.

Образцы крови из заблокированных артерий, на сайте, адресованном для ангиопластики, были собраны из 20 больных сахарным диабетом, в возрасте 68 лет и 10 из 20 были мужчины. Половина выборочных групп населения были курильщиками. Сосудистые поражения были в основном забил, как Резерфорд класса VI; в то время как пациенты показали более высокую распространенность сахарного диабета 2 типа (100%), гипертонии (70%) дислипидемия (55%).

30 дней клинического последующего после нижней конечности ангиопластика была проведена. Процент субпопуляций MPC на базовом уровне или динамике после ангиопластики коррелировал (анализ Спирмана) со степенью эндотелиальной дисфункции, оцениваемой FMD; и базовое число MPCs были сравнены между пациентами, проходящими, или нет, ампутации конечностей после ангиопластики (U-Mann Уитни). Исследование показало, что базовая субпопуляция МПЦCD45- CD34-KDR- отрицательно коррелирует с FMD (рисунок3A, слева), в то время как изменение МПЦ CD45и CD34 , CD133иCD184после ангиопластики значительно коррелирует с улучшением FMD(рисунок 3B, справа). Кроме того, у пациентов, которые эволюционировали доампутации конечностей, наблюдалось увеличение базового числа субпопуляцииМПЦCD45, CD34 иKDR (рисунок 4A,B, слева); а также после ангиопластики сокращение субпопуляции МПЦCD45и CD34,CD133иCD184 (Рисунок 4A,C, справа).

Рисунок 1: Ангиография нижних конечностей и сбор крови. (A)Сосудистая траектория, о чем свидетельствуют контрастные средства массовой информации при флюороскопии. (B)Сосудистая обструкция перед ангиопластикой. (C)Сосудистая обструкция после ангиопластики. (D)Сосудистый хирург использует катетер для сбора крови из ближайшего места к сосудистой обструкции и атеромы налет, и исследователь лаборатории готов получить образец крови. Стрелки указывают на место сосудистых препятствий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Подготовка образца крови и определение моноядерных клеток-предшественников (MPCs). (A)Подготовка градиента плотности. (B)Лимфоциты кольцо разделения после центрифугации крови. (C)Сбор фазы лимфоцитов. (D)Центрифугация. (E)Образование пеллет в нижней части пробирки. (F)Количество подвесок ячейки. (G)Подготовка лимфоцитов к цитометрии потока. (H)Определение подпопуляций клеток по цитометрии потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Отношение МПЦ с гемодинамическими показателями. (A)Позиция ультразвука для получения FMD и репрезентативных результатов. (B) Связь между базовыми субпопуляциями %MPCs (слева, CD45и CD34-KDR ; справа, CD45 и CD34 - CD133-CD184) и базовыми значениями FMD; а также отношение (C )%MPCsпосле ангиопластики с улучшением FMD после ангиопластики. Аббревиатуры: MPCs, Моноядерные клетки-предшественники; FMD, Поток Опосредованное Расширение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: MPCs и прогноз ампутации нижних конечностей после ангиопластики. (A)Репрезентативные цитометрические изображения субпопуляций MPCs. (B) Ассоциация базовых субпопуляций %MPCs (слева, CD45- CD34-KDR ) ; справа, CD45- CD34- CD133 - CD184 ) или ( C )%MPCsпосле ангиопластики, с ампутацией нижних конечностей после ангиопластики, в течение 30 дней. Аббревиатуры: MPCs, Моноядерные клетки-предшественники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Резерфорд классификации тяжести ишемии конечностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторов нечего раскрывать.