Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прогнозирование ампутации с использованием местных циркулирующих моноядерных клеток-предшественников в ангиопластике пациентов с критической ишемией конечностей

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61503

⸱

22 сентября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory, Clinical Research Department, Division of Biomedical Research, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE, 2Vascular Surgery and Angiology Department, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE, 3Regenerative Medicine and Tissue Engineering Laboratory; Coordination of Research, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE

В этой статье

Краткое содержание

Ампутация нижних конечностей может произойти даже после ангиопластики затрудненных сосудов при критической ишемии конечностей (CLI). Моноядерные клетки-предшественники (MPCs) отражают сосудистый ремонт. В настоящем протоколе описывается количественная оценка МПЦ из циркуляции, близкой к ангиопластике, и его связь с эндотелиальной дисфункцией и прогнозированием ампутации нижних конечностей.

Аннотация

Критическая ишемия конечностей (CLI) представляет собой передовую стадию периферического артериального заболевания. Ангиопластика улучшает приток крови к нижней конечности; однако, некоторые пациенты необратимо прогресс к ампутации конечностей. Степень повреждения сосудов и механизмы сосудистого ремонта являются факторами, влияющими на результат постангиопластики. Моноядерные клетки-предшественники (MPC) реагируют на повреждения и ремонт сосудов, с способностью отражать сосудистые заболевания. Настоящий протокол описывает количественную оценку МПЦ, полученных из кровообращения из сосуда вблизи места ангиопластики, а также его связь с эндотелиальной дисфункцией и его прогностический способность к ампутации конечностей в ближайшие 30 дней после ангиопластики у пациентов с CLI.

Введение

Периферические артериальные заболевания (ПАД) характеризуются хронической и прогрессирующей сосудистой обструкцией с ограничением кровоснабжения1. В глобальном масштабе, PAD нижних конечностей затрагивает около 10% пожилого населения, в то время как до 7% таких случаев представленыампутации конечностей 2,3.

Критическая ишемия конечностей (CLI) представляет собой наиболее серьезную презентацию PAD1. Пациенты обычно испытывают боль в покое, язвы, или гангрена связано с окклюденых артерий; в то время как клинический прогноз неблагоприятный и характеризуется 30% риск ампутации конечностей и смертности в течение1 года 3,4,5.

Ангиопластика является минимально инвазивной эндоваскулярной процедурой, которая может восстановить приток крови к нижней конечности у пациентов с КЛИ; однако, некоторые пациенты неизбежно потребуется серьезная ампутация конечностей, даже после ангиопластики1,5. Раннее выявление неблагоприятных исходов после ангиопластики является весьма ценным, в связи с возможностью терапии органов.

Традиционные факторы риска могут обеспечить ограниченную прогностический способность для серьезной ампутации конечностей у пациентов с CLI, проходящих ангиопластику6. Патофизиологически-ориентированные биомаркеры представляют собой новые методы с потенциальными клиническими применениями, которые могут привести к особенно полезным при заболеваниях, связанных с сосудистойтравмой 7. В настоящее время участие сотовых популяций, владеющих эндотелиальными ремонтными свойствами, на месте атеросклеротической бляшки, всечаще признается 8,9.

Моноядерные клетки-предшественники (MPC) получены из костного мозга и имеют структурные и функциональные характеристики стволовых клеток с сосудистыми регенеративными способностями. Из-за способности MPC размножаться, мигрировать и проявлять сосудистую приверженность; эти клетки стали хорошими кандидатами, чтобы отразить эндотелиальный ремонт в ответ наишемию 10,11,12. Кроме того, непрерывный интерес к механизмам, лежащим в основе сосудистой травмы побудило изучения прогностический роль местных происходящих биомаркеров, так как они считаются отражением повреждениясосудов и ремонт 7,13,14.

Цель настоящего исследования заключается в том, чтобы описать, как определить количество МПЦ, которые циркулируют близко к сосудистой обструкции у пациентов с КЛИ, проходящих ангиопластику; и как оценить связь между МПЦ с показателями эндотелиальной дисфункции и ампутации конечностей.

По сравнению с прогнозом, основанным на сопутствующих заболеваниях и внутренних сосудистых особенностях, количество местных МЦК показывает специфическую способность прогнозировать клинический исход в отношении эндотелиальной дисфункции и ампутации конечностей. Последовательно, некоторые исследования описали прогностический роль аналогичных биомаркеров во время оценки пациентов с PAD15,16.

На основепредыдущих результатов 7, метод, описанный здесь может быть полезным для раннего выявления населения с риском неблагоприятных сосудистых исходов в нескольких клинических условиях, таких как нижние конечности и ишемической ишемии, инсульт, васкулит, венозный тромбоз и другие, связанные с сосудистой травмы и ремонта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Институциональный комитет по этике исследований из Национального центра "20 де Новиембре" ISSSTE одобрил этот перспективный протокол, все зачисленные пациенты предоставили письменное информированное согласие.

1. Оценка сосудистого блока нижних конечностей, взятия проб крови и ангиопластики воздушного шара

ПРИМЕЧАНИЕ: Образец исследования, используемый для этого эксперимента, состоял из 20 больных сахарным диабетом, в возрасте 68 лет и 10 из 20 были мужчинами. Половина выборки были курильщики и наиболее распространенными со-заболеваемости были типа 2 сахарный диабет, системная артериальная гипертензия и / или дислипидемия. Выборка должна была быть стандартизирована для возрастных, половых и со-заболеваемости. Нельзя исключать возможную предвзятость из-за клиническо-демографического влияния на отношения между МПЦ и КЛИ.

  1. Оцените клиническую тяжесть ишемии конечностей в соответствии с классификациейРезерфорда 13 (см. Дополнительную таблицу 1).
  2. Выполните ангиографию нижних конечностей, отбор проб крови и ангиопластику воздушного шара.
    1. Перед операцией используйте антикоагулянтные и анестетические препараты.
    2. Поместите 18 G иглы в кровеносный сосуд на пах сайте выбраны.
    3. Поместите введение и заранее гибкий направляющий провод. Затем, первоначальное руководство дополнительно изменено для 6 Fr введение.
    4. Используйте периодические инъекции контрастных средств массовой информации или CO2 под флюоскопическим руководством для определения траектории артерий и заблокированных сосудистых участков(рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте контрастные средства массовой информации 40 см, разбавленные 1:1 в 0,9%солевого раствора, или CO 2 при 10-20 мл за выстрел под давлением 12 пси.
    5. Введайте два провода навигационного гида 0.014 Fr и два провода поддержки 0.014 Fr в судно и передайте их к заблокированной площадке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Два 0.014 Fr направляющий провод (260 см в длину) используются для навигации и два 0.014 Fr направляющий провод (260 см в длину) используются для поддержки, во время одной процедуры.
    6. Ввеми 5 о. и 3 катетера Fr последовательно и соберите 10 мл крови из ближайшего участка к сосудистой обструкции. Поддерживайте образцы крови на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры катетеров могут быть 5 Fr и 3 Fr, и они изменены во время процедуры.
    7. Заранее направляющий провод снова. Затем ввести катетер ангиопластики шар, который содержит надувной шар, расположенный в конце катетера. Заранее катетер ангиопластики шар и поместите воздушный шар прямо в месте поражения. Выполните ангиопластику, надувая воздушный шар против блокирующего налета, расположенного на сосудистой стенке. Проверить восстановление кровотока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: стент может быть помещен в заблокированной области, чтобы помочь сохранить артерию открытой после процедуры.
    8. Ввести катетер и заранее до ближайшего участка к сосудистому блоку. Соберите 10 мл крови с интервалом в 30 минут после ангиопластики. Поддерживайте образцы крови на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор образцов крови до и после ангиопластики рекомендуется для дальнейшей оценки влияния ангиопластики на количество МПЦ.
    9. Удалите все провода под флюоскопическим руководством.
    10. Обеспечить послеоперационные процедуры ухода, в том числе антикоагуляционной терапии с использованием эноксапарина на 1 мг/кг подкожной каждые 12 ч, аспирин 100 мг, статинов и анальгезии. Сжатие в месте прокола сосудов в течение 24 ч.

2. Количественная оценка циркулирующих моноядерных клеток-предшественников (MPCs)(рисунок 2)

  1. В свежую коническую трубку 15 мл, перенесите 6 мл собранной крови и разбавьте 1:1 (v/v) с PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработать кровь в течение 1 ч от сбора.
  2. Подготовка к разделению градиента плотности, добавив 2 мл градиентной среды плотности до 3 пробирок каждый. Затем добавьте 3 равного объема aliquots разбавленной крови в каждой пробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать три четверти максимальной емкости пробирки.
  3. Центрифуга при 1800 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите слой интерфейса, присутствующий в качестве кольца с помощью пипетки, и перенесите в новую трубку. Добавить 2 мл PBS и спина при 1800 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию. Сохранить гранулы, как это будет содержать MPCs.
  4. Вымойте гранулы, содержащие MPCs с PBS центрифугации, как описано в шаге 2.3. Используйте свежие PBS для каждого мытья и спина при 1800 х г в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию. Повторите процесс в течение 6 раз.
  5. После последней стирки используйте 1 мл PBS для повторного использования клеточных гранул. Разбавить 20 МКЛ клеточной подвески с 20 МКЛ 0,4% трипан синий, 1:1 (v/v). Используйте 10 МКЛ этой клеточной подвески для подсчета клеток с помощью гемоцитометра и светового микроскопа.
  6. Aliquot 1 x 106 MPCs в ранее обозначенных 5 мл потока цитометрии труб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка соответствующих изотип-соответствующих антител контроля.
  7. Центрифуга труб при 1800 х г в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Аспирировать и отказаться от супернатанта.
  8. Разбавить первичное антитело в 100 МКЛ раствора инкубации антитела «1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%» и добавить в трубку. Повторное течение 10 с и инкубации в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию, в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации первичных антител, используемых в настоящем протоколе были CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Протокол может быть остановлен на этом этапе путем фиксации лимфоцитов в 4% параформальдегида в PBS и хранения образцов до 24 ч при 4 градусов по Цельсию.
  9. Центрифуга при 1800 х г в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант. Resuspend в 500 МКЛ 1x PBS, рН 7,4, EDTA 2 мМ.
  10. Выполните анализ цитометрии потока.
    1. Навеять фон с изотипом-соответствует контрольных антител. Затем на участке FSC/SSC выберите распространение лимфоцитов, пытаясь исключить клеточный мусор, остаточные гранулоциты и другие частицы. Такое распределение считается 100%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфоциты обычно распространяются в левом нижнем левом регионе участка.
    2. Используйте ворота с общим иммунофенотипом, содержащим большое количество клеток CD45 иCD34. Затем выберите для двойного положительного иммунофенотипа, используяворота,которые ранее идентифицировали CD45,CD34 , и добавляя либо KDR (VEGFR-2), CD133илиCD184 . Определите субпопуляции MPC по их специфическим маркерам поверхности клеток. Отчет в процентах от закрытых событий.
  11. Определить основные субпопуляции МПЦ. В настоящем исследовании проанализированы иммунофенотипы:CD45и CD34, CD133; CD45-CD34-CD184; CD45-CD34-CD133-CD184 ; CD45иCD34-KDR; CD45- CD34-KDR - CD133 - и CD45 , CD34-KDR-CD1847,17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти маркеры поверхности клеток были использованы для исследования: CD45 (лимфоциты), CD34 (эндотелиальные и/или сосудистые клетки), KDR (VEGFR-2) (мембранный маркер эндотелиальных клеток), CD133 (эндотелиальные клетки-предшественники) и CD184 (гематопоэтические стволовые клетки и эндотелиальные клетки).

3. Отношение МПЦ с модификацией эндотелиальной функции и гемодинамическим испытанием (FMD)

  1. Определите расширение опосредованного потока (FMD), пред- и постангиопластику.
    1. Используйте сосудистый линейный предудер для измерения диаметра брахиальной артерии.
    2. Поместите манжету сфигмоманомометра над местом измерения в предплечье и инуффлат на 50 мм рт. ст. выше систолического артериального давления в течение 5 мин и сдуть.
    3. Определите еще раз диаметр брахиальной артерии в течение следующих 60 с. Используйте уравнение ниже для оценки FMD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте степень дилатации с помощью уравнения (%) (максимальный диаметр после преходящей ишемии - базального диаметра) × 100 / базальный диаметр.
  2. Соотносить количество МПЦ с базовым значением FMD и дельтой FMD после ангиопластики.

4. Прогностические способности MPCs для ампутации конечностей

  1. Расписание периодических медицинских назначений после ангиопластики воздушного шара и выписки пациента, чтобы оценить качество притока крови к нижней конечности.
  2. Оцените клиническую тяжесть ишемии конечностей через 2 недели после ангиопластики. Оцените разрешение боли в отдыхе, нижнюю ишемию и сохранение функциональной стопы, согласно классификации Резерфорда13.
  3. Сравните клиническую тяжесть ишемии конечностей, на базовом уровне по сравнению с последующей деятельности. Определите те случаи, которые требуют серьезной ампутации из-за неблагоприятного исхода.
  4. Соотносить количество МПЦ с долей пациентов, нуждающихся в серьезной ампутации нижней конечности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Образцы крови из заблокированных артерий, на сайте, адресованном для ангиопластики, были собраны из 20 больных сахарным диабетом, в возрасте 68 лет и 10 из 20 были мужчины. Половина выборочных групп населения были курильщиками. Сосудистые поражения были в основном забил, как Резерфорд класса VI; в то время как пациенты показали более высокую распространенность сахарного диабета 2 типа (100%), гипертонии (70%) дислипидемия (55%).

30 дней клинического последующего после нижней конечности ангиопл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сбор крови в точном месте сосудистого блока может показать технические трудности; Поэтому мы проводили сбор крови в непосредственной близости от сосудистого блока. Аналогичным образом, количество MPCs близко к сосудистой бляшки, как представляется, весьма динамичным и может возникнуть вариации до и после ангиопластики. Согласно нашим наблюдениям, рекомендуется оценить базовые и 30мин-постангиопластики изменения в количестве МПЦ, так как они могут отражать несколько патофизиологических процессов, происходящих в рамках пов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят поддержку Институциональной программы Е015 за проект ID 356.2015.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BSARoche10735086001бычью сыворотку альбумин (BSA) в качестве буферного агента, стабилизатора, стандартного и для смешивания.
Калибровочные бусиныMiltenyi Biotec / MACS#130-093-607Калибровочные бусины MACQuant поставляются в водном растворе, содержащем 0,05% азида натрия. 3,5 мл для проведения до 100 тестов
CD133/1 (AC133)-PEMilteny Biotec / MACS#130-080-801Антитело, конъюгированное с R-фикоэритрином в буфере PBS/EDTA
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770Miltenyi Biotec / MACS#130-103-798Моноклональный, изотип рекомбинантный человеческий IgG1, конъюгированный
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APCMiltenyi Biotec / MACS#130-093-601Антитело, конъюгированное с R-фикоэритрином в буфере PBS/EDTA
CD34-FITCMiltenyi Biotec / MACS#130-081-001Клон моноклонального антитела AC136 выделяет эпитоп класса III CD34
CD45- VioBlueMiltenyi Biotec / MACS#130-092-880Моноклональное антитело CD45, человеческие конъюгированные
конические пробиркиThermo SCIENTIFIC#33965115 мл конические центрифужные пробирки
Цитометрические пробиркиFALCON Corning Brand#3520525 мл полистироловая трубка с круглым дном. 12x75 стиль. Стерильный.
EDTABIO-RAD#161-0729Тяжелые металлы, (как Pb) < 10 ppm, Fe< 0,01%, As< 1 ppm, нерастворимые< 0,005%
Улучшенный NeubauerБез маркиБез каталожного номераГемоцитометр для подсчета клеток. (диапазон 0,1000 мм, 0,0025 мм2)
K2 EDTA Пробирки для сбора кровиBD Vacutainer#367863Сиреневая пластиковая пробирка для вакуума (K2E) 10,8 мг, 6 мл.
стволовых клетокLymphoprep01-63-12-002-AСтерильна и проверена на наличие эндотоксинов. Плотность: 1,077± 0,001 г/мл
ПараформальдегидSIGMA-ALDRICHФиксация биологических образцов, (порошок, 95%)
Пипетка Трансфер 1,3 млCRM GlobePF1016, PF1015Трансферная пипетка - это инструмент, который облегчает перенос жидкости с большей точностью.
ПробиркиKIMBLE CHASE45060 13100Термостойкие пробирки. РАЗМЕР/КОЛПАЧОК 13 x 100 мм
Технология #SZBF0920V

Ссылки

  1. Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
  2. Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
  3. Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
  4. Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
  5. Cronewett, J. L. Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford's vascular surgery (8th ed.). , Saunders Elsevier. Philadelphia, PA. (2014).
  6. Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
  7. Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
  8. Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
  9. Benoit, E., O'Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
  10. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
  11. Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
  12. Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
  13. Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
  14. Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
  15. Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
  16. Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
  17. Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790(2010).
  18. Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
  19. Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Проточная цитометрияцентрифугирование в градиенте плотностиэндотелиальная дисфункцияпрогнозирование ампутации конечностиклассификация по РатерфордуФМД плечевой артериизабор крови при обструкции сосудов
Прогнозирование ампутации с использованием местных циркулирующих моноядерных клеток-предшественников в ангиопластике пациентов с критической ишемией конечностей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.