Изображение и количественная оценка области быстро движущихся микропузырей с помощью высокоскоростной камеры и анализа изображений

Summary

Кавитация микропузырьки изображены с помощью высокоскоростной камеры, прикрепленной к зум-объективу. Экспериментальная установка объясняется, и анализ изображения используется для расчета области кавитации. Анализ изображений проводится с помощью ImageJ.

Abstract

Представлен экспериментальный метод анализа изображений для визуализации пузырьков кавитации и расчета их площади. Представленная здесь экспериментальная методика высокоскоростной визуализации и протокол анализа изображений также могут быть применены для визуализации микроскопических пузырьков в других областях исследований; поэтому он имеет широкий спектр применений. Мы применяем это к кавитации изображений вокруг зубных ультразвуковых шкалеров. Важно, чтобы кавитация изображений характеризовала его и понимала, как его можно использовать для различных приложений. Кавитация происходит вокруг зубных ультразвуковых шкалеров могут быть использованы в качестве нового метода удаления зубного налета, который будет более эффективным и причинить меньше вреда, чем текущие методы пародонта терапии. Мы представляем метод визуализации облаков пузырьков кавитации, происходящих вокруг зубных ультразвуковых советов масштаба с помощью высокоскоростной камеры и зум-объектива. Мы также вычисляем область кавитации с помощью анализа изображений машинного обучения. Программное обеспечение с открытым исходным кодом используется для анализа изображений. Представленный анализ изображений прост в воспроизведении, не требует опыта программирования и может быть легко изменен в соответствии с приложением пользователя.

Introduction

Изображение движения пузырьков имеет важное значение для различных приложений, поскольку он контролирует гидродинамику системы. Есть много приложений, где это может быть полезно: в жидкостных реакторах^{кровать 1,,2}, или для очистки с кавитации^{пузырьков 3,4}. Цель изображения пузырьков заключается в том, чтобы лучше понять динамику пузыря или направление и движение облака пузырьков. Это может быть сделано путем наблюдения структур, изображенных, а также с помощью анализа изображений для получения количественной информации, такой как размер пузырьков.

Кавитации пузыри газа или пара лиц, которые происходят в жидкости, когда давление падает ниже насыщенного значения давления⁵. Они могут возникать при применении акустического поля к жидкости на ультразвуковых частотах. Они постоянно растут и разрушаются, а при обрушении могут высвобождать энергию в виде скоростных микро-струй и ударных^{волн 6,,7.} Они могут выбить частицы на поверхности с помощью сил стрижки и вызвать очистку поверхности⁸. Кавитации пузырьки в настоящее время исследованы для очистки поверхности в различных отраслях промышленности, таких как полупроводники,^{продукты питания, ираны очистки 9,}10^,11,12. Они также могут быть использованы для очистки зубного налета от зубов и биоматериалов, таких как зубные^{имплантаты 12,13}. Кавитация происходит вокруг используемых в настоящее время стоматологических инструментов, таких как ультразвуковые шкалы и эндодонтические файлы и показывает потенциал в качестве дополнительного процесса очистки с этими^{инструментами 14}.

Колебания пузырьков кавитации происходит в течение нескольких микросекунд и, следовательно, высокоскоростная камера требуется, чтобы захватить их движение с помощью изображений на тысячи кадров в^{секунду 8}. Мы демонстрируем метод визуализации микропузырьковой кавитации вокруг зубных ультразвуковых шкалеров. Цель состоит в том, чтобы понять, как кавитация варьируется вокруг различных ультразвуковых шкалеров, поэтому она может быть оптимизирована как новый способ очистки зубного налета.

Предыдущие методы, используемые для исследования кавитации включают sonochemiluminesence, который использует люминол для обнаружения, где^{кавитация произошла 15,16}. Тем не менее, это косвенный метод, и он не в состоянии визуализировать пузырьки кавитации в режиме реального времени. Таким образом, он не в состоянии точно определить, где именно это происходит на инструменте, и никакая информация не может быть получена на динамику пузыря, если она не сочетается с другими методами^{изображения 17}. Высокоскоростная визуализация может изображение не только кавитации пузырьков растет и рушится, но и тип кавитации происходит: кавитации облака, микростримеры^{и микро-струй 6,7,18}. Они дают больше информации о том, как кавитация может очистить поверхности.

Мы представляем метод визуализации кавитации микропузырей с помощью высокоскоростной камеры и расчета средней площади кавитации происходит. Этот метод демонстрируется на примере кавитации, происходящей вокруг различных стоматологических ультразвуковых советов шкалы, хотя экспериментальные и этапы анализа изображений могут быть использованы для других приложений, таких как для визуализации других макро- и микропузырьки.

Protocol

1. Настройка инструмента

1. Выберите инструмент или объект для изображения. В этом эксперименте был изображен ультразвуковой масштабер. Пузырьки кавитации возникают вокруг кончиков ультразвуковых шкалеров в воде.
2. Выберите этап микро позиционирования для инструмента, который будет изображен с помощью перевода и вращения XY. Поместите на лабораторный домкрат. Прикрепите ручку инструмента к этапу микро позиционирования
3. Выберите оптически прозрачный контейнер для визуализации. Контейнер, используемый в этих экспериментах, был создан с помощью слайдов со стеклянным микроскопом.
4. Выберите этап XY с платформой вращения. Поместите на лабораторный домкрат. Поместите контейнер для воды на сцену и заполните фильтрованной водой (обратный осмос или дистиллированной).

2. Высокоскоростная установка камеры

1. Выберите высокоскоростную камеру с желаемой частотой кадров и разрешением и высокоинтенсивный источник света с направляющий выступ света волокна.
2. Прикрепите микропозиционную раздвижную пластину к корпусу высокоскоростной камеры и подключите ее к штативу.
3. Выберите объектив с желаемым разрешением и фокусным расстоянием и прикрепите его к камере. Для этого эксперимента использовался зум-объектив с разрешением 8,4 мкм/пиксель.
4. Заполните резервуар для визуализации водой и распоистите кончик прибора, который будет изображен в резервуаре для воды в нужной ориентации.
5. После подключения камеры и загрузки живого представления в программном обеспечении используйте низкое увеличение, чтобы сосредоточиться на кончике ультразвукового шкалера, при необходимости перепозиционирование источника света. Распоистив прибор и источник света перед камерой и сосредоточьтесь. Отрегулируйте к пожеланным тарифу кадра и яркости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации с высокой скоростью кадров, короткими скоростями затвора и/или высокими увеличениями требуется более высокая интенсивность света. Освещение может быть обеспечено в режиме отражения или режиме передачи. В этом протоколе освещение обеспечивается в режиме передачи (яркое поле) с помощью высокоинтенсивного холодного освещения устройства.
6. Установите оптимальную частоту кадров и скорость затвора для высокоскоростной камеры. В этом эксперименте частота кадров составила 6400 кадров в секунду со скоростью затвора 262 наносекунды. Короткая скорость затвора требуется для быстро движущихся пузырьков, таких как пузырьки кавитации, чтобы убедиться, что они находятся в фокусе.
7. Отрегулируйте увеличение зум-объектива и интенсивность источника света, чтобы фон был белым, не будучи переэкспонированным.

3. Калибровка

1. Запись положения кончика (вращение в стадии x-y, угол вращения прибора для воспроизводимости).
2. Чтобы обеспечить согласованное поле зрения для каждого повтора, выберите точку отсчета и заместите координаты. В этом случае точкой отсчета была верхушка ультразвукового шкалера. Затем он может быть перемещен в будущих экспериментах в том же месте в поле зрения.
3. Если размер пикселя неизвестен, изображение graticule с 10 мкм маркировки на набор увеличения и использовать программное обеспечение анализа изображений, таких как Фиджи для расчета разрешения.

4. Высокоскоростная видеозапись

1. Изображение инструмента без кавитации. Это будет вычтено из изображений кавитации при анализе изображения при расчете области пузырьков кавитации. Сохраните видео в таком формате, как TIFF, чтобы качество изображения не было потеряно.
2. Изображение прибора, работающего с кавитацией. Убедитесь, что есть достаточные рамки для точного анализа, например, 5 повторов по 500 кадров каждый.

5. Обработка изображений

1. Скачать^{Фиджи 19} с сайта ImageJ (https://imagej.net/Fiji). Был предоставлен макрокод ImageJ, который автоматически делает шаги анализа изображений, описанные ниже, а также может быть изменен в соответствии с приложением. Отдельные шаги макроса описаны шагами 5,3-5,5.
2. Урожай изображения, чтобы удалить любые темные области в результате неравномерного освещения, если это необходимо. Убедитесь, что все изображения обрезаются одинакового размера и в одинаковой точке изображения.
3. Преобразование изображений в двоичное путем автоматического порога с использованием одного из автоматических порогов. В этом примере используется минимальный автоматический порог.
4. Запустите команду заполнения отверстий, чтобы удалить любые черные пиксели изнутри пузырьков, которые были ложно сегментированы.
5. Рассчитайте гистограмму стека, чтобы показать количество пикселей, соответствующих шкале и кавитации в каждом кадре.
6. В этом случае пиксели, соответствующие пузырям, белые и имеют значение 255. Сохраните эти измерения.
7. Повторите шаги 5.3-5.6 для видео прибора, работающего без пузырей.
8. Рассчитайте среднее количество ультразвукового наконечника шкалы только по результатам гистограммы.
9. Вычесть среднее значение инструмента из каждой из областей, рассчитанных из видео пузырьков вокруг шкалы. Область пузырьков остается для измерения.
10. Визуализация путем вычитания двоичного изображения шкалы из двоичного изображения шкалы с пузырьками с помощью калькулятора изображений на Фиджи.
11. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение области пузырьков.
12. Преобразование значений из числа пикселей в область (в данном случае^{мкм 2)}путем умножения на размер пикселя в квадрате. Рассчитайте размер каждого пикселя с помощью изображения решетки с помощью высокоскоростной камеры с тем же увеличением, что и для визуализации и использования ImageJ для настройки шкалы.
13. Участок данных. Можно также провести статистический анализ, чтобы показать какую-либо существенную разницу в области пузырьков при сравнении различных условий.

6. Макрос ImageJ

1. В меню ImageJ/Fiji, перейдите на Плагины Убедитесь, что IJ1 Macro проверяется под языковым меню и копирует и встраив следующий код. Нажмите запустить для выполнения макроса( Дополнительный файл).

Results

Шаги анализа изображений можно увидеть на рисунке 1 для одного из проверенных ультразвуковых советов шкалы. Наконечник FSI 1000 и наконечник 10P были изображены внутри резервуара для воды с выключенной охлаждающей водой (рисунок 2). Кавитация произошла вблизи изгиба кончика FSI 1000 при максимальной мощности, и вблизи свободного конца в кончике 10P(рисунок 3 и рисунок 4). Средняя площадь кавитации составила 0,1 и 0,07^{мм 2} для наконечника FSI 1000 и 0,50 и 0,25^{мм 2 для} наконечника 10P(рисунок 5).

Рисунок 1: Высокоскоростная настройка изображений и шаги анализа изображений (a)Схема высокоскоростной установки изображения, используемой в исследовании. b)Схема шагов анализа изображений, используемых в исследовании, показывающих необработанные изображения слева от кончика шкалы только и с кавитацией, которые затем были бинаризованы и вычтены друг от друга для расчета области облаков кавитации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Сравнение между различными советами высокоскоростных изображений stills показаны кавитации происходит вокруг двух ультразвуковых советы шкалы испытания (a ) FSI 1000 (b) 10P. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Совет 10P высокоскоростных изображений: Высокоскоростное изображение кадры наконечник 10P, из видео, снятого на 6400 кадров в секунду. Кавитация можно увидеть вокруг свободного конца кончика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Совет FSI1000 высокоскоростных изображений: Высокоскоростное изображение кадры наконечник FSI 1000, из видео, снятого на 6400 кадров в секунду. Кавитация можно увидеть посередине кончика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Результаты анализа изображений области кавитации. Средняя область кавитации происходит вокруг FSI 1000 и 10P ультразвуковой шкалер советы рассчитывается с помощью метода анализа изображений описано. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Техника, описанная в этой работе, позволяет изображения быстро движущихся микропузырьки с высоким пространственным и временным разрешением. Это потенциально может принести пользу широкому кругу научных дисциплин, таких как химическая инженерия, стоматология и медицина. Инженерные приложения включают изображения пузырьков кавитации для очистки поверхностей, или для визуализации пузырьков в жидкостных реакторах кровати. Биомедицинские приложения включают кавитацию изображений вокруг медицинских и стоматологических инструментов и биопленку изображений из твердых и мягких тканей с использованием пузырьков кавитации. В этом исследовании мы продемонстрировали технику визуализации кавитации вокруг двух различных стоматологических ультразвуковых советов масштаба. Количество кавитации варьируется между двумя советами, проверенными в этом исследовании, с большим количеством облаков кавитации наблюдается вокруг свободного конца кончика 10P. Ранее это было связано с амплитудой^{вибрации 20.} Высокоскоростные видео показывают, что наконечник FSI 1000 имеет меньше вибрации, что, вероятно, является причиной меньше кавитации вокруг этого наконечника.

Одним из ограничений метода анализа изображений является то, что метод вычитания изображений для удаления области шкалы не является полностью точным, потому что шкала колеблется и, следовательно, вычитание может оставить некоторые области шкалы ложно сегментированы как пузыри. Тем не менее, это было учтено путем усреднения области из большого количества кадров (n'2000). Это не будет проблемой для приложений, где объект, который будет вычитан, является неподвижным. Для исследований, где движущийся объект, который будет вычитаться имеет гораздо более высокую дисперсию, мы рекомендуем синхронизировать движения в обоих видео, прежде чем вычитать для точных результатов. В текущем исследовании мы не синхронизировали колебания, но так как вибрация была низкой, можно предположить, что колебания хорошо соответствуют друг другу в этих двух измерениях.

Пороговое изображение является точным, потому что яркое освещение обеспечивает единый фон с хорошим контрастом. Крайне важно обеспечить, чтобы фон был однородным и не содержал других объектов, которые могли бы быть ложно сегментированы. Метод порогового значения может быть изменен с помощью других автоматических пороговых значений в соответствии с приложением. Ручное пороговое значение, когда пользователь устанавливает пороговое значение, также возможно, но не рекомендуется, поскольку снижает воспроизводимость результатов, так как различные пользователи будут выбирать различные пороговые значения.

Анализ изображений был использован для многих других исследований изображения пузырьков. Они также используют аналогичный метод подсветки, чтобы получить оптимальный контраст между пузырьками и фоном, и порог сегмент^{пузыри 21,22,23,24}. Метод, показанный в текущем исследовании, также может быть обобщен для использования для многих различных приложений для изображения пузырьков, которые не ограничиваются только высокоскоростной визуализацией. Высокоскоростная визуализация была использована для кавитации пузырьков, генерируемых в воде, а также вокруг таких инструментов, как эндодонтные файлы и ультразвуковые шкалы^{12,,25,,26,,27,28}. Например Rivas et al. и Macedo et al. использовали высокоскоростную камеру, прикрепленную к микроскопу, с освещением, предоставляемым холодным источником света для очистки изображения с кавитацией, и для кавитации изображения вокруг эндодонтического^{файла 17,29}. Яркое освещение поля обеспечивает больший контраст между фоном и пузырьками, что позволяет использовать простые методы сегментации, такие как пороговые значения, как это продемонстрировали Rivas et al. для визуализации и количественной эрозии кавитации и очистки с течением^{времени 29}. Освещение темного поля затрудняет порог из-за более высокой вариации серых^{чешуек 4,,30.} Анализ изображений был использован в других исследованиях, чтобы собрать больше информации о^{пузырьках 1,,2}. Vyas et al. использовали подход машинного обучения к сегментации пузырьков кавитации вокруг ультразвукового шкалера^20. Метод, описанный в текущем документе, быстрее, потому что он использует простую пороговую шкалу, поэтому он менее вычислительно интенсивный, и пузыри, происходящие выше и ниже шкалы, могут быть проанализированы. Однако метод порогового значения, используемый в текущем документе, является точным только в том случае, если фон однороден. Если невозможно получить единый фон во время визуализации, могут быть использованы другие методы обработки изображений, такие как использование фонового вычитания с помощью радиуса подвижного шара для коррекции неравномерного освещения, фильтрация с использованием медианных или гауссийских фильтров для удаления шума, или также с использованием методов^{машинного обучения 20,31}.

В заключение мы представляем высокоскоростной протокол визуализации и анализа для изображения и расчета площади микроскопического движущийся объект. Мы продемонстрировали этот метод с помощью изображений пузырьков кавитации вокруг ультразвукового шкалера. Он может быть использован для визуализации кавитации вокруг других стоматологических инструментов, таких как эндодонтные файлы, и он может быть легко адаптирован для других не-стоматологических приложений изображения пузыря.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Насадка 0,25x	Navitar	1-50011
12x с 12 мм тонкой фокусировкой Зум-объектив для микроскопа дальнего расстояния	Navitar	1-50486
2x адаптер с байонетом f	Navitar	1-62922
Cavitron Plus Ультразвуковой скейлер	Dentsply Sirona	8184003
Cavitron Ультразвуковая вставка FSI 1000FSI 1000	Dentsply Sirona	Волоконный световод UCAFTHD
. Пучок волокон 8 мм, длина 1500 мм. Фокусировочный объектив в сборе для света Hayashi, штатив 1/4"-20 резьба для крепления .	Hayashi	LGC1- 8L1500
Зубчатая головка	Manfrotto	MN405	грузоподъемность 7,5 кг
HDF7010 Мощный светодиодный эндоскоп Источник света . Светодиод мощностью 150 Вт обеспечивает холодную мощность, эквивалентную 250 Вт<бр/> ксенон.	Hayashi	LA-HDF710
Тяжелый штатив	Manfrotto	MN475B	Зубчатая центральная колонна, грузоподъемность 12 кг
Высокоскоростная камера	Photron	103526	FASTCAM Mini AX200 900K M3 (16 ГБ памяти)
Высокоточное вращение  Столик	Thorlabs	PR01/M
Лабораторные домкраты	Camlab	1194083
Микропозиционирование скользящей пластины	Manfrotto	SKU 454
Столик для микропозиционирования 3D	Thorlabs	PT3/M Вращение
столика для микропозиционирования	Thorlabs	OCT-XYR1/	M OCT-XYR1/M - XY Столик со сплошной верхней панелью
NEWTRON P5 XS Ультразвуковой скейлер	Acteon	F62118
Ультразвуковая вставка 10P	Acteon	F00253