Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Минимальная витрификация незрелых кошачьих ооцитов

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61523

⸱

24 июня 2020 г.

 , 
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

В этой статье

Краткое содержание

Данная рукопись описывает протокол для минимального объема витрификации незрелых кошачьих яйцеклеток с лабораторными носителями на коммерческих опорах. Она охватывает каждый шаг от изоляции яйцеклеток от ex vivo гонад до витрификации и потепления.

Аннотация

В программах сохранения диких животных, gamete банковской имеет решающее значение для защиты генетических ресурсов ценных людей и редких видов и содействовать сохранению биоразнообразия. В фелидах большинство видов находятся под угрозой исчезновения, а отечественные породы используются в качестве модели для повышения эффективности протоколов для зародышевой плазмы банковской деятельности. Среди методов криоконсерваации ооцитов витрификация становится все более и более популярной в репродукции человека и ветеринара. Криотоп витрификация, которая была сначала разработана для человеческих яйцеклеток и эмбрионов, показал, что хорошо подходит для кошачьих яйцеклеток. Этот метод предлагает ряд преимуществ, таких как осуществимость в полевых условиях и скорость процедуры, которая может быть полезна, когда несколько образцов должны быть обработаны. Однако эффективность в значительной степени зависит от навыков оператора, и необходима внутри- и межлабораторная стандартизация, а также подготовка персонала. Этот протокол описывает минимальный объем витрификации незрелых кошачьих ооцитов на коммерческую поддержку в шаг за шагом поле дружественных протокола, от сбора яйцеклеток к потеплению. В соответствии с протоколом, сохранение целостности яйцеклеток и жизнеспособности при потеплении (до 90%) можно ожидать, хотя все еще есть возможности для улучшения после потепления созревания и эмбриональных результатов развития.

Введение

Криоконсервационная помощь стала ключевым этапом вспомогательных методов воспроизводства (АРТ). В людях, оно позволяет консервацию плодородности или отсрочку parenthood для медицинских или личных причин. У животных необходимо преодолеть расстояние и время в запланированных спариваниях, особенно у сельскохозяйственных животных и домашних животных, или сохранить генетический материал ценных предметов в программах сохранения, особенно в диких исчезающих видов. Gamete криоконсервациония является лучшим выбором, когда лица, которые будут выведены еще не были выбраны или для того, чтобы избежать этических вопросов, связанных с замораживанием эмбрионов, особенно в человеческой медицине1. Сперматозоа относительно легко сохранить и дать удовлетворительные результаты после оттаивания, но ооциты, из-за их структурных особенностей, может быть более сложным для хранения. Действительно, низкое соотношение поверхности/объема, а также присутствие zona pellucida, окружающей оплазму, ограничивает движение криопротекторов и воды по клетке2. Кроме того, у домашних животных, включая фелиды, они характеризуются богатой липидами цитоплазмой, которая, как полагают, делает их более чувствительными к криоконсервациону3.

Большинство фелидов находятся под угрозой, и домашняя кошка используется в качестве модели для разработки протоколов для сохранения зародышевой плазмы благодаря наличию гонадов от обычной овариэктомии. У диких животных, гонады могут быть получены после факультативных операций или (чаще) посмертные,и незрелые (зародышевые пузырьки) гаметы могут быть извлечены. Гормональная стимуляция, направленная на получение зрелых (метафазы II) яйцеклеток, не так распространена, как в АТ человека из-за этических вопросов и видово-специфических ответ на лечение4.

Таким образом, развитие криоконсервации стратегии была сосредоточена на незрелых гамет, которые обычно могут быть извлечены после неожиданной или внезапной смерти редких людей. С биологической точки зрения, Есть некоторые различия в криоконсерваации незрелых или зрелых гамет, каждый из которых имеет свои преимущества. Во-первых, ДНК более защищена в незрелых яйцеклеток, чьи зародышевые пузырьки содержит хромосомы, окруженные ядерной мембраной, в то время как мейотический шпиндель метафазы II ооцитов может быть более уязвимым к криоинужуиру5. Во-вторых, холодинированные повреждения цитоскелета могут повлиять на вращение шпинделя, экструзию полярного тела, проядерную миграцию и цитокинез, которые могут иметь различные последствия в зависимости от фазы развития ооцитов, влияющих на прогрессирование мейоза или события пост-оплодотворения. Наконец, и, возможно, самое главное, в то время как зрелые яйцеклетки готовы к оплодотворению, незрелые гаметы полагаются на поддержку окружающих клеток cumulus, чтобы пройти через ядерную и цитоплазматическую созревание6, и это причина, почему целые кумулус-ооциты комплексов (COCs) криоконсервативные. Однако потеря кумулятивных клеток и/или потеря функциональной связи между гаметом и окружающими соматическими клетками, вероятно, являются наиболее пагубным эффектом криоконсерваации незрелых КОК.

Среди методов криоконсервации, витрификация является одним, которые могут быть применены более легко в полевых условиях. По сравнению с медленным (или контролируемым уровнем) замораживания, витрификация быстрее и не требует специального оборудования, например программируемого морозильника. Для того, чтобы удовлетворить три основных принципа витрификации (т.е. высокая вязкость, связанная с высокой криопротекторной концентрацией, небольшими объемами и сверхбыстрым снижением температуры), несколько носителей и опор особенно разработаны и используются у кошек как для незрелых, так и для зрелых яйцеклеток. Начиная с простых соломинки7, устройства были разработаны для достижения "Минимальный объем" цели. Cryoloop8, открытые вытащил соломинки (OPS)9, пластиковые желоба (модифицированная солома)10 и cryotubes11 были использованы, пока более эффективное устройство (т.е., Cryotop) был использован11, улучшение выживания и мейоз возобновления. Cryotop (Дополнительный рисунок 1) является коммерчески доступной поддержкой, которая стала выборной открытой системой витрификации. Разработанный для витрификации человеческих яйцеклеток и эмбрионов, он состоит из небольшой пленки полоса прилагается к жесткому пластиковому держателю, защищены пластиковой крышкой трубки во время хранения12. Благодаря своей удобство использования и экстремальному сокращению объема витрификации (всего 0,1 л), что также приводит к чрезвычайно быстрому похолоданию и потеплению, эта поддержка витрификации все чаще применяется в нескольких видах, в том числе в домашних кошачьих, в которых она была использована с различными средствами массовой информации13,14,15,16,17.

Цель этой рукописи состоит в том, чтобы описать сбор-витрификации потепление протокола, с незначительными изменениями от одного первоначально разработан для человека ооцитов, который использует лабораторных средств массовой информации и коммерческих поддерживает для минимального объема витрификации и может быть легко применен в полевых условиях для криоконсервации незрелых кошачьих COCs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры, изображенные настоящим, не проходили этического утверждения, так как кошачьи яичники были собраны в ветеринарных клиниках в качестве побочных продуктов от запрошенной владельцем рутинной овариэктомии или яичниковистерэктомии.

1. Коллекция яйцеклеток

  1. Перед началом экспериментов подготовьте решения для сбора яичников и яйцеклеток. Подготовка раствора для сбора яичников с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) со смесью антибиотиков и антимикотики (100 МЕ/мл пенициллина G натрия, 0,1 мг/мл стрептомицин сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина В). Подготовка раствора для сбора яйцеклеток (т.е. PBS/PVA) с ПБС с 100 МЕ/мЛ пенициллина G натрия, 0,1 мг/мЛ сульфата стрептомицина и 0,1% (w/v) поливиниловый спирт (ПВА).
  2. Храните решения для сбора яичников и яйцеклеток при 4 градусах Цельсия до использования.
  3. В день spaying ферзей, за несколько часов до обработки образцов, принять часть яичников и ооцитов решений сбора и дайте им согреться при комнатной температуре (RT; 25 и 2 кк).
  4. Когда образцы поступают в лабораторию, изолируйте яичники от окружающей соединительной ткани и из яйцеклетки и смойте их в свежем средстве сбора яичников в чашке Петри.
  5. Заполните один 35 мм Петри блюдо для каждой королевы около 3 мл RT PBS / PVA, и еще одно блюдо для сбора ооцитов.
  6. Поместите пару яичников в чашку Петри и фарш коры с хирургическим скальпелем. Убедитесь, что все фолликулы были сломаны с помощью стереомикроскопа (увеличение 8x).
  7. Соберите COCs с пипеткой и переместить их в свежем PBS / PVA в выделенной чашке Петри. Выберите хорошие качества COCs, с однородной, темной цитоплазмой и окружен несколькими компактными слоями кумулятивных клеток (класс I18).

2. Витрификация

  1. Подготовка эквилибрации и витрификации средств массовой информации.
    1. Подготовка раствора эквилибрации (ES) с 7,5% (v/v) этиленгликолем (EG) и 7,5% (v/v) диметилсульфофоксид (DMSO) в Medium 199, с 20% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS).
    2. Подготовка раствора витрификации (VS) с 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO и 0,5 М сахарозой в Medium 199, с 20% FBS (изменено с 19).
    3. Пусть ES и VS разогреться на RT перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Криопротекторы (например, EG, DMSO), как известно, цитотоксичены. Стратегия по борьбе с их токсичности заключается в снижении температуры, при которой клетки подвергаются воздействию их20, и ооциты, как правило, подвергаются криопротекторы на RT. Таким образом, вся процедура, от сбора яйцеклеток до витрификации, проводится в РТ в этом протоколе, чтобы избежать колебаний температуры.
  2. Приготовьте блюдо из витрификации (т.е. специальное блюдо, состоящее из шести конических колодцев, разделенных на два ряда, известного как «Repro плита»). Подготовьте один ряд (три скважины) для каждой опоры витрификации.
    1. Добавьте 20 хл ES в нижней части первой скважины.
    2. Добавьте 300 л VS в нижней части второй (т.е. 1VS) и третьей (т.е. 2ВС) скважин.
  3. Эквилибрировать COCs в ES.
    1. С мелкоствольным пипеткой (например, пастерская пипетки, вытягиваемой на клюве Bunsen, чтобы сделать его тоньше – диаметр должен быть не менее 200 мкм), перенос одного (или более) COC (ы) на дно первой скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите размер пипетки в зависимости от количества слоев кумуляных клеток, окружающих ооциты, так что ККО размеры, с целью уменьшить как можно больше объем средств массовой информации, которая передается с КОК на каждом этапе. С настоящим протоколом, обученные операторы могут витриться успешно до восьми кошачьих COC на каждую поддержку витрификации.
    2. Медленно добавьте 20 мл ES на границе капли. Подождите 3 минуты.
    3. Медленно добавляйте другие 20 мл ES на границе капли. Подождите 3 минуты.
    4. Медленно добавьте 240 хл ES на границе капли. Подождите 9 минут.
    5. Во время ожидания, подготовить коробку с жидким азотом (LN2), этикетка витрификации поддержки с экспериментом / кошка идентификационный код и оставить его открытым. Поместите их оба возле стереомикроскопа, чтобы их можно было легко добраться во время работы.
      Осторожностью! Носите средства индивидуальной защиты при обращении с LN2.
    6. Кроме того, если несколько КОК должны быть витрифицированы, начните первый шаг к равновесию (см. шаг 2.3.1 - 2.3.2) для другой группы КОК (которая будет загружена на новую поддержку витрификации).
  4. Витрифи COCs в VS менее чем за 90 секунд.
    1. Используя тот же мелкоствованый пипет, заполните его 1VS, возьмите КОК со дна первой скважины (ES) и переместите их на поверхность второй скважины (1VS).
    2. Вымойте пипетки с 1VS.
    3. Возьмите COCs и переместить их в другой области (на дне) скважины; смешать среды, окружающие их с пипеткой.
    4. Заполните пипетки с 1VS в другой области скважины, принять COCs, переместить их и смешать среды, окружающие их с пипеткой.
    5. Повторите шаг 2.4.4.
    6. Вымойте пипетки с 2VS.
    7. Возьмите КОК и переместить их на дно третьей скважины (2VS); смешать среды, окружающие их с пипеткой.
    8. Заполните пипетки с 2VS в другой области скважины, принять COCs, переместить их и смешать среды, окружающие их с пипеткой.
    9. Повторите шаг 2.4.8.
    10. Заполните пипетки с 2VS в другой области скважины, принять COCs и загрузить их на полосу витрификации поддержки, как можно ближе к кончику. Аспирировать избыток среды, чтобы уменьшить объем VS как можно больше.
    11. Немедленно окуните поддержку витрификации в LN2,перемещая ее. Закройте его с помощью некоторых зажимов, убедившись, что он всегда остается погруженным в LN2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение правильного времени имеет решающее значение из-за криопротекторной клеточной токсичности. Из-за их высокой концентрации в витрификации средств массовой информации, клеточной экспозиции необходимо контролировать, а также безупречное исполнение техники21. Если образцов в изобилии, рассмотреть вопрос о делении их обрабатывать их быстрее и свести к минимуму количество времени от сбора яйцеклеток к витрификации.
  5. Храните загруженные опоры витрификации в кубок и храните их в резервуаре LN2 до потепления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все предыдущие этапы протокола также могут быть применены в полевых условиях, если доступен LN2. Сухой грузоотправитель будет необходим для безопасной транспортировки образцов в лабораторию, а затем для перехода к следующему этапу.

3. Потепление

  1. Подготовка потепления средств массовой информации.
    1. Подготовка раствора оттаивания (TS) с 1 M сахарозой в среднем 199, с 20% FBS.
    2. Подготовка разбавиционного раствора (DS) с 0,5 М сахарозой в Medium 199, с 20% FBS.
    3. Подготовка стирального раствора (WS) с Medium 199 с 20% FBS.
    4. Перед использованием, разогреть TS до 38 градусов по Цельсию и DS и WS на RT.
  2. При необходимости подготовьте культурную среду для последующего использования подогретых КОК (например, созревание in vitro, IVM).
  3. Поместите этап нагрева близко к стереомикроскопу и включите его (38 градусов по Цельсию). Положите крышку чашки Петри, чтобы согреться.
  4. Когда все будет готово, перенесите витрификации опоры, которые должны быть нагревается от резервуара для хранения в коробку с LN2, и положить коробку возле стереомикроскопа.
  5. Подготовьте "Репро пластины". Подготовьте ряд для каждой поддержки витрификации, которая должна быть подогрета.
    1. Добавьте 300 хл DS в нижней части первой скважины.
    2. Добавьте 300 хл WS в нижней части второй (т.е. 1WS) и третьей (т.е. 2WS) скважин.
  6. Сделайте каплю TS (100 мл) на крышке чашки Петри.
  7. С зажимами, откройте одну поддержку витрификации в LN2.
  8. Положите падение TS под стереомикроскоп и с одним быстрым движением принять витрификации поддержку от LN2 и погрузить его полосу в падение, перемещая его до тех пор, пока все COCs отсоединиться. Снимите поддержку с капли, как только она пуста, но оставьте COC в TS на 1 минуту в общей сложности (от погружения до следующего шага).
  9. Возьмите пипетки, аналогичные той, которая используется для витрификации и заполнить его с DS. Возьмите COC из капли (TS) и переместить их на дно первой скважины (DS). Подождите 3 минуты.
  10. Вымойте пипетки с помощью 1WS. Возьмите COCs и переместить их на дно второй скважины (1WS). Подождите 5 минут.
  11. Вымойте пипетки с помощью 2WS. Возьмите COCs и переместить их на поверхности третьей скважины (2WS). Подождите, пока они коснутся нижней части колодца.
  12. Повторите шаг 3.11, используя другую область скважины.
  13. Вымойте пипетки с культурой среды и переместить яйцеклетки в культуру блюдо для следующего использования (например, IVM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После кошачьего яйцеклетки витрификации и потепления в соответствии с настоящимпротоколом (Рисунок 1 и Дополнительный рисунок 1), подавляющее большинство гамет выжить. После витрификации, среди других методов, жизнеспособность может быть оценена в оптическом микроскопе как морфологическая целостность22 или с использованием жизненно важных пятен. Одним из последних является флуоресцеин диацетат / пропидий йодид (FDA / PI), который позволяет идентифицир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Криоконсервационизация ооцитов является важнейшим методом сохранения зародышевой плазмы, особенно в таксоне, где многие виды находятся под угрозой исчезновения, такие как семейство Felidae. В этой рукописи был представлен простой и полевой протокол для витрификации незрелых кошачьих яйцеклеток. Лабораторные средства массовой информации, минимальный объем витрификации поддерживает и обученный персонал являются ключевыми факторами для успеха этого метода, который позволяет получать жизнеспособные яйцеклетки последовательно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана EVSSAR (Европейское ветеринарное общество для воспроизводства малых животных) Грант 2016 и Университет degli Studi ди Милано, Piano di Sostegno алла Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Мы также хотели бы поблагодарить д-ра МариаДжорджиа Морселли за ее вклад в эксперименты, которые были изображены, и в приобретении изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Амфотерицин BSigma-AldrichA2942/
Автоматические пипетки и наконечники//Необходим для пипеток 20, 100, 240 и 300 &; L
Хирургические скальпели//Размер 10 обычно подходит
клюв Бунзена//
/Зажимы//Некоторые маленькие (Москитный зажим) для выделения яичников, некоторые побольше (Клеммерский зажим) для работы в жидком азоте
КриотопКитадзато (дистрибьютор: MBT - Медико-биологические технологии)01.CRДистрибьюторы и каталожный номер могут меняться в разных странах
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650/
Этиленгликоль (EG)Sigma-AldrichE9129/
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichF9665/
Стеклянные пастеровские пипетки//Рекомендуемая длина 230 мм (100+130)
Гобелец//По канистрам накопительного бака
Нагревательный каскад//Все нагревательные ступени в порядке, пока они могут выдерживать 38º C
Жидкий азот///
Среда 199Сигма-ОлдричM4530/
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Сигма-ОлдричD8662/
Пенициллин G натрийСигма-ОлдричP3032/
Поливиниловый спирт (ПВА)Сигма-ОлдричP8136/
Репродуктивная пластинаKitazato (дистрибьютор: MBT - Medical Biological Technologies)01.K-2Дистрибьюторы и каталожный номер могут меняться в разных странах
Стереомикроскоп//Пока оператор может выбрать ооциты, другие стереомикроскопы в порядке
Резервуар для хранения//Любойрегулярно заполняемый бак в порядке
Стрептомицина сульфатSigma-AldrichS9137/
Пенополистирол/азотостойкая коробка//Всекоробки, которые могут содержать жидкий азот, допустимы, если оператору комфортно. Коробка Kitazato называется "Cooling Rack"
SucroseSigma-AldrichS1888/
Timers//Все таймеры, которые могут быть установлены на время до 9 минут.

Ссылки

  1. Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
  2. Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
  3. Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
  4. Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
  5. Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
  6. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  7. Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
  8. Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
  9. Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
  10. Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
  11. Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
  12. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73(2007).
  13. Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
  14. Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
  15. Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
  16. Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329(2019).
  17. Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
  18. Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
  19. Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
  20. Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
  21. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
  22. Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
  23. Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
  24. Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
  25. Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
  26. Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
  27. Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Криоконсервация ооцитов кошекпротокол витрификацииподдержка Cryotopравновесный растворраствор для витрификациихранение в жидком азотепроцедура согреванияжизнеспособность после согреваниякомплексы ооцит-кумулюс
Минимальная витрификация незрелых кошачьих ооцитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.