Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61541

⸱

21 июля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлена подробная методология диссоциации тканей и клеточного фракционирования, позволяющая обогатить жизнеспособные эпителиальные клетки из проксимальных и дистальных областей легкого человека. При этом эти подходы применяются для функционального анализа клеток-предшественников эпителия легких с помощью 3D-моделей культур органоидов.

Аннотация

Эпителиальные органоидные модели служат ценными инструментами для изучения базовой биологии системы органов и для моделирования заболеваний. При выращивании в качестве органоидов эпителиальные клетки-предшественники могут самообновляться и генерировать дифференцированное потомство, которое проявляет клеточные функции, аналогичные функциям их аналогов in vivo . Здесь мы описываем пошаговый протокол для выделения региональных предшественников из легких человека и создания 3D-органоидных культур в качестве экспериментального и валидационного инструмента. Мы определяем проксимальные и дистальные области легкого с целью выделения областно-специфических клеток-предшественников. Мы использовали комбинацию ферментативной и механической диссоциации для выделения общих клеток из легких и трахеи. Специфические клетки-предшественники затем фракционировали из клеток проксимального или дистального происхождения с использованием флуоресцентной ассоциированной сортировки клеток (FACS) на основе специфических поверхностных маркеров типа клеток, таких как NGFR для сортировки базальных клеток и HTII-280 для сортировки альвеолярных клеток типа II. Изолированные базальные или альвеолярные предшественники типа II использовались для генерации 3D органоидных культур. Как дистальные, так и проксимальные предшественники образовывали органоиды с колониеобразующей эффективностью 9-13% в дистальной области и 7-10% в проксимальной области при покрытии 5000 клеток/колодец на 30 день. Дистальные органоиды поддерживали альвеолярные клетки HTII-280+ типа II в культуре, тогда как проксимальные органоиды дифференцировались в реснитчатые и секреторные клетки к 30-му дню. Эти 3D органоидные культуры могут быть использованы в качестве экспериментального инструмента для изучения клеточной биологии эпителия легких и эпителиальных мезенхимальных взаимодействий, а также для разработки и валидации терапевтических стратегий, направленных на эпителиальную дисфункцию при заболевании.

Введение

Воздушное пространство дыхательной системы человека можно в широком смысле разделить на проводящую и дыхательную зоны, опосредующие перенос газов и их последующий обмен через эпителиально-микрососудистый барьер соответственно. Проводящие дыхательные пути включают трахею, бронхи, бронхиолы и терминальные бронхиолы, тогда как дыхательные воздушные пространства включают дыхательные бронхиолы, альвеолярные протоки и альвеолы. Эпителиальная оболочка этих воздушных пространств изменяется в составе вдоль проксимо-дистальной оси, чтобы удовлетворить уникальные требования каждой функционально отдельной зоны. Псевдостратифицированный эпителий трахео-бронхиальных дыхательных путей состоит из трех основных типов клеток, базальных, секреторных и реснитчатых, в дополнение к менее распространенным типам клеток, включая щетку, нейроэндокрин и ионоцит 1,2,3. Бронхиолярные дыхательные пути содержат морфологически сходные типы эпителиальных клеток, хотя существуют различия в их обилии и функциональных свойствах. Например, базальные клетки менее распространены в бронхиолярных дыхательных путях, а секреторные клетки включают большую долю клубных клеток по сравнению с серозными и бокаловидными клетками, которые преобладают в трахео-бронхиальных дыхательных путях.  Эпителиальные клетки дыхательной зоны включают плохо выраженный кубоидальный тип клеток в дыхательных бронхиолах, в дополнение к альвеолярным клеткам I типа (ATI) и типу II (ATII) альвеолярных протоков и альвеол 1,4.

Идентичность типов эпителиальных стволовых и клеток-предшественников, способствующих поддержанию и обновлению эпителия в каждой зоне, описана не полностью и в значительной степени выведена из исследований на животных моделях 5,6,7,8. Исследования на мышах показали, что либо базальные клетки псевдостратифицированных дыхательных путей, либо клубные клетки бронхиолярных дыхательных путей, либо ATII клетки альвеолярного эпителия служат эпителиальными стволовыми клетками, основанными на способности к неограниченному самообновлению и мультипотентной дифференцировке 7,9,10,11,12 . Несмотря на невозможность проведения исследований по отслеживанию генетической линии для оценки стволовых типов эпителиальных клеток легких человека, наличие моделей культур на основе органоидов для оценки функционального потенциала эпителиальных стволовых и клеток-предшественников обеспечивает инструмент для сравнительных исследований между мышью и человеком 13,14,15,16,17.

Описаны методы выделения типов эпителиальных клеток из различных областей легкого человека и их культивирования с использованием 3D-органоидной системы для рекапитуляции региональных типов клеток. Аналогичные методы были разработаны для функционального анализа и моделирования заболеваний эпителиальных клеток из других систем органов 18,19,20,21. Эти методы обеспечивают платформу для идентификации региональных эпителиальных клеток-предшественников, для проведения механистических исследований, изучающих их регуляцию и микроокружение, а также для моделирования заболеваний и открытия лекарств. Несмотря на то, что исследования клеток-предшественников эпителия легких, выполненные на животных моделях, могут извлечь выгоду из анализа, либо in vivo, либо in vitro, понимание идентичности клеток-предшественников эпителия легких человека в значительной степени зависит от экстраполяции от модельных организмов. Таким образом, эти методы обеспечивают мост для связи идентичности и поведения типов эпителиальных клеток легких человека с их исследованиями, изучающими регуляцию стволовых / предшественников клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Легочная ткань человека была получена от умерших доноров тканей в соответствии с процедурами согласия, разработанными Международным институтом развития медицины (IIAM) и одобренными Советом по внутреннему обзору Медицинского центра Cedars-Sinai.

1. Обработка тканей для выделения клеток легких из трахео-бронхиальных или мелких дыхательных путей /паренхиматозных (мелких дыхательных путей и альвеол) областей

  1. Подготовьте и автоклавируйте все инструменты для рассечения, стеклянную посуду и соответствующие растворы за один день до изоляции клеток.
  2. При приеме легочной ткани выявляют и разделяют проксимальную и дистальную области. Трахея и бронхи считаются «проксимальными». Для целей этого протокола трахею и первые 2-3 поколения бронхов рассекают и используют для выделения «проксимального» эпителия дыхательных путей. Небольшие дыхательные пути диаметром 2 мм или менее и окружающая паренхиматозная ткань для целей настоящего протокола рассматриваются как «дистальный» эпителий легких (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с обработкой легочной ткани человека, должны выполняться в кабинете биобезопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.

2. Обогащение и подгруппировка мелких дыхательных путей и альвеолярных эпителиальных клеток-предшественников из дистальной легочной ткани

  1. Дистальная подготовка тканей
    1. Поместите дистальную легочную ткань в стерильную чашку Петри (150 х 15 мм). Нарежьте ткань кубиками примерно на 1 см3 кусочка и поместите в чистую пробирку объемом 50 мл.
    2. Промыть ткань 3x с охлажденным HBSS, отбрасывая HBSS промывать каждый раз, чтобы удалить кровь и эпителиальную подкладочную жидкость.
    3. Поместите ткань в новую чашку Петри и смойте насухо стерильными противоворотными салфетками. С помощью щипцов и ножниц удалите как можно больше висцеральной плевры (нежная прозрачная мембрана, покрывающая поверхность легкого).
    4. Используйте ножницы, чтобы измельчить ткань на кусочки диаметром около 2 мм. Переложите измельченную ткань в чистую чашку Петри и измельчите дальше, измельчив ее примерно до размера 1 мм стерильным односторонним лезвием бритвы.
  2. Переваривание ферментов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор либеразы составляет 5 мг/мл (100x), а запас ДНКазы - 2,5 мг/мл (100x) (Таблица материалов).
    1. Добавьте 50 мкг/мл либеразы и 25 мкг/мл ДНКазы в стерильный HBSS в конической пробирке объемом 50 мл.
    2. Переложить примерно 2-3 г измельченной ткани в новую коническую трубку объемом 50 мл с 25 мл HBSS, содержащую либеразу и ДНКазу. Инкубировать в течение 40-60 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием с помощью смесителя, установленного на 900 об/мин. После 30 мин инкубации тритурируйте переваренную ткань с помощью шприца объемом 30 мл без иглы, чтобы избежать образования комков и продолжить инкубацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации с ферментами может варьироваться в зависимости от типа или состояния ткани. Например, ферментативное переваривание нормальной ткани занимает примерно 45 мин. Однако фиброзная ткань из образцов идиопатического легочного фиброза может потребовать более длительного времени инкубации до 60 минут. Поэтому тщательно контролируйте ткани на этом этапе, чтобы предотвратить повреждение поверхностных маркеров, что имеет решающее значение для FACS.
  3. Изоляция одной ячейки
    1. Тритурируйте ткань, втягивая 5x через иглу 16 G, установленную на шприц объемом 30 мл. Втяните тканевую суспензию в широкопроходимую пипетку и пройдите через серию клеточных сетчатых фильтров (500 мкм, 300 мкм, 100 мкм, 70 мкм, 40 мкм) под вакуумным давлением. Промыть ситечко 20 мл буфера HBSS+ для сбора оставшихся клеток. Рецепт буфера HBSS+ можно найти в Таблице материалов.
    2. Добавьте равный объем буфера HBSS+ через 45 мин в фильтрат, чтобы ингибировать активность Либеразы и предотвращать переваривание.
    3. Фильтраты центрифуги при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите и выбросьте супернатант. Добавьте 1 мл буфера лизиса эритроцитов (эритроцитов) в гранулу, аккуратно покачайте трубку, чтобы выбить гранулу, и инкубируйте на льду в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество и время в растворе лизиса эритроцитов зависит от размера гранулы. Важно поддерживать клетки на льду и тщательно контролировать время в растворе лизиса эритроцитов, чтобы предотвратить лизис клеток-мишеней. Если лизиса RBC недостаточно, повторите шаг.
    4. Добавьте 10-20 мл буфера HBSS+ для нейтрализации буфера лизиса эритроцитов. Фильтраты центрифуги при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    5. Если лизированные эритроциты (призрачные клетки) образуют мутный слой над клеточной гранулой, повторно суспендируют гранулу в 10 мл буфера HBSS+ и процеживают суспензию через 70-мкм клеточный сетчатый фильтр для устранения призрачных клеток. Центрифугируйте фильтрат при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и переходите к дальнейшим шагам.
  4. Истощение иммунных клеток и эндотелиальных клеток (необязательный этап)
    1. Истощают эндотелиальные клетки CD31+ и иммунные клетки CD45+ из пула общих клеток, используя микрошарики CD31 и CD45, конъюгированные с моноклональным античеловеческим антителом CD31 и CD45 (изотип мыши IgG1) и колонками LS в соответствии с протоколом производителя (Таблица материалов).
    2. Собирают поток, состоящий преимущественно из эпителиальных и стромальных клеток, в свежую стерильную трубку и центрифугируют его при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выполните подсчет клеток, чтобы определить общее количество ячеек в потоке.
  5. Окрашивание поверхности клеток для флуоресцентной сортировки клеток (FACS)
    1. Повторное суспендирование 1 x 107 клеток на 1 мл буфера HBSS+. Добавляют первичные антитела в необходимой концентрации и инкубируют клетки в течение 30 мин при 4 °C в темноте. В этом исследовании использовались флуорофорные конъюгированные первичные антитела, если не указано иное. Подробная информация об источниках антител и титрах описана в Таблице материалов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HTII-280 в настоящее время является лучшим поверхностным реактивным антителом, которое позволяет подгруппировать дистальные клетки легких в преимущественно дыхательные пути (HTII-280-) и альвеолярные фракции клеток типа 2 (HTII-280+). Предостережение к этой стратегии заключается в том, что клетки AT1 не окрашиваются с помощью этого метода и плохо представлены из-за их хрупкости. Тем не менее, клетки AT1 плохо представлены в дистальных препаратах легких, по-видимому, из-за их хрупкости и потери во время отбора жизнеспособных клеток FACS и, таким образом, представляют собой только редкое загрязнение клеточной фракции дыхательных путей.
    2. Промывайте ячейки, добавляя 3 мл буфера HBSS+ и центрифуги при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    3. При использовании неконъюгированных первичных антител добавляют необходимую концентрацию соответствующего флуорофора конъюгированного вторичного антитела и инкубируют в течение 30 мин на льду. Смывайте избыток вторичных антител путем добавления 3 мл буфера HBSS+ и центрифуги при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    4. Отбросьте супернатантные и повторноуспендированные ячейки в буфере HBSS+ на 1 x 107 клеток/мл. Фильтруйте ячейки в полистирольные трубки объемом 5 мл через крышку сетчатого фильтра, чтобы обеспечить образование одноклеточной суспензии. Добавьте DAPI (1 мкг/мл) для окрашивания проницаемых (мертвых) клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать соответствующие одноцветные и флуоресцентные минус один (FMO) контроль (т.е. коктейль для окрашивания антител минус одно антитело каждое), чтобы свести к минимуму ложные срабатывания во время FACS. В данном исследовании положительные и отрицательные селекционные шарики использовались для эмпирической компенсации перекрытия спектров излучения между флуорофорами (Таблица материалов). FACS обогащают интересующие типы клеток. Жизнеспособные эпителиальные клетки обогащаются на основе их CD45-отрицательного, CD31-отрицательного, CD236-положительного фенотипа поверхности клеток и отрицательного окрашивания для DAPI. Эта фракция эпителиальных клеток может быть дополнительно подгруппирована на основе окрашивания для специфических поверхностных маркеров типа клеток, таких как специфическое окрашивание для HTII-280-положительных клеток, которые обогащены для клеток AT2. Напротив, отрицательный отбор для HTII-280 позволяет обогащать небольшие эпителиальные клетки дыхательных путей, такие как клубные и реснитчатые клетки (рисунок 2).

3. Обогащение и поднастройка эпителиальных клеток-предшественников трахео-бронхиальных дыхательных путей

  1. Подготовка тканей
    1. Рассечение проксимальных дыхательных путей (трахеи/бронхов) из легких. Откройте дыхательные пути по их длине с помощью ножниц, чтобы обнажить просвет и добавить 50 мкг / мл Либеразы, чтобы полностью покрыть ткань.
    2. Инкубировать в течение 20 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием с помощью термомешателя, установленного на 900 об/мин.
    3. Извлеките проксимальные дыхательные пути из трубки центрифуги и поместите ее в стерильную чашку Петри (150 х 15 мм). Аккуратно соскоблите поверхность дыхательных путей с помощью скальпеля, чтобы полностью удалить просветные эпителиальные клетки из ткани.
    4. Вымойте чашку Петри 5 мл стерильного буфера HBSS+, чтобы собрать все смещенные просветные эпителиальные клетки и перенести смещенные клетки в коническую центрифужную трубку объемом 50 мл. Тритурируйте суспензию, вытягивая иглу 5x через 16 G и иглу 18 G, установленную на шприц 10 мл, чтобы получить одноклеточную суспензию.
    5. Центрифугировать суспензию при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С. Повторно суспендируйте гранулу в свежем буфере HBSS+ и храните эти просветные клетки дыхательных путей на льду, готовые к объединению с одноклеточной суспензией, полученной из измельченных проксимальных дыхательных путей на предстоящих этапах.
    6. С помощью ножниц разрежьте оставшуюся трахео-бронхиальную ткань вдоль ее колец, чтобы сформировать небольшие полоски ткани, и перенесите полоски в свежую чашку Петри. Измельчите полоски ткани, используя одностороннее лезвие бритвы, чтобы сделать более мелкие кусочки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку проксимальные дыхательные пути являются хрящевыми, их нельзя измельчать так же мелко, как дистальную легочную ткань.
    7. Перенесите измельченную ткань в трубки C, добавьте 2 мл Liberase в трубку, гарантируя, что ткань погружена. Загрузите трубку C на автоматизированный диссоциатор и запустите Протокол легких человека-2 для дальнейшей механической диссоциации тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциатор, используемый в этом протоколе, предлагает оптимизированную программу, называемую протоколом легких человека-2 для этого конкретного применения (см. Таблицу материалов).
  2. Переваривание ферментов и выделение одиночных клеток
    1. Переложите приблизительно 2 г измельченной проксимальной ткани из трубки С в каждую 50 мл конической центрифужной трубки и добавьте 50 мкг/мл либеразы и 25 мкг/мл раствора ДНКазы в каждую пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения эффективной диссоциации трубы не должны заполняться выше отметки 30 мл.
    2. Инкубировать измельченную ткань в течение 45 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием с помощью смесителя, установленного при 900 об/мин.
    3. Пропустите диссоциированную тканевую суспензию через серию клеточных сетчатых фильтров (500 мкм, 300 мкм, 100 мкм, 70 мкм, 40 мкм) под вакуумным давлением, как упоминалось выше, и соберите поток. Промыть ситечко 20 мл буфера HBSS+ для сбора оставшихся клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку проксимальная ткань является хрящевой и громоздкой по сравнению с дистальной тканью, существует более высокая вероятность засорения фильтров. Использование воронки может помочь предотвратить переполнение жидкости при прохождении через ситечки.
    4. Добавьте равный объем буфера HBSS+ в фильтрат, чтобы ингибировать активность либеразы и предотвращать переваривание. Добавьте изолированные просветные проксимальные клетки дыхательных путей от 3,1,5 к клеточной суспензии на этом этапе.
    5. Центрифугировать комбинированную клеточную суспензию при 500 х г в течение 10 мин. Удалите супернатант и повторите промывку клеток в буфере HBSS+. Выполните истощение иммунных клеток CD45+ и эндотелиальных клеток CD31+ , как упоминалось выше в 2.4 (необязательный шаг).
    6. Метод окрашивания аналогичен дистальной легочной ткани, следуйте шагам, описанным в 2.5. Обогащайте жизнеспособные эпителиальные клетки на основе их CD45-отрицательного, CD31-отрицательного, CD236-положительного фенотипа поверхности клеток и отрицательного окрашивания для DAPI.
    7. Далее подмножество фракции эпителиальных клеток основано на окрашивании для специфических поверхностных маркеров типа клеток, таких как NGFR, что позволяет обогащать базальные (NGFR положительные) и небазальные (NGFR отрицательные; секреторные, реснитчатые, нейроэндокринные) типы клеток (рисунок 3).

4. Органоидная культура

  1. Добавьте 5000 (это число может быть скорректировано для получения желаемой плотности эпителиальных органоидов) отсортированных проксимальных или дистальных эпителиальных клеток в стерильную трубку объемом 1,5 мл вместе с 7,5 х 104 клетками MRC-5 (клеточная линия фибробластов легкого человека). Эпителиально-мезенхимальные взаимодействия имеют решающее значение для расширения клеток-предшественников.
  2. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вручную подтвердить количество клеток, полученных от сортировщика, чтобы обеспечить точность органоидной колониеобразующей эффективности.
  3. Осторожно удалите и выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 50 мкл ледяной среды, дополненной антибиотиками. Держите клеточную суспензию на льду.
  4. Добавьте во флакон 50 мкл ледяного холодного 1x фактора роста, обедненного матричной средой базальной мембраны, и аккуратно пипеткой суспензию на льду для смешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать холодные среды и поддерживать клетки на льду, чтобы избежать преждевременной полимеризации матричной среды базальной мембраны.
  5. Перенесите клеточную суспензию на культуру клеток размером 0,4 мкм в пластину из 24 лунок (1,4 x 104 клетки/см2), следя за тем, чтобы избежать введения пузырьков воздуха.
  6. Инкубировать при 37 °C в течение 30-45 мин, чтобы матрица затвердела.
  7. Добавьте в лунку 600 мкл предварительно подогретой питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среду дополняли антимикотическими средствами (0,4%) и стрептококком Ручки (1%) в течение первых 24 ч после посева и ингибитором 10 мкМ рокиназы в течение первых 72 ч.
  8. Культивирование при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе в течение 30 дней, в течение которых среду следует менять каждые 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность культуры может быть изменена в зависимости от цели эксперимента. Более длинные конечные точки используются для изучения дифференциации, тогда как более короткие конечные точки 7 дней, 14 дней и т. Д. Могут быть использованы, если цель эксперимента не заключается в достижении полной дифференциации.
  9. Добавляют 10 мкМ ингибитора TGFβ в культуральную среду в течение 15 дней для поддержания клеток в пролиферативной фазе и подавления чрезмерного роста фибробластов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты различаются в зависимости от культуральной среды, используемой для анализа. Например, результаты, показанные в настоящем описании, были получены с использованием Pneumacult-ALI Medium, что приводит к генерации крупных органоидов из дистального легкого, хорошо дифференцированных и более крупных органоидов из проксимального легкого.

5. Органоидное окрашивание

  1. Фиксация и встраивание органоидов
    1. Аспирировать среду как из верхней, так и из нижней трансмембранной вставной камеры и промыть один раз теплым PBS.
    2. Зафиксируйте культуры, поместив 300 мкл PFA (2% мас./об.) во вставку и 500 мкл в скважину в течение 1 часа при 37°C. Снимите фиксатор и промойте теплым PBS, следя за тем, чтобы не выбить матричную пробку мембраны basememt.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные органоиды могут храниться в погружении в PBS при 4 °C в течение одной-двух недель перед началом дальнейших этапов.
    3. Аспирируйте PBS, переверните вставку и аккуратно обрежьте мембрану вставки по ее периферии. Используя щипцы, удалите трансвелловую мембрану, следя за тем, чтобы не потревожить матричную пробку.
    4. В чашке Петри коснитесь вставки, чтобы восстановить матричную заглушку.
    5. Добавьте каплю геля для обработки образца, такого как гистогель (поддерживаемый при 37 °C), в матричную пробку и выдерживайте при 4 °C до тех пор, пока гель не затвердеет.
    6. Переложите пробку на встраиваемую кассету, обезвоживайте за счет увеличения концентрации этанола (70, 90 и 100%), очищают в ксилоле и встраивают в парафиновый воск.
    7. Вырежьте 7 мкм секции на микротоме и соберите на положительно заряженных слайдах.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов
    1. Поместите слайды при 65 °C в течение 30 мин до депаракса.
    2. Депарафинизируют срезы путем погружения в ксилол и регидратируют за счет снижения концентрации этанола.
    3. Выполняют извлечение высокотемпературного антигена в растворе антигенного демаскирующего основания лимонной кислоты с использованием коммерчески доступного ретривера путем погружения слайдов в раствор на 15 мин (Таблица материалов).
    4. Окружите ткань гидрофобным барьером с помощью пап-ручки.
    5. Блокировать неспецифическое окрашивание между первичными антителами и тканью, инкубируя в блокирующем буфере.
    6. Инкубировать срезы в соответствующей концентрации первичных антител, разведенных в инкубационном растворе на ночь при 4 °С в увлажненной камере.
    7. Промывайте секции 3x при комнатной температуре с помощью промывочного буфера.
    8. Инкубировать в соответствующей концентрации фторхром конъюгированное вторичное антитело в течение 1 ч при комнатной температуре.
    9. Промыть секции 3x при комнатной температуре с 0,1% Tween 20-TBS. Инкубировать секции в течение 5 мин в DAPI (1 мкг/мл). Промыть секции один раз в TBS (Tris-буферизованный физиологический раствор) с 0,1% Tween 20, высушить и смонтировать в монтажном растворе (рисунок 4 и рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходное и оптимальное рабочее разведение первичных и вторичных антител, используемых для иммунофлуоресцентного окрашивания, включены в Таблицу материалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Источник легочной ткани
Трахея и внелегочный бронх (рисунок 1А) использовались в качестве исходной ткани для выделения эпителиальных клеток проксимальных дыхательных путей и последующей генерации проксимальных органоидов. Дистальная легочная ткань, которая включает в себя как паренхиму, так и мелкие дыхательные пути диаметром менее 2 мм (рисунок 1A), использовалась для выделения мелких дыхательных путей и альвеолярных эпителиальных клеток (ди...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описан надежный метод выделения определенных субпопуляций клеток легких из легочной ткани человека для молекулярного или функционального анализа и моделирования заболеваний. К критическим элементам методов относятся способность достигать диссоциации тканей с сохранением поверхностных эпитопов, позволяющих опосредованное антителами обогащение свежеизолированных клеток, и оптимизация методов культивирования для эффективной генерации регионально-специфических эпителиальных органоидов. Мы фокусируемся на восстановлении и обо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы ценим поддержку со стороны Мидзуно Такако в окрашивании IFC и H и E, Ванессы Гарсия в секционировании тканей и Аники С. Чандрасекаран за помощь в подготовке рукописи. Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) и консорциумом Celgene IDEAL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cell Isolation
10 мл Стерильные шприцы, Luer-Lok TipFisher scientificBD 309646
30 мл Стерильные шприцы, Luer-Lok TipVWRBD302832
Biohazard bagsVWR89495-440
Biohazard bagsVWR89495-440
соединительное кольцоPluriselect41-50000-03
Дезоксирибонуклеаза (лот#SLBF7798V)AldrichDN25-1G
Одноразовые чашки ПетриCorning/Falcon25373-187
ВоронкаPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Research Gradesigma Aldrich5401127001
игла 16GVWR305198
игла 18GVWR305199
PluriStrainer 100 &микро; m (Клеточный фильтр)Pluriselect43-50100-51
PluriStrainer 300 &микро; m (Клеточный фильтр)Pluriselect43-50300-03
PluriStrainer 40 &микро; m (Клеточный фильтр)Pluriselect43-50040-51
PluriStrainer 500 &микро; m (Клеточный фильтр)Pluriselect43-50500-03
PluriStrainer 70 &микро; m (Клеточный фильтр)Pluriselect43-50070-51
Бритвенные лезвияVWR55411-050
Буфер для лизиса эритроцитовeBioscience00-4333-57
Оборудование s
GentleMACS C TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Тканевый процессор
LS КолонкиMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ТермомиксерEppendorf05-412-503
ТермомиксерEppendorf05-412-503
HBSS+ Буфер
Амфотерицин BThermo fisher Scientific152900182мл
ЭДТА (0,5 М), pH 8,0, без РНКазыThermo fisher ScientificAM9260G500&микро; l
Фетальная бычья сывороткаGemini Bio-Products100-10610 мл
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 млVWR45000-456500 мл флакон
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805 мл
Пенициллин-стрептомицин-неомицин (PSN) Смесь антибиотиковThermo fisher scientific156400555 мл
Список антитела для FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) антителоBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-mouse Ig, K/ Набор отрицательных контрольных частицFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, человекMiltenyi Biotec130-091-93520&микро; l/ 107 всего клеток
CD45 MicroBeads, человекMiltenyi Biotec130-045-80120&микро; l/ 107 всего
клеток DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC античеловеческий CD235aBioLegend3491041:100
FITC античеловеческий CD31BioLegend3031041:100
FITC античеловеческий CD45BioLegend3040541:100
FITC антимышиный антитело IgMBioLegend4065061:500
Мышиный IgM против человека HT2-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2801:300
PE античеловеческий CD271(NGFR)BioLegend3451061:50
Состав органоидных культуральных сред
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MediumStemcell Technologies5001
Малый эпителиальный воздуховод Клеточная средадля роста PromoCellC-21170
ThinCert Вставки для культуры тканей, стерильныеGreiner Bio-One662641
Y-27632 (ингибитор ROCK) 100mM сток (1000x)Stemcell Technologies72302
Мышиная базальная среда:
Амфотерицин BThermo fisher scientific1529001850 &микро; l
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 мл
фетальной бычьей сывороткиGemini Bio-Products100-1065 мл
инсулин-трансферрин-селен (ИТС-G) (100X)ThermoFisher научный41400045500 &микро; l
Смесь антибиотиков пенициллин-стрептомицин-неомицин (PSN)Thermo fisher scientific15640055500 &m; l
SB431542 ингибитор пути TGF-β (запас 100 мМ)Стволовые клетки722345 & микро; l
Список антител для иммуногистохимического
раствора для демаскирования антигена, на основе лимонной кислотыVectorH-3300937 µ l в 100 мл воды
HistogelThermo ScientificHG-4000-012
Первичные антитела
Anti HT2-280TerracebiotechTB-27AHT2-2801:500
FOXJ1 Моноклональное антитело (2A5)Thermo Fisher Scientific14-9965-821:300
Человеческий утероглобин/SCGB1A1 АнтителаR и D системыMAB42181:300
Кератин 5 Поликлональное куриное антитело, очищенное [Poly9059]Biolegend9059011:500
Моноклональное антитело MUC5AC (45M1)Thermo Fisher ScientificMA5-121781:300
PDPN / Подопланин антитело (клон 8.1.1)LifeSpan BiosciencesLS-C143022-1001:300
Очищенный мышиный анти-E-кадгеринBD Biosciences6101821:1000
Sox-2 АнтителоSanta Cruz биотехнологииsc-3659641:300
Вторичные антитела
Donkey antirabbit lgG, 488Thermo Fisher ScientificA-212061:500
FITC антимышиное антителоIgM BioLegend4065061:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-211131:500
Козье антимышиное IgG1 Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211211:500
Козье антимышиное IgG2a Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211311:500
Козье антимышиное IgG2a Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211341:500
Козье антимышиное антитело IgG2b с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211441:500
Буферы
Иммуногистохимический блокирующий раствор3% BSA, o.4% Triton-x100 в TBS (физиологический раствор на основе триса)
Иммуногистохимический инкубационный раствор3% BSA, ).1% Triton-X100 в TBS
Иммуногистохимический промывочный растворTBS с 0,1% Tween 20
sigma

Ссылки

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  3. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  4. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  5. Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
  6. Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
  7. Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
  8. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  9. Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050(2008).
  10. McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
  11. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
  12. Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
  13. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
  14. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634(2018).
  17. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  18. Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  19. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  20. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
  21. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
  22. Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
  23. Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
  24. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  27. Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NGFRHTII 2803D
Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.