Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ дегрануляции тучных клеток ex vivo с использованием сырых клеток перитонеального экссудата и стимуляции естественными антигенами

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61556

⸱

27 апреля 2021 г.

 ,  , 
1College of Pharmacy, Chungnam National University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали метод дегрануляции тучных клеток ex vivo, проводимый путем инкубации сырых клеток перитонеального экссудата, выделенных из мышей, обработанных представляющим интерес фармакологическим агентом и предварительно введенных антидинитрофенолом (ДНП) IgE с ДНФ на белке-носителе.

Аннотация

Стабилизаторы тучных клеток являются неотъемлемой частью лекарств от аллергии. Пассивная системная анафилаксия (ПСА) — это анализ на животных, широко используемый для изучения влияния фармакологического агента, представляющего интерес, на тучные клетки in vivo. Поскольку анафилактические симптомы в первую очередь связаны с экзоцитозом гранул тучных клеток, предполагается, что агент, вызывающий улучшение симптомов, обладает стабилизирующей активностью тучных клеток. Несмотря на это, целесообразно подтвердить свою активность путем прямой демонстрации снижения функциональной активности тучных клеток после его лечения. Для этого обычно используются анализы дегрануляции in vitro с использованием иммортализированной линии тучных клеток или культивируемых первичных тучных клеток. Результаты тестов in vitro и in vivo не всегда могут быть похожи друг на друга; Тем не менее, поскольку условия лечения (например, доза лечения, время, окружающая среда) для анализов in vitro часто отличаются от условий для анализа in vivo, таких как ПСА. В стремлении провести анализ in vitro (или ex vivo), чтобы более точно отразить влияние фармакологического агента на тучные клетки in vivo, мы разработали анализ дегрануляции тучных клеток ex vivo, в котором сырые перитонеальные клетки экссудата (PEC), выделенные у мышей, обработанные агентом и получившие антидинитрофенол (ДНП) IgE, инкубировали непосредственно с DNP на белке-носителе. Оказалось, что анализ не только полезен для валидации стабилизирующей активности тучных клеток фармакологического агента, указанного в анализе in vivo, но также практичен и легко воспроизводим.

Введение

Тучные клетки играют центральную роль в развитии аллергии 1,2. Когда IgE, расположенный на поверхности тучных клеток в результате взаимодействия с высокоаффинным рецептором IgE (FcεRI), сталкивается с родственным аллергеном, возникает сигнальный каскад, вызывающий высвобождение гранул. В результате, различные эффекторные молекулы аллергии, включая моноамины (например, гистамин, серотонин), цитокины (например, TNF-α) и протеолитические ферменты (например, триптаза, химаза), высвобождаются, вызывая ряд иммунологических, неврологических и сосудомышечных реакций 3,4.

Класс фармацевтических препаратов называется стабилизатором тучных клеток, который облегчает симптомы аллергии за счет ослабленияфункции тучных клеток. Пассивная системная анафилаксия (ПСА) — это животная модель, часто используемая для исследования стабилизирующей активности фармакологических агентов в тучных клетках. Поскольку анафилактические симптомы возникают в первую очередь в результате активации тучных клеток после взаимодействия пассивно перенесенного гаптен-специфического IgE с гаптеном на белке-носителе, введенном животному позже, хорошо известно, что фармакологическое средство, представляющее интерес, обладает стабилизирующей активностью тучных клеток, когда его лечение приводит к улучшению симптомов6. Тем не менее, часто бывает крайне важно непосредственно продемонстрировать нарушение функции тучных клеток агентом в отдельном эксперименте, чтобы исключить возможность того, что улучшение симптомов происходит от механизма, отличного от подавления функции тучных клеток.

Анализ дегрануляции тучных клеток, который проводят путем стимуляции тучных клеток химическим реагентом или специфическим антигеном IgE, образующим комплекс с FcεRI на поверхности тучных клеток для индуцирования экзоцитоза секреторных гранул (т.е. дегрануляции), обычно используется для определения стабилизирующей активности тучных клеток фармакологического реагента in vitro7. В этом анализе используется несколько типов клеток, в том числе клеточнаялиния 8 базофильного лейкоза крыс (RBL), тучные клетки костного мозга (BMMC)9 и тучные клетки перитонеальных клеток (PCMC)10. Несмотря на свою полезность, поскольку можно легко получить большое количество клеток, RBL является иммортализованной линией раковых клеток, клеточные свойства которых больше не похожи на свойства тучных клеток в организме. Получение достаточного количества BMMC или PCMC, даже если их клеточные свойства могут больше напоминать свойства тучных клеток в организме, часто является дорогостоящим и трудоемким.

Анализ дегрануляции с использованием очищенных первичных тучных клеток является желательной альтернативой11. Тем не менее, использование такого анализа не получило широкого распространения в качестве легкого метода очистки тучных клеток из тканей животных, в частности из тканей мышей, с высоким выходом, и чистота еще не доступна. Более того, поскольку концентрация и продолжительность лечения фармакологическим средством для ингибирования функции тучных клеток in vitro не всегда могут совпадать с результатами in vivo, результаты, полученные с помощью анализа дегрануляции in vitro, могут искажать результаты анализа in vivo, такого как ПСА, и наоборот. Таким образом, новый анализ дегрануляции, не только близко имитирующий способ активации тучных клеток in vivo, но и точно отражающий эффекты фармакологического реагента, оказываемого на тучные клетки in vivo, пользуется большим спросом. Чтобы удовлетворить эти потребности, мы разработали метод дегрануляции тучных клеток ex vivo, в котором тучные клетки в перитонеальных клетках экссудата (ПЭК), выделенных у мышей, обработанных представляющим интерес фармакологическим средством и предварительно введенных IgE, специфичных к динитрофенолу (ДНФ), стимулируются ДНФ-конъюгированным бычьим сывороточным альбумином (БСА).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями, предоставленными IACUC (Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию) Национального университета Чуннам (номер протокола для животных: CNU-00996).

1. Количественное определение молекул, специфичных для тучных клеток, в лизате сырых ПЭК

  1. Изолируйте клетки из брюшинной полости мыши12.
    1. Обезболите мышь (8 недель, самец, BALB/C) изофлураном. Усыпление через вывих шейки матки.
    2. Поместите мышь на поролоновый блок. Протрите брюшную полость 70% этанолом.
    3. Разрежьте брюшную кожу в продольном направлении ножницами с тупым краем. Снимите кожу с мыши с помощью щипцов и ножниц.
    4. Введите 6 мл ледяного буфера Tyrode's B13 в брюшную полость с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 26 G. Вводите иглу аккуратно, чтобы не задеть органы.
    5. Массируйте брюшную полость мыши в течение 60-90 с, чтобы собрать клетки брюшины в буфер B Tyrode. Делайте это аккуратно, чтобы не повредить кровеносные сосуды.
    6. Введите иглу (20 G), прикрепленную к шприцу объемом 10 мл, скосите вверх. Медленно отсасывайте жидкость из брюшной полости (обычно 5-6 мл).
    7. Извлеките иглу из шприца. Налейте перитонеальную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл. Держите трубку на льду.
    8. Повторите шаги 1.1.4 - 1.1.7.
    9. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 минут при 10 °C. Ресуспендируйте клетки в 1 мл 1x буфера для лизиса эритроцитов (эритроцитов). Держите клетки на льду в течение 3 минут.
    10. Разбавьте клеточную суспензию 2 мл В-буфера Tyrode. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 минут при 10 °C.
    11. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 0,5 мл буфера А Тайроде13.
    12. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте количество ячеек до 5 x 106/мл с помощью буфера A Tyrode.
  2. Готовят обедненные тучными ячейками ПЭК с помощью магнитной системы очистки ячеек14.
    1. Центрифуга 5 x 105 сырых PEC при 300 x g в течение 5 мин при 10 °C. Ресуспендируйте гранулу в 200 мкл буфера для очистки клеток PBSBE (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,4).
    2. Добавьте 1 мкл блокатора Fc (0,5 мг/мл) в клетки, чтобы предотвратить неспецифическое связывание моноклонального антитела (mAb) против c-kit, которое будет добавлено далее. Держите клетки на льду в течение 5 минут.
    3. Добавьте 1 мкл биотинилированного антимышиного c-kit mAb15 (0,5 мг/мл). Держите клетки на льду в течение 10 минут.
    4. Добавьте 2 мл буфера PBSBE. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин при 10 °C.
    5. Удалите надосадочную жидкость. Еще раз промойте клетки 2 мл буфера PBSBE.
    6. Ресуспендируйте клетки в 90 мкл буфера PBSBE. Добавьте 10 мкл стрептавидин-конъюгированных микрогранул. Держите клетки на льду в течение 15 минут.
    7. Добавьте 2 мл буфера PBSBE. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин при 10 °C.
    8. Загрузите 500 μл буфера PBSBE на среднюю магнитную колонку во время вращения. Дайте буферу пройти через столбец.
    9. Удалите надосадочную жидкость после центрифугирования. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл буфера PBSBE.
    10. Загрузите ячейки в столбец. Собирайте ячейки, свободно проходящие по столбцу.
    11. Промойте колонку 500 мкл буфера PBSBE. Снова соберите ячейки, проходящие через столбец.
    12. Повторите шаг 1.2.11.
    13. Соедините ячейки из пунктов 1.2.9-1.2.11 в одну пробирку. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин при 10 °C.
    14. Ресуспендируйте элементы в буфере A Тайрода. Посчитайте клетки. Отрегулируйте количество ячеек до 5 x 106 клеток/мл.
  3. Приготовьте лизат ПЭК.
    1. Пластинчатые PEC (например, 5 x 105) в планшете с круглым дном 96 лунок соответственно. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 2 минут при 10 °C для сбора клеток. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    2. Добавьте в клеточную гранулу 100 мкл буфера для лизиса клеток. Восстановите суспендию клеток, осторожно проводя пипетирование вверх и вниз несколько раз. Держите тарелку на льду в течение 60 минут.
    3. Центрифугируйте планшет при давлении 300 x g в течение 5 минут при 10 °C для удаления клеточного мусора. Перенесите надосадочную жидкость (лизат клеток) в новую 96-луночную пластину.
  4. Измерьте ферментативную активность β-гексозаминидазы16.
    1. Добавьте лизат клеток (50 мкл) в предварительно подогретый раствор субстрата β-гексозаминидазы (50 мкл) в 96-луночный микропланшет. Аккуратно перемешайте их пипеткой.
    2. Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 °C. Добавьте 50 μL стоп-раствора (100 мМ глицина, pH 10,7) через 30 минут, чтобы завершить ферментную реакцию.
    3. Считывание наружного диаметра реакционных смесей с помощью УФ-видимого абсорбционного считывателя микропланшетов в режиме двойной длины волны; 405 нм для определения уровня ферментной реакции и 620 нм для автоматического вычитания фона соответственно.
  5. Измерьте концентрацию гистамина17.
    1. Перенесите 100 мкл очищенных клеточных лизатов на пластину с антигистаминовым покрытием mAb, входящую в комплект для гистаминового ИФА. Проводите конкурентный анализ гистамина методом ИФА в соответствии с инструкцией производителя.
    2. Считывание O.D. образцов с помощью УФ-видимого считывателя поглощающих микропланшетов на длине волны 450 нм.
  6. Определение соотношения тучных клеток в ПЭК с помощью проточной цитометрии18.
    1. Переложите 1 x 105 сырых или истощенных мачтовыми ячейками PEC в круглую поддонную 96-луночную пластину. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 2 мин при 10 °C.
    2. Ресуспендируйте элементы в 50 мкл буфера FACS. Добавьте 1 мкл антимышиного c-kit (0,5 мг/мл) и антимышиного IgE mAbs (0,5 мг/мл).
    3. Кратковременно похлопайте клетки в вихре. Держите клетки на льду в течение 20 минут в темноте.
    4. Заполните лунки 150 μл буфера FACS. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 2 мин при 10 °C. Выбросьте буфер, быстро перевернув пластину.
    5. Ресуспендируйте клетки 150 мкл буфера FACS, содержащего йодид пропидия (1 мкг/мл). Анализируйте клетки с помощью проточного цитометра.

2. Анализ дегрануляции тучных клеток с использованием сырых ПЭК

  1. Определите степень дегрануляции тучных клеток (% дегрануляции).
    1. Ввести 3 мышам BALB/C (8 недель, самец) внутривенно (в/в) 3 г анти-DNP mAb (мышиного IgE). Изолируйте ПЭК через день после инъекции Ab (см. шаг 1.1).
    2. Тарелка 90 мкл сырых ПЭК (5,5 x 106/мл) в плоскодонной 96-луночной плите (всего 4 лунки). Инкубируйте планшет в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 °C CO2 в течение 30 минут.
    3. Добавьте 10 мкл DNP-BSA (5 нг/мл в 1x PBS) в лунки, содержащие ПЭК. Инкубируйте планшет в течение 10 минут в инкубаторе с температурой 37 °CCO2 .
    4. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 5 минут при 10 °C сразу после инкубации. Осторожно принимайте надосадочную жидкость (100 μл) с помощью пипетки. Сохраните их в новой 96-луночной пластине с круглым дном на льду.
    5. Добавьте 100 мкл буфера для лизиса клеток (0,1% Triton X-100 в 1 x PBS, pH 7,4) в лунки микропланшетов, содержащие PEC. Держите тарелку на льду в течение 60 минут.
    6. Проведите анализ на β-гексозаминидазу.
      1. Возьмите соответственно два набора надосадочной жидкости и соответствующие клеточные лизаты из четырех, которые хранились во льду после анализа дегрануляции (см. шаги 2.1.4 и 2.1.5). Разделите надосадочную жидкость и лизат клеток на две отдельные лунки (по 50 мкл каждая) для дублирования анализа.
      2. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл субстрата β-гексозаминидазы. Выдержать тарелку при температуре 37 °C в течение 30 минут. Добавьте в реакционную смесь 50 мкл стоп-раствора (100 мМ глицина, pH 10,7).
      3. Прочтите O.D. реакционных смесей (см. шаг 1.4.3). Рассчитайте степень дегрануляции тучных клеток следующим образом.
        % Дегрануляция =надосадочная жидкость /(надосадочная жидкость +лизат наружного диаметра) X 100%
    7. Проведите анализ на гистамин.
      1. Добавьте 100 мкл 1x PBS еще в две лунки надосадочной жидкости и соответствующие клеточные лизаты, сохраненные после дегрануляции, чтобы довести общий объем образцов до 200 мкл. Разделите каждый образец на две отдельные лунки в планшете для гистаминового ИФА, входящем в комплект для гистаминового ИФА.
      2. Проводите ИФА-анализ в соответствии с инструкцией производителя. Считывание O.D. образцов с помощью УФ-видимого считывателя поглощающих микропланшетов на длине волны 450 нм. Рассчитайте степень дегрануляции, как указано в пункте 2.1.6.3.
        % Дегрануляция = [гистамин]sup /([гистамин]sup + [гистамин]лизат) X 100%
  2. Оцените влияние противоаллергических препаратов на тучные клетки, воздействующие in vivo, с помощью анализа дегрануляции тучных клеток ex vivo.
    1. Вводите перорально (.о.) 200 мкл дексаметазона19 (DEX) и кетотифена20 (KET) соответственно мышам (в возрасте 6 недель, самцы) один раз в день в течение 3 дней (6 мышей в группе).
    2. Введите мышам внутривенно (в/в) 3 г анти-DNP IgE после3-й процедуры. Разделите каждую группу мышей на две отдельные клетки (по 3 мыши в клетке); один для анализа ПСА, а другой для анализа дегрануляции тучных клеток ex vivo.
    3. Проведение анализа на ПСА
      1. Вводите мышам DNP-BSA (80 мкг) через день после инъекции анти-DNP IgE. Измеряйте температуру тела ректальным термометром каждые 15 минут в течение 1 часа, начиная сразу после инъекции DNP-BSA.
      2. Возьмите кровь через сутки после инъекции DNP-BSA. Измерьте уровень MCPT-1 в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа.
    4. Провести анализ дегрануляции тучных клеток ex vivo.
      1. Изолируйте ПЭК у мышей через день после введения анти-ДНФ IgE. Подсчитайте количество изолированных УИК.
      2. Тарелка 90 мкл сырых ПЭК (5,5 x 106/мл) в 96-луночной пластине (4 лунки на мышь). Инкубируйте планшеты в инкубаторе с влажной концентрациейCO2 при температуре 37 °C в течение 30 минут.
      3. Добавьте 10 мкл DNP-BSA (5 нг/мл). Инкубируйте планшет в течение 10 минут при температуре 37 °C увлажненногоCO2 инкубаторе.
      4. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 5 минут при 10 °C. Осторожно принимайте надосадочную жидкость (100 мкл), оставляя клетки в лунках.
      5. Добавьте в лунки 100 мкл буфера для лизиса клеток. Выдержать тарелку на льду в течение 60 минут.
      6. Проводят анализ на β-гексозаминидазу и анализ гистамина методом ИФА, как описано в пунктах 2.1.6 и 2.1.7. Рассчитайте % дегрануляции, как на шаге 2.1.6.3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение оптимального количества ПЭК для анализа дегрануляции тучных клеток ex vivo

Тучные ячейки (c-kit+· Двойные положительные клетки IgE+)15 составляют лишь около 2% ПЭК (рис. 1А). Оценивая максимальные уровни молекул, специфичных для тучных клеток, которые должны быть обнаружены в надосадочной жидкости культур, исходя из предположения, что 100% гранул были высвобождены тучными клетками в ПЭК, мы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Вывод о том, что анализ дегрануляции тучных клеток может быть проведен с относительно небольшим количеством сырых мышиных ПЭК, имеет большое значение. Несмотря на то, что ПЭК должен быть отличным источником первичных тучных клеток мыши, он требует очистки тучных клеток в ПЭК. Несмотря на то, что градиентная среда плотности, такая как Percoll25 , была успешно использована для очистки тучных клеток от тучных клеток крыс, ее использование для очистки перитонеальных т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Благодарим господина Ли Вонхи и Ли Ынджу за их техническую и административную помощь. Мы также благодарим доктора Тхи Минь Нгует Нгуен за ее содержательные комментарии. Эта работа была поддержана исследовательскими грантами от Национального университета Чхуннам (CNU Research Grant 2017-2098-01) и от Национального исследовательского фонда Кореи (NRF-2019R1F1A1061894 и NRF-2019M3A9G4067293).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл шприц1757589701
1,5 мл микропробиркаHisolMT-15003
10 мл шприц1757593161
15 мл коническая трубкаThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & ИнновацияBPB-9121-500mL
4-нитрофенил-N-ацетил-&бета;-D-глюкозаминидSIGMAN9376
5 мл полистирольная трубка с круглым дномLife sciences352003
50 мл коническая трубкаThermo Fisher scientific14-959-49A
Алюминий FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)Biolegend135129держать при 2-8°С; C
Антимышиный IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81держать на уровне 2-8° C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGдержать при -20°С;
C ЦентрифугаHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
ДексаметазонSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360держать при -20°С; C
EDTABiofactPB131-500
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаThermo Fisher научный11455035
желатинSIGMAG1890
ГлицинJUNSEI27185-0350
гемоцитометрZEISS176045
HEPESThermo Fisher научный15630130
Гистамин ИФА наборAbcamGK3275957-4держать при 2-8°; C
Мешалка с подогревомLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
кетотифен фумаратсоль SIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitThermo Fisher scientific88-7503-22держать на 2-8° C
Мышиный блок FcBD Biosciences553141держать на уровне 2-8°С; C
Пропидий йодиолSIGMA81845держать на уровне 2-8°С; C
Буфер для лизиса эритроцитовBiolegend420301
Круглодонный 96 лунокSPL-life sciences30096
Одноразовый шприцевой фильтрStartoriusag16555
Стрептавидин микрогранулыMilteryiBiotec130-048-101держать на уровне 2-8° C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Водяная баняCHANGSHINSCIENCE190107

Ссылки

  1. Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
  2. Holgate, S., et al. The anti-inflammatory effects of omalizumab confirm the central role of IgE in allergic inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 115 (3), 459-465 (2005).
  3. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693(2012).
  4. Roth, K., Chen, W. M., Lin, T. J. Positive and negative regulatory mechanisms in high-affinity IgE receptor-mediated mast cell activation. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 56 (6), 385-399 (2008).
  5. Finn, D., Walsh, J. Twenty-first century mast cell stabilizers. British Journal of Pharmacology. 170 (1), 23-37 (2013).
  6. Lu, Y., et al. Emodin, a naturally occurring anthraquinone derivative, suppresses IgE-mediated anaphylactic reaction and mast cell activation. Biochemical Pharmacology. 82 (11), 1700-1708 (2011).
  7. Demo, S., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 36 (4), 340-348 (1999).
  8. Passante, E., Ehrhardt, C., Sheridan, H., Frankish, N. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release. Inflammation Research. 58 (9), 611-618 (2009).
  9. Fukuishi, N., et al. Does β-hexosaminidase function only as a degranulation indicator in mast cells? The primary role of β-hexosaminidase in mast cell granules. The Journal of Immunology. 193 (4), 1886-1894 (2014).
  10. Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. The Journal of Immunology. 178 (10), 6465-6475 (2007).
  11. Arock, M., Le Nours, A., Malbec, O., Daëron, M. Innate Immunity. , Springer. 241-254 (2008).
  12. Befus, A., Pearce, F., Gauldie, J., Horsewood, P., Bienenstock, J. Mucosal mast cells. I. Isolation and functional characteristics of rat intestinal mast cells. The Journal of Immunology. 128 (6), 2475-2480 (1982).
  13. Yoon, S. C., et al. Anti-allergic and anti-inflammatory effects of aqueous extract of Pogostemon cablin. International Journal of Molecular Medicien. 37 (1), 217-224 (2016).
  14. Mierke, C. T., et al. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. Journal of Experimental Medicien. 192 (6), 801-812 (2000).
  15. Hermes, B., et al. Altered expression of mast cell chymase and tryptase and of c-Kit in human cutaneous scar tissue. Journal of Investigative Dermatology. 114 (1), 51-55 (2000).
  16. Wendeler, M., Sandhoff, K. J. Hexosaminidase assays. Glycoconjugate Journal. 26 (8), 945-952 (2009).
  17. Russell, M., et al. Learned histamine release. Science. 225 (4663), 733-734 (1984).
  18. Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
  19. Kitamura, Y., et al. Dexamethasone suppresses histamine synthesis by repressing both transcription and activity of HDC in allergic rats. Allergology International. 55 (3), 279-286 (2006).
  20. Grant, S. M., Goa, K. L., Fitton, A., Sorkin, E. M. Ketotifen. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in asthma and allergic disorder. Drugs. 40 (3), 412-448 (1990).
  21. Cook, E., Stahl, J., Barney, N., Graziano, F. Mechanisms of antihistamines and mast cell stabilizers in ocular allergic inflammation. Current Drug Targets-Inflammation & Allergy. 1 (2), 167-180 (2002).
  22. Schoch, C. In vitro inhibition of human conjunctival mast-cell degranulation by ketotifen. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 75-81 (2003).
  23. Franchimont, D., et al. Inhibition of Th1 immune response by glucocorticoids: dexamethasone selectively inhibits IL-12-induced Stat4 phosphorylation in T lymphocytes. The Journal of Immunology. 164 (4), 1768-1774 (2000).
  24. Simmons, C. P., et al. The clinical benefit of adjunctive dexamethasone in tuberculous meningitis is not associated with measurable attenuation of peripheral or local immune responses. The Journal of Immunology. 175 (1), 579-590 (2005).
  25. Cavalher-Machado, S. C., et al. The anti-allergic activity of the acetate fraction of Schinus terebinthifolius leaves in IgE induced mice paw edema and pleurisy. International Immunopharmacology. 8 (11), 1552-1560 (2008).
  26. Dhakal, H., et al. Gomisin M2 inhibits mast cell-mediated allergic inflammation via attenuation of FcεRI-mediated Lyn and Fyn activation and intracellular calcium levels. Frontiers in Pharmacology. 10, 869(2019).
  27. Galli, S. J., Wedemeyer, J., Tsai, M. Analyzing the roles of mast cells and basophils in host defense and other biological responses. International Journal of Hematology. 75 (4), 363-369 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ex vivoPECDNP IgEDNP

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.