Здесь мы описываем штамм S. pneumoniae серотипа 1 519/43, который может быть генетически модифицирован, используя его способность естественным образом приобретать ДНК и плазмиду самоубийства. В качестве доказательства принципа был получен изогенный мутант в гене пневмолизина (ply).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Конструирование мутантов серотипа 1 Streptococcus pneumoniae штамма 519/43
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Streptococcus pneumoniae серотипа 1 остается огромной проблемой в странах с низким и средним уровнем дохода, особенно в странах Африки к югу от Сахары. Несмотря на его важность, исследования этого серотипа были затруднены из-за отсутствия генетических инструментов для его модификации. В этом исследовании мы описываем метод генетической модификации клинического изолята серотипа 1 (штамм 519/43). Интересно, что это было достигнуто за счет использования способности пневмококка естественным образом приобретать ДНК. Однако, в отличие от большинства пневмококков, использование линейной ДНК не было успешным; Чтобы мутировать этот важный штамм, пришлось использовать плазмиду самоубийства. Эта методология предоставила средства для более глубокого понимания этого неуловимого серотипа, как с точки зрения его биологии, так и патогенности. Чтобы проверить метод, основной известный пневмококковый токсин, пневмолизин, был мутирован, потому что он имеет хорошо известный и простой для понимания фенотип. Мы показали, что мутант, как и ожидалось, утратил способность лизировать эритроциты. Имея возможность мутировать важный ген в интересующем серотипе, мы смогли наблюдать различные фенотипы мутантов потери функции при внутрибрюшинных и интраназальных инфекциях от тех, которые наблюдались для других серотипов. Таким образом, это исследование доказывает, что штамм 519/43 (серотип 1) может быть генетически модифицирован.
Введение
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, пневмококк) является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. До недавнего времени было обнаружено около 100 серотипов S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ежегодно инвазивная пневмококковая инфекция (ИПД) уносит около 700 000 смертей детей в возрасте до 5 лет8. S. pneumoniae является основной причиной бактериальной пневм....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генерация мутирующего ампликона методом СОЭ-ПЦР23 и амплификация кассеты спектиномицина
- Начните с проведения ПЦР для амплификации плеч гомологии (ply 5' (488.н.) и ply3' (715.н.) соответственно) фланкирующих областей ply гена штамма 519/43. Используйте праймеры plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGAGGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATTCG) и plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCCCTTCTACCTTATCCTCTACC).
- Используйте следующие условия ПЦР для ply5': денатурация при 94 °C в течение 60 с, шаг 2: денатурация при 9....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанный здесь протокол начинается с использования ПЦР для амплификации левого и правого плеч гомологии с одновременным удалением 191.н. из средней области гена ply . При выполнении ПЦР сайт BamHI вводится в 3' левого плеча гомологии и в 5'-конце правого плеча гомологии (рис. 1A). Затем следует ПЦР-SOE, где левое и правое плечи гомологии сливаются в один ампликон (рис. 1B). Затем этот ампликон SOE-PCR клонируют в pGEMTeasy с помощью клонирования TA для.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Streptococcus pneumoniae, в частности серотип 1, по-прежнему представляет собой глобальную угрозу, вызывающую инвазивную пневмококковую инфекцию и менингит. Несмотря на внедрение различных вакцин, которые должны защищать от серотипа 1, в Африке этот серотип все еще способен вызывать вспышки, которые приводят к высокой заболеваемости и смертности13. Способность генетически манипулировать этим серотипом имеет решающее значение из-за его клинической значимости. Метод, описанный в этом исслед.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Фонд менингита и MRC за предоставление финансирования для этой работы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AccuPrime Pfx ДНК-полимераза | Invitrogen | 12344024 | Используется для амплификации фрагментов |
| Ампициллина натриевая соль | Sigma Aldrich | A9518 | Используется для бактериального отбора на стадии 1 (pSD1) |
| Основание агара | крови | Oxoid CM0055 | Используется для пластинирования S. pneumoniae трансформантов |
| Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин | сигма | 55470 | используется для S. pneumoniae Трансформация |
| мозговой инфузии сердца | Oxoid | CM1135 | используется для выращивания S. pneumoniae |
| клеток Кальция Хлорид кальция Cacl2 | Sigma | 449709 | используется для S. pneumoniae Трансформация |
| Компетентность стимулирующий пептид 1 | AnaSpec | AS-63779 | используется для S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | используется для покрытия и выбора pSD1 и pSD2 |
| Бульонная основа Лурии (формула Миллера) | Gibco | 12795027 | используется для нанесения покрытия и выбора pSD1 и pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Используется для извлечения полос из ДНК геля |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Используется для извлечения плазмиды из клеток |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | в качестве плазмиды самоубийцы |
| S.O.C. | Инвитроген | 15544034 | используется для восстановления клеток после трансформации |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Sigma | S0899 | используется для S.pneumoniae Трансформация |
| Spectinomycin гидрохлорид | SigmaAldrich | PHR1426 | используется для селекции бактерий |
| Эффективность субклонирования DH5α Компетентные клетки | Invitrogen | 18265017 | использоваться для создания pSD1 и pSD2 |
Ссылки
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactiv....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
