Методическая статья

Микрохирургическая диссекция и очистка тканей для визуализации целой сетчатки и стекловидного тела с высоким разрешением

DOI:

10.3791/61595

⸱

11 марта 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол визуализации интактной всей сетчатки, при котором внешние непрозрачные/пигментные слои глазного яблока удаляются хирургическим путем, а оптическая просветляемость применяется для придания сетчатке прозрачности, что позволяет визуализировать периферическую сетчатку и гиалоидную сосудистую сеть в интактной сетчатке с помощью световой флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронные и сосудистые структуры сетчатки в физиологических и патологических состояниях могут быть лучше визуализированы и охарактеризованы с помощью методов визуализации интактной всей сетчатки по сравнению с обычными препаратами и срезами сетчатки с плоским креплением. Тем не менее, иммунофлуоресцентная визуализация интактной целой сетчатки затруднена из-за непрозрачных покрытий глазного яблока, т.е. склеры, сосудистой оболочки и пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), а также светорассеивающих свойств слоев сетчатки, которые препятствуют получению оптической визуализации высокого разрешения на всю толщину. Химическое отбеливание пигментных слоев и протоколы очистки тканей были описаны для устранения этих препятствий; однако описанные в настоящее время методы не подходят для визуализации эндогенных флуоресцентных молекул, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) в интактной цельной сетчатке. Другие подходы обходили это ограничение путем хирургического удаления пигментных слоев и переднего сегмента глазного яблока, что позволило получить неповрежденную визуализацию глаза, хотя периферическая сетчатка и гиалоидные структуры были нарушены. Здесь представлен протокол интактной иммунофлуоресцентной визуализации всей сетчатки и стекловидного тела, который сочетает в себе хирургическое рассечение слоев склеры/сосудистой оболочки/пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) с модифицированным методом очистки тканей и флуоресцентной микроскопией световых листов (LSFM). Новый подход предлагает беспрецедентный взгляд на ненарушенные сосудистые и нейронные элементы сетчатки, а также стекловидного тела и гиалоидной сосудистой системы при патологических состояниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействие между нейрональными и сосудистыми элементами сетчатки в здоровом и болезненном состояниях традиционно изучается в иммунофлуоресцентных исследованиях на физических срезах парафиновой или криофиксированной ткани сетчатки или на плоских препаратах сетчатки1. Тем не менее, разрезание тканей нарушает непрерывность нейронов и сосудов сетчатки, и хотя трехмерная реконструкция соседних участков сетчатки предлагается в качестве возможного решения, она все еще подвержена ошибкам и артефактам. Препараты для плоского крепления сетчатки также заметно нарушают целостность сосудистых и нейрональных элементов сетчатки и географическую связь между соседними областями сетчатки2. В качестве альтернативы недавно была введена визуализация целой сетчатки для визуализации трехмерных проекций нейронных и сосудистых компонентов сетчатки в их естественном анатомическом положении 2,3,4,5.

При визуализации интактной целой сетчатки флуоресцентные сигналы от сосудистых и нейрональных элементов соседних участков сетчатки (плитки) интактной целой сетчатки регистрируются с помощью светового листового микроскопа; Затем эти плитки «сшиваются» вместе, чтобы воссоздать трехмерное изображение всей сетчатки 2,3,4,5,6. Визуализация целой сетчатки обеспечивает беспрецедентное изображение сетчатки для изучения патогенеза сосудистых, дегенеративных и воспалительных заболеваний сетчатки 2,3,4,5,6. Например, Prahst et al. выявили ранее «недооцененную» узловатую морфологию патологических сосудистых пучков, аномальную подвижность клеток и измененную динамику филоподий в модели кислород-индуцированной ретинопатии (ОИР) с использованием визуализации целой сетчатки в реальномвремени. Аналогичным образом, Henning et al., Singh et al., and Chang et al. продемонстрировали сложную трехмерную сосудистую сеть сетчатки в неповрежденной целой сетчатке 3,4,6. Vigouroux et al. использовали метод визуализации целого глаза, чтобы показать организацию сетчатки и зрительных проекций в перинатальном периоде5. Для того, чтобы иметь возможность создавать такие беспрецедентные трехмерные изображения сетчатки, протоколы визуализации целой сетчатки преодолевают два основных ограничения: 1) наличие непрозрачных и пигментированных покрытий глазного яблока (склеры, сосудистой оболочки и РПЭ) и 2) ограниченное проникновение света через всю толщину сетчатки, вызванное светорассеивающими свойствами ядерных и плексиформных слоев сетчатки. Henning et al. и Vigouroux et al. применили H2O2 отбеливание пигментов сосудистой оболочки / RPE для получения изображения неповрежденной сетчатки 3,5. Тем не менее, отбеливание не подходит для линий животных с эндогенными флуорофорами, такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или после иммунофлуоресцентного окрашивания in vivo 3,5,7. Кроме того, метод Henning et al. по лечению H2O2 проводился в водных условиях, которые могут генерировать микропузырьки, приводящие к отслоению сетчатки. Кроме того, лечение H2O2 проводилось при температуре 55 °C, что еще больше ухудшает аффинность к тканевым антителам. Кроме того, отбеливание может привести к сильной автофлуоресценции, происходящей из окисленного меланина8. Другие протоколы депигментации для срезов глаза с использованием перманганата калия и щавелевой кислоты позволили удалить пигменты РПЭ в эмбриональных срезах, но было также показано, что этот метод депигментации снижает эффективность иммуномечения. В качестве альтернативы отбеливанию Prahst et al., Singh et al., and Chang et al. удалили склеру, сосудистую оболочку и роговицу, чтобы сделать всю сетчатку доступной для света микроскопа 2,4,6. Тем не менее, удаление роговицы, хрусталика и периферической сетчатки может деформировать и разрушить периферическую сетчатку и гиалоидные сосуды, что делает эти методы непригодными для изучения периферической сетчатки и гиалоидной сосудистой системы.

Все доступные в настоящее время протоколы визуализации целого глаза включают использование этапа оптического очищения тканей для преодоления светорассеивающих свойств слоев сетчатки 2,3,4,5. Оптическая очистка тканей делает сетчатку прозрачной для света микроскопа путем выравнивания показателя преломления данной ткани, в данном случае сетчатки, по всем ее клеточным и межклеточным элементам для минимизации рассеянияи поглощения света. Сосудистая оболочка и РПЭ должны быть удалены или отбелены перед нанесением оптического очищения тканей на сетчатку, так как пигментные оболочки глазного яблока (сосудистая оболочка и РПЭ) не могут быть достаточно очищены 6,12,13,14,15,16,17,18.

Участие и вклад стекловидного тела и гиалоидной сосудистой системы в патологические состояния, такие как ретинопатия недоношенных (РН), персистирующая сосудистая сеть плода (ПФВ), болезнь Норри и болезнь Стиклера, лучше всего изучаются, когда сетчатка и гиалоидные сосуды не нарушены при подготовке тканей 19,20,21,22,23. Существующие методы визуализации целой сетчатки либо удаляют передний отрезок глаза, что естественным образом разрушает стекловидное тело и его сосудистую сеть, либо применяют отбеливающие агенты, которые могут удалять эндогенные флуорофоры. Опубликованные методы визуализации стекловидного тела и сосудистой сети в их неповрежденном, нетронутом состоянии отсутствуют. Здесь мы описываем метод визуализации всей сетчатки и стекловидного тела, который состоит из хирургического рассечения пигментированных и непрозрачных покрытий глазного яблока, модифицированной оптической просветленной ткани, оптимизированной для сетчатки, и флуоресцентной микроскопии световых листов. Ниже подробно описаны этапы подготовки образцов, оптической очистки тканей, световой листовой микроскопии и обработки изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского отделения Техасского университета. Использование животных и уход за ними соответствовали заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Все материалы, необходимые для проведения этой процедуры, перечислены в Таблице материалов. Надевайте неопудренные перчатки во время выполнения каждого шага. Для получения информации о шагах 6 и 7 также обратитесь к официальному руководству по эксплуатации микроскопа.

1. Подготовка животных

  1. Усыпить подопытных мышей в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу и использованию институциональных животных (здесь использовалась анестезия комбинацией кетамина 60 мг/кг и дексмедетомидина 0,5 мг/кг с последующим вывихом шейки матки). Немедленно приступайте к стабилизации животного на платформе для вскрытия и перфузии сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подопытные животные выбираются на основе индивидуального исследования.
  2. Рассеките брюшную полость и грудную клетку, чтобы обнажить сердце. Выполните перфузию сердца путем переливания сердца через иглу 27 G, помещенную в левый желудочек, и сделайте небольшой (~ 1 мм) разрез в правом предсердии, чтобы обеспечить выход крови24.
    1. Сначала переливают 30–50 мл ледяного фосфатно-сбалансированного солевого раствора (PBS), а затем 30–50 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида (PFA).
    2. Чтобы проверить успешное переливание PFA, проверьте наличие видимых мышечных подергиваний по всему телу и хвосту. Переходим к этапу энуклеации.

2. Энуклеация и фиксация глазного яблока

  1. С помощью изогнутых ювелирных щипцов аккуратно надавите на верхнее или нижнее веко, чтобы выдавить глазное яблоко из глазницы. Используйте другой набор ювелирных или аналогичных щипцов, чтобы проколоть конъюнктиву сбоку и удерживать глобус со стороны зрительного нерва. Медленно поднимайте шар из глазницы до тех пор, пока он не будет отрезан от зрительного нерва.
  2. Переложите шар в пробирку, содержащую свежеприготовленный ледяной 4% PFA. Нанесите соответствующую маркировку на пробирку. Дайте шару оставаться в 4% PFA в холодильнике при температуре 4 °C в течение 12 часов (на ночь).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковую переводную пипетку с отрезанным наконечником для переноса шара. Расширьте отверстие отрезанного наконечника с помощью второго наконечника для пипетки, чтобы не повредить образец острыми краями.

3. Вскрытие образца (Рисунок 1 и Рисунок 2)

  1. Под стереомикроскопом найдите соединение роговицы и склеры (Рисунок 1A) и с помощью острого режущего кончика иглы 30G сделайте очень поверхностный разрез на склере примерно в 0,5–1 мм за соединением роговицы и склеры (Рисунок 1B).
  2. Проведите одно из лезвий ножниц с острым кончиком через только что сделанный разрез в потенциальное пространство между склерой/сосудистой оболочкой/РПЭ и сетчаткой глаза (рис. 1C). Продвигайте ножницы вперед и режьте по окружности, пока склера/сосудистая оболочка/РПЭ не смогут отклеиться от наружной поверхности сетчатки (рис. 1D, E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнять этот шаг медленно и аккуратно, чтобы избежать прокола сетчатки. Первые несколько порезов особенно важны, чтобы избежать порезов сетчатки.
  3. При необходимости сделайте радиальные расслабляющие разрезы на склере/сосудистой оболочке/РПЭ, чтобы облегчить процесс кругового разреза и последующего пилинга зрительного нерва и склеры/сосудистой оболочки/РПЭ. Удалите небольшие участки СИЗОД (Рисунок 1F) с помощью кисти для рисования размера 1, смоченной в PBS.
  4. Перенесите все неповрежденное глазное яблоко в пробирку, содержащую PBS. Немедленно переходите к следующему этапу или храните при температуре 4 °C для иммуномаркировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метки могут быть нанесены на глазное яблоко после энуклеации, а затем, после диссекции, чтобы сохранить ориентацию глаза, если это необходимо. Здесь протокол может быть приостановлен, а образцы могут быть сохранены на ночь в холодильнике при температуре 4 °C, прежде чем перейти к следующим шагам.

4. Окрашивание сосудов

  1. Пермеабилизируйте ткань, погрузив ее в PBS, содержащую 0,2% Tween-20, при комнатной температуре на 20 минут.
  2. Промойте образец PBS 3 раза на шейкере в течение 10 минут.
  3. Инкубируйте образец с 5% нормальной сывороткой крови коз (NGS) в PBS, содержащей 0,25% Triton X-100, при комнатной температуре в течение 1 ч.
  4. Инкубировать с первичным антителом при 4 °C в течение ночи. Здесь использовали антитело против мышей Collagen IV (окончательную концентрацию готовили в PBS, содержащем 0,2% Tween-20).
  5. Стирайте 3 раза с PBS, по 5 минут за стирку.
  6. Инкубируйте образец с флуоресцентно мечеными вторичными антителами. В данном случае антикроличий препарат Alexa Fluor 568 использовался в течение 12 ч при 4 °C (разведение 1:200 в PBS, содержащем 0,2% Tween-20).
  7. Промойте PBS 3 раза, по 1 часу каждый, а затем приступайте к очистке тканей.

5. Оптическое очищение 2,2'-тиодиотанолом (ТДЭ)

  1. Приготовьте рабочие концентрации TDE с использованием стокового раствора TDE с PBS для конечной концентрации 10%, 20%, 30%, 40%, 50% и 60% объема (v/v). Приготовьте не менее 2 мл раствора для каждого образца глаза, чтобы позволить достаточному избыточному объему проникнуть в ткани.
  2. Инкубируйте образцы в лунке с 6 или 12 лунками при возрастающей концентрации TDE. Начните с погружения целых глазных яблок в 10% раствор TDE на 2–4 часа в шейкере при комнатной температуре. Последовательно переносите образец на более высокую концентрацию TDE в течение 2–4 часов при каждой концентрации TDE (рис. 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатка начинает очищаться при концентрации 40–50%, но максимальное очищение происходит после инкубации в 60% растворе. Сетчатка становится менее прозрачной при концентрации 70% и выше (Рисунок 2D).
  3. При необходимости остановите процесс клиринга на ночь, на любом из последовательных этапов клиринговой биржи.

6. Визуализация всего глаза с помощью световой листовой микроскопии

  1. Монтируйте неповрежденные образцы целого глаза с учетом конфигурации используемой платформы светового листового микроскопа. Следуйте инструкциям микроскопа и программного обеспечения для сбора данных, чтобы настроить параметры сбора данных, включая выравнивание светового листа, освещение и обнаружение оптических путей.
    Примечание: Образцы, использованные в этом эксперименте, были приклеены со стороны роговицы к кончику иглы для подкожных инъекций на инсулиновом шприце (Рисунок 2E). Затем образец подвешивали внутри камеры микроскопа.
  2. Заполните камеру микроскопа 60% TDE в качестве очищающего раствора.
  3. Погрузите образец в камеру светового листа микроскопа в 60% раствор TDE (конечная концентрация очистки).
  4. Визуализируйте просветленный глаз с помощью различных коммерческих или изготовленных по индивидуальному заказу конфокальных и световых листовых микроскопов. В этом протоколе используется двухсторонний световой листовой микроскоп.
  5. Используйте изображение с низким разрешением и малым увеличением (5x, NA 0,16) для визуализации клеточной морфологии и отслеживания клеточных процессов, особенно в сочетании с мозаикой. Используйте визуализацию с высоким разрешением и увеличением (20x, NA 1.0) для визуализации как клеточной морфологии, так и крупных субклеточных органелл, таких как ядра и митохондриальные кластеры.

7. Обработка изображений после получения изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка после сбора данных зависит от типа файла и программного обеспечения, совместимого с файлами изображения.

  1. Примените устранение размытия или деконволюцию для дальнейшего улучшения исходных изображений перед сшиванием изображений. Для уменьшения размытия изображений можно применить фильтр Вайнера. В качестве альтернативы, изображения могут быть итеративно деконволюционированы после шумоподавления с помощью деконволюции Ричардсона-Люси и теоретического или экспериментально измеренного PSF с использованием инструментов моделирования, таких как плагин25 генератора PSF ImageJ.
  2. Выполнение сшивания предварительно обработанных z-стеков и аффинных и нежестких объемных преобразований с последующей регистрацией и слиянием многоракурсных объемов с использованием различных коммерческих или общедоступных программных пакетов (ImageJ – плагин BigStitcher)26.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проекция перипапиллярной сосудистой сетки и микроглии под нулевым углом показана на рисунке 3A. Кроме того, неповрежденное распределение микроглии всей сетчатки у мыши CX3CR1-GFP представлено на рисунке 3B. Основным преимуществом метода, представленного здесь, является его способность визуализировать врожденные флуорофоры. На рисунке 3C,D показана микроглия в репрезентативных проекциях Z (зеленый канал) и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие и патологии сетчатки и стекловидного тела лучше всего изучаются с помощью методов визуализации целой сетчатки, при которых сетчатка не разрезается на срезы или для плоских препаратов. Существующие методы визуализации всего глаза включают либо пигментное отбеливание, которое удаляет врожденные флуорофоры, либо включают физическое удаление непрозрачных покрытий глазного яблока (РПЭ, сосудистой оболочки и склеры) вместе с передним отрезком глаза, что может нарушить периферическую с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие соответствующего коммерческого конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была проделана в медицинском отделении Техасского университета. Авторы высоко оценивают Харальда
Юнге, доктор философии, Дебора Феррингтон, доктор философии, и Хайди Рерих, Университет Миннесоты, за помощь в подготовке рисунка 1 и фильма 2. LO был поддержан грантом NIEHS T32 Training Grant T32ES007254.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<Стронг>Экспериментальное животное
CX3CR1-GFP МышьЛаборатория Джексона5582
<Стронг>Анестетик
ДексмедетомидинPar Pharmaceutical42023-146-25
КетаминФрезениус Каби
<Сильный>Забор тканей, фиксация и диссекция образцов
сердечный перфузионный насосFisher ScientificNC9069235
Цианоакрилатный суперклейamazon.com
Тонкие ножницы-острыеFine Science Tools14160-10
Тонкий пинцетFine Science Tools11412-11
Параформальдегид (PFA)Электронная микроскопия науки15710-S
Фосфатный буферный раствор (PBS)Gibco10010049
размер 1 кисть для рисованияdickblick.com
прямыми пружинными ножницамиFine Science Tools15000-03
шприц, наконечник иглы, 27 калибр x 1,25 "BD
Тубы 1,5 мл, 15 мл, 50 млThermo sceintific
Tween-20ThermoFisher85114
<сильно>Иммунофлуоресцентное окрашивание
Антимышиный коллаген внутривенное антителоAbcamab198081:200 разведение
Антикролик Alexa Fluor 568ИнвитреогенA-110111:200 разведение
Нормальный козий сывороткаThermoFisher50062Z10% концентрация
<сильная>Очистка тканей
2,2′-тиодиотанол (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
Качалка шейкерFisher scientific02-217-765
Microscopy
Флуоресцентные микросферыTetraSpeckT14792
Световой листовой флуоресцентный микроскоп (LSFM)ZeissZ1
Microglia enumerationImageJ
Национальный институт здравоохранения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275(2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011(2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, London, England. 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48(2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564(2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008(2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280(2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Light Sheet MicroscopySclera Choroid RPE DissectionRetinal Vascular ImagingNeuronal Structure ImagingEndogenous Fluorescent ImagingGFP Retina ImagingHigh Resolution Retina
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи