Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Препарат in vitro активно созревающих эксплантов суставного хряща крупного рогатого скота для рентгеновской фазовой контрастной визуализации

943 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61607

⸱

31 января 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm UA07, Rayonnement Synchrotron pour la Recherche Biomédicale (STROBE), 2Centre of Nanohealth, Swansea University Medical School, 3ISTerre, Université Grenoble Alpes, CS, Grenoble Cedex 9, 4Novitom, R&D Grenoble, 5ESRF, European Synchrotron Radiation Facility, CS, Grenoble Cedex 9

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает подготовку суставного хряща крупного рогатого скота in vitro для визуализации в высоком разрешении с помощью рентгеновских лучей. Эти экспланты активно подвергаются постнатальному созреванию. Здесь мы описываем необходимые этапы от биопсии до анализа данных 3D рентгеновской фазово-контрастной визуализации, прохождения через культуру экспланта, фиксации тканей и синхротронной подготовки.

Аннотация

Понимание механизмов, лежащих в основе постнатального созревания суставного хряща, имеет решающее значение для разработки следующего поколения стратегий тканевой инженерии и потенциального восстановления больного или поврежденного хряща. В целом, постнатальное созревание суставного хряща, которое представляет собой полное изменение структуры коллагена и функции ткани для приспособления к росту организма, происходит в течение периода от нескольких месяцев до нескольких лет. И наоборот, нарушение структурной организации хряща, которое также происходит в течение длительного периода времени, является отличительным признаком дегенерации тканей. Наши возможности детального изучения этих биологических процессов были расширены благодаря открытиям о том, что факторы роста могут вызывать преждевременное созревание in vitro незрелого суставного хряща. Изменения, связанные с развитием и заболеваниями в суставе, затрагивают кости и хрящи, и возможность совместного изображения этих тканей значительно расширит наше понимание их взаимосвязанных ролей.

Одновременная визуализация изменений мягких тканей, хрящей и костей в настоящее время является проблемой, которую необходимо решить для традиционных методов доклинической визуализации, используемых для наблюдения за заболеваниями суставов. Трехмерные методы рентгеновской фазово-контрастной визуализации (ЧКВ) находятся в постоянном развитии в течение 20 лет из-за высокой производительности для визуализации объектов с низкой плотностью и их способности предоставлять дополнительную информацию по сравнению с обычной рентгеновской визуализацией.

В этом протоколе мы подробно описываем процедуру, используемую в наших экспериментах, от биопсии хряща, создания зрелого хряща in vitro до анализа изображений, полученных с помощью рентгеновской фазовой контрастной визуализации.

Введение

Незрелый суставной хрящ является адекватной опорой для инициирования морфологических, структурных и биомолекулярных изменений1 с целью получения функции, специфичной для взрослого сустава. Основным изменением является реорганизация коллагеновых фибрилл с одной, имеющей параллельную ориентацию по отношению к поверхности в незрелом хряще, на ту, где фибриллы, расположенные глубже в ткани, перпендикулярны зрелому хрящу. Псевдостратификация хряща взрослого человека проявляется в перестройке резидентных хондроцитов по направлению ориентации коллагеновых фибрилл с клетками на поверхности, дискообразными и параллельными поверхности, а в более глубоких зонах клетки становятся все более крупными и организованными в колонны. Известно, что постнатальное созревание происходит в течение многих месяцев и в основном завершается в конце периода полового созревания, считалось, что длительная временная шкала делает изучение этого важного перехода в развитии в лучшем случае затруднительным или технически невозможным для детального изучения2. Некоторые успехи в решении этой проблемы были достигнуты благодаря открытию того, что фактор роста фибробластов-2 и трансформирующий фактор роста-β1 вместе способны вызывать важные физиологические и морфологические изменения, которые реплицируют созревание суставного хряща 2,3 (рис. 1). Индуцированное фактором роста созревание in vitro происходит в течение трех недель и не требует каких-либо биомеханических затрат. После культивирования экспрессия коллагена II типа значительно снижается, а соотношение зрелых трехвалентных и незрелых двухвалентных коллагеновых сшиваний увеличивается, что наблюдается в созревающих хрящах. Кроме того, организация внеклеточного матрикса и коллагеновых фибрилл ближе к той, что наблюдается в зрелом хряще, хотя этот аспект перехода не является полным. Биохимически состав обработанного фактором роста хряща имитирует взрослый суставной хрящ3.

Модель, использованная в статье, основана на in vitro Культура эксплантов диаметром 4 или 6 мм, которые были иссечены в стерильных условиях с латеральной стороны медиального мыщелка пястно-фалангового сустава от неполовозрелых самцов (7-дневных) бычков-бычков. Тонкий слой кальцинированного хряща и субхондральной кости сохранялся на базальной стороне каждого экспланта. Суставной хрящ культивировали в классической бессывороточной среде Dulbecco's модифицированной среде Eagles (высокий уровень глюкозы 4,5 г/л), в которую добавляли инсулин-трансферрин-селен (ITS), 10 мМ буфер HEPES pH 7,4, аскорбиновую кислоту и 50 мкг/мл гентамицина. В эту питательную среду добавляют фактор роста фибробластов 2 (FGF-2) в концентрации 100 нг/мл и трансформирующий фактор роста β1 (TGF-β1) в концентрации 100 нг/мл, которые восполняют каждые три дня при смене сред2. Сильно ускоренное созревание хряща индуцируется сочетанием факторов роста. Эти изменения происходят в течение 21 дня. Стимуляция фактором роста дополнительно индуцирует апоптоз и резорбцию со стороны базального аспекта и клеточную пролиферацию в поверхностных хондроцитах3. Состав питательной среды описан в Таблица 1. Следуя модели, разработанной Khan et al. 20112, экспланты суставного хряща культивируют TGF-β1 в концентрации 10 нг/мкл и FGF2 в концентрации 100 нг/мкл (исходные концентрации 10 г/мл и 100 г/мл растворенные в фосфатно-солевом буфере/0,1% БСА). На 1 мл среды используется 1 мкл каждого фактора роста. DMEM-F12 с L-глутамином и высоким содержанием глюкозы представляет собой искусственную среду, которая при добавлении инсулина, трансферрина и селена (ITS), аскорбиновой кислоты, гентамицина и HEPES обеспечивает полноценную добавку среды со всеми физиологическими потребностями роста, специфичными для различных клеточных линий и культур эксплантов. DMEM-F12 состоит из нескольких различных неорганических солей (например, NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2Нет2Заказ на поставку4), глюкоза, аминокислоты (источники азота), витамины, кофакторы и вода. Эти соли обеспечивают достаточный энергетический вклад для поддержания клеточного выживания и нормального роста культуры. Ионы минерала способствуют поддержанию осмолярности, близкой к естественной физиологической среде. Более высокая концентрация глюкозы (4,5 г/л) используется, так как хондроциты дышат в основном за счет гликолиза. Добавка среды F12 используется, потому что она содержит ряд источников сульфата, CuSO4, FeSO4, ZnSO4 и MgSO4 необходим для синтеза сульфатированных гликозаминогликанов. Что проверено по цветным индикаторам (здесь фенол красный) и СО2/Больничный касса-3 В сочетании с фосфатами pH остается постоянным на уровне, близком к 7,4. Основным дыхательным путем, используемым хондроцитами, является гликолиз, где молочная кислота является конечным продуктом, вызывающим повышение pH, поэтому, при отсутствии биомеханических сил, которые помогли бы удалить молочную кислоту местного производства, HEPES действует для поддержания буферной среды для физиологических процессов. Гентамицин – аминогликозидный антибиотик, контролирующий внешнее бактериальное загрязнение путем ингибирования роста. Аскорбиновая кислота используется в качестве среднего дополнения для ее антиоксидантного действия4. Аскорбиновая кислота является кофактором для ферментов, пролилгидроксилаз, которые функционируют для гидроксилирования остатков пролина в коллагене, стабилизируя его тройную спиральную структуру. Трансферрин обычно служит внеклеточным антиоксидантом (снижение токсичности и АФК)5,6. Его также добавляют в питательную среду из-за его способности обеспечивать и облегчать внеклеточное хранение и транспортировку железа в клеточной культуре. Трансферрин настолько прочно связывает железо в физиологических условиях, что практически не существует свободного железа, катализирующего производство свободных радикалов7. Гормон инсулин, поступающий сигналом от связанного с ним рецептора, увеличивает всасывание нескольких элементов, таких как глюкоза, аминокислоты. Он также участвует в нескольких процессах, таких как внутриклеточный транспорт, липогенез, синтез белка и нуклеиновых кислот. Инсулин обладает эффектом, стимулирующим рост. Селен присутствует дополнительно в составном растворе «инсулин-трансферрин-селен», в виде селенита натрия. Он в основном используется в качестве кофактора для (селено-) белков, таких как глутатионпероксидаза (GPX), в качестве дополнительного антиоксидантного агента в культуре. В in vitro суставные хондроциты, ИТС, по-видимому, усиливают клеточную пролиферацию и сохранение фенотипа, подавляя экспрессию генов, связанную с клеточной дедифференцировкой и гипертрофической дифференцировкой8. В питательную среду добавляют такие факторы роста, как фактор роста фибробластов-2 и трансформирующий фактор роста-β1. Они используются для индуцирования и регулирования дифференцировки, роста, заживления и развития клеток2,3. FGF-2 и TGF-β1 в комбинации также активно способствуют клеточной пролиферации в культивируемых клетках и тканях9.

Эта модель созревания суставного хряща in vitro полезна по трем основным причинам. Во-первых, ускоренный фазовый переход развития в этой модели позволяет нам изучать незаметные изменения, которые происходят в течение многих месяцев в моделях in vivo, такие как повышенная экспрессия лислоксидазы-L1 во время созревания. Во-вторых, тканевая инженерия суставного хряща страдает от того, что образуется хрящ с изотропной морфологией и структурой, который функционально неполноценен при трансплантации в суставы для восстановления очаговых дефектов. Понимание того, как вызвать изменения в процессе созревания, ускорит разработку полнофункциональных имплантируемых устройств. В-третьих, и это имеет отношение к данному исследованию, существуют дегенеративные заболевания суставов, такие как болезнь Кашина-Бека, возникающие в детстве, которые приводят к серьезным деформациям суставов во взрослом возрасте. Эта конкретная болезнь тесно связана с географическими районами (Китай) с эндемическим дефицитом селена и йода, потенциально поражающим десятки миллионов жителей 11,12,13. Изучение дефектов скелета при болезни Кашина-Бека показывает, что она возникает в перипубертатном периоде, что влечет за собой нарушение процессов созревания скелета. Таким образом, для более глубокого понимания роли селена в суставном хряще (АК) требуется надежная модель роста и развития хряща. Модель созревания, индуцированная фактором роста in vitro, является полезной отправной точкой для исследований роста и метаболизма суставного хряща во время созревания в присутствии или отсутствии ионов селена 14,15,16. Наши знания о влиянии дефицита селена (Se) на сложные и взаимосвязанные биологические процессы остаются очень скудными. Основная проблема заключается в том, что селен остается изучаемым элементом из-за его ограничивающего действия (требуемая концентрация от 40 до 400 г/кг17) и очень низкой концентрации. Модель ускоренного созревания с использованием незрелого бычьего хряща предлагает беспрецедентную возможность наблюдать за биологическими изменениями, происходящими во время важной фазы развития. Концентрация Se-углерода в организмах строго контролируется, и эта модель является отправной точкой для разработки методов визуализации, позволяющих точно отслеживать его во время созревания. Эти методы могут стать мощным инструментом для изучения стратегий предотвращения деградации АК и, возможно, для разработки основы новых методов лечения на основе регенеративной медицины.

Одновременная визуализация изменений мягких тканей, хрящей и костей является основной проблемой в традиционных методах доклинической визуализации. Это действительно было бы важным подспорьем для наблюдения за заболеваниями суставов18,19 . Например, обычная рентгеновская микрокомпьютерная томография (μКТ) показывает плохие результаты для мягких тканей, что ограничивает ее использование изображением костных дефектов, остеофитов и непрямой визуализацией хрящей. Магнитно-резонансная томография (МРТ), с другой стороны, традиционно используется для визуализации мягких тканей, несмотря на ее плохую способность точно отображать изменения в кости (например, микрокальцинаты) на начальных стадиях заболеваний. Способность быть чувствительным к костям и хрящам, а также различать составляющие клетки хряща, хондроциты имеет огромное значение. Фазово-контрастная визуализация (PCI) основана на свойстве, что показатель преломления рентгеновских лучей материалов может быть в тысячу раз больше, чем показатель поглощения для световых элементов. Это создает более высокий контраст для мягких тканей по сравнению с традиционными методами, основанными на абсорбции подошвы. Таким образом, ЧКВ способно визуализировать все ткани, составляющие сустав, имеющие одновременное представительство как высокопоглощающих (например, кости), так и менее поглощающих тканей (например, волокнистый хрящ, связки, сухожилия, мениск и связанные с ними мягкие ткани (синовиальные оболочки и мышцы)18,19,20,21.

Как показано в ссылке 20, рентгеновское ЧКВ превосходит другие методы доклинической визуализации хряща. Цель этого протокола — детализировать процедуру и показать некоторые репрезентативные результаты. Схема воздействия факторов роста на незрелый хрящевой эксплант представлена на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по этическим исследованиям Университета Суонси, а материалы биопсии были приобретены по лицензии Министерства окружающей среды, продовольствия и сельского хозяйства (DEFRA) Великобритании. Этот протокол соответствует рекомендациям по уходу за животными наших учреждений.

1. Эксплантация культур

  1. Приготовление эксплантов из бычьих ног волосистой части головы
    1. Подготовьте абсорбирующий протектор и скальпель, стандартный хирургический скальпель с лезвием скальпеля #10.
    2. Опрыскайте все материалы 70% раствором этанола.
    3. Замочите бычью ногу (7-дневных самцов бычьего быка, полученного со скотобойни с разрешения ветеринара) водой, чтобы удалить всю кровь и грязь.
    4. Очистите ногу с мылом и потрите щеткой.
    5. Когда вы достаточно чисты, опрыскайте ногу 70% этанолом.
    6. Выложите его на впитывающую бумагу.
    7. Разрежьте вокруг ступней скальпелем.
    8. Проведите тонкую линию по длине ноги.
    9. Будьте особенно осторожны в области суставов.
    10. Снимите кожу ноги аккуратно по продольной линии скальпеля.
    11. Положите отходы (кожу, использованную салфетку, бумагу и перчатки) в пакет для клинических отходов.
    12. Очистите/смажьте ногу мылом и снова простерилизуйте этанолом, когда кожа будет удалена.
    13. Не повреждайте область, расположенную близко к полости сустава. Если полость вскрыта или повреждена в результате инфильтрации крови, она больше не стерильна, и ногу нельзя использовать.
    14. Поместите ногу в алюминиевую фольгу, в которую был сбрызган 70% этанол.
    15. Наденьте латексные перчатки подходящего размера на концы ноги, чтобы предотвратить выход крови из проксимального конца или возможное загрязнение из копыта.
    16. Утилизируйте отходы надлежащим образом в соответствии с правилами учреждения.
  2. Экстракция и культивирование эксплантов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты должны быть получены из внутренней части сустава (Рисунок 2, два первых этапа). Для того, чтобы условия были сопоставимыми, необходимо пробить четыре (или шесть) эксплантов из одной и той же зоны, чтобы применить четыре (или шесть) различных обработок к образцам, обладающим почти одинаковой формой и характеристиками.
    1. Откройте вытяжку с ламинарным потоком за 25 минут до использования, очистите спиртом на 70%.
    2. Поставьте среду культуры в тепло на водяную баню.
    3. Приготовьте 24-луночный планшет с 1,5 мл основной среды, только DMEM-F12 (промывочная среда) в каждой лунке.
    4. Приготовьте еще одну лунку с 1,5 мл готовой питательной среды. Хранить в инкубаторе для культур при температуре 37 °C до использования
    5. Подготовьте материал на решетке: одну универсальную тубу с 70% этанолом и другую универсальную тубу с моющим средством.
    6. Подготовьте скальпель и 4 или 6 мм пробойник для биопсии (помещенный в спиртовую универсальную пробирку).
    7. Положите трубки и материалы под капот.
    8. Положите под капот впитывающий протектор, сбрызгиваемый 70% этанолом.
    9. Подготовьте салфетки, опрысканные 70% этанолом.
    10. Возьмите пластину для препарирования, накройте ее Al-фольгой.
    11. Достаньте те же, заранее приготовленные, ножки из холодильника (4 °C) и опрыскайте их 70% этанолом.
    12. Утилизируйте опасные и медицинские пакеты рядом с капюшоном, чтобы позже автоклавировать отходы.
    13. Сбрызните ногу 70% этанолом.
    14. Переместите сустав, чтобы найти среднюю линию сустава, где должен быть сделан разрез. Делайте это под капотом.
    15. Возьмите стерильный скальпель.
    16. Аккуратно разрежьте по средней линии, следуя контуру кромок стыка. Не прикасайтесь к пястно-фаланговому суставу медиального мыщелкового хряща.
    17. Осторожно разрежьте связку, когда сустав будет открыт.
    18. Выбросьте нижнюю часть стоп в автоклавный пакет.
    19. Удалите все остальные ткани, чтобы обнажить весь хрящ сустава (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы ничего не касаться ногами.
    20. Поместите скальпель и биопсийный перфоратор в спирт, а затем в моющую среду.
    21. Сделайте несколько кругов этим перфоратором (4-5 на лицо) с некоторой силой вдоль внутренних поверхностей костей.
    22. Когда закончите, поместите биопунш в спирт, чтобы очистить его.
    23. Возьмите скальпель и разрежьте (проведите линию) между каждым кругом и по центральной линии кости.
    24. Чтобы извлечь хрящевой эксплант, разрежьте вертикально по одной из границ круга биопсию, затем разрежьте горизонтально на субхондральной кости очень аккуратно.
    25. Чтобы удалить хрящевой эксплант, разрезанный горизонтально ниже линии пункции вдоль субхондральной кости и кальцинированного хряща, экспланты будут выскочить наружу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты должны иметь одинаковую толщину, если это возможно.
    26. Поместите эксплант в лунку, наполненную 1,5 мл моющей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда проводите экспериментальный контроль и лечение эксплантов, поступающих из одного и того же места в суставе.
    27. Убедитесь, что эксплант правильно сориентирован. Поверхность экспланта должна быть обращена вверх, а субхондральная костная часть экспланта должна быть обращена к дну луночной пластины.
    28. Держите лунку закрытой между каждой биопсией.
    29. Удалите моющее средство.
    30. Снова промойте средством для мытья. Оставьте в моющей среде на 2-3 часа. Костные остатки, кровь успеют вытекать в среду.
    31. Переложите экспланты в новую луночную тарелку, содержащую полную питательную среду. Будьте осторожны: ни к чему не прикасайтесь пипеткой.
    32. Убедитесь, что экспланты все еще находятся в правильном положении (кость обращена к нижней части луночной пластины).
    33. Очистите все и выбросьте клинические отходы в подходящее место.
    34. После того, как экспланты помещены в культуру в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2, каждые два дня меняйте питательную среду для эксплантов теплой свежей средой для удовлетворения разнообразных потребностей клеток/тканей. Убедитесь, что экспланты все еще находятся в правильном положении (кость обращена к нижней части луночной пластины).
  3. Фиксация образца (опционально)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг только после окончания культивирования клеток, то есть через 3 недели культивирования. Затем экспланты достигают зрелой стадии.
    1. Промойте экспланты с помощью DMEM-F12 с помощью пипетки под колпаком для культуры тканей.
    2. Дважды промойте экспланты PBS с помощью пипетки под колпаком для культуры тканей.
    3. Зафиксируйте их на ночь при температуре 4 °C, замочив в 10% NBFS (нейтральный буферный формалин с солевым раствором).
    4. Поместите неподвижные экспланты в PBS в микроцентрифужную пробирку
    5. Хранить экспланты при температуре 4 °C. Неподвижные экспланты могут находиться в этих условиях до 6 месяцев.

2. Подготовка образца к сеансу визуализации

  1. Используйте конические пластиковые наконечники соответствующего размера (обычно 1 мл наконечника) по отношению к образцу и полю зрения камеры.
  2. Закройте конус (нагрев его пламенем), чтобы получить водонепроницаемый контейнер для образцов.
  3. Заполните чаевые PBS. Подержите образец пинцетом и вставьте его в пробирку. Удалите пузырьки воздуха медленным встряхиванием.
  4. Установите трубку на предметный столик томографии и выровняйте ее, сделав простые рентгенограммы.

3. Сеанс рентгеновской фазово-контрастной визуализации

  1. Поместите детектор на расстоянии 2,5 м от образца
  2. Установите энергию рентгеновских фотонов на 17 кэВ, используя двойную кремниевую кристаллическую систему в геометрии Брэгга-Брэгга.
  3. Детектор Mount Imaging состоял из научной КМОП-камеры22 на оптической основе с результирующим размером изотропного вокселя 3,5 мкм в 3D-изображении.
  4. Используйте сцинтилляционный экран из оксисульфида гадолиния толщиной 60 мкм для преобразования рентгеновских лучей в видимый свет
  5. Сбор данных: Получение 2000 проекций во время сканирования образца на 360° с временем экспозиции 2 с для каждой проекции.
  6. Используйте алгоритм извлечения фазы для извлечения фазового сигнала, как описано в ссылке 23. Алгоритм использует априорные знания о комплексном распределении показателя преломления в образце. Основная гипотеза, которая здесь не подтверждена, заключается в том, что существует один материал для реконструкции. В данном конкретном случае соотношение между рефракцией и индексом поглощения было установлено равным 1200, что экспериментально наблюдалось с наилучшим компромиссом для визуализации костей и хрящей.
  7. Используйте стандартный алгоритм реконструкции КТ с обратной проекцией с фильтром с использованием реализации кода PyHST224 на основе графического процессора (GPU) с открытым исходным кодом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Была использована простая схема визуализации, основанная на распространении радиоволн, как показано на рисунке 3. При визуализации, основанной на синхротронном распространении, когерентный рентгеновский луч освещает объект, вызывая пространственно изменяющиеся фазовые сдвиги19. По мере того, как рентгеновский луч распространяется вслед за образцом, искаженный волновой фронт генерирует характеристическую картину. Путем анализа этих характеристич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представили полное исследование от подготовки образца до визуализации изображения, включая протоколы сбора данных, для исследования быстро созревающего суставного хряща in vitro . Результаты сеанса синхротронной визуализации показали достоинства модели.

В представленной здесь модели необходимо упомянуть некоторые наблюдения и пределы. Это «ускоренное созревание» происходит в течение 21 дня после культивирования. При более длительных периодах культи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Авторы благодарят ESRF за предоставление собственного времени луча. Авторы выражают благодарность Эрику Циглеру за научные дискуссии. Описанный эксперимент по ЧКВ проводился на пучке BM05 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF), Гренобль, Франция. CB благодарит Explora'doc Auvergne Rhone Alpes и стипендии от Университета Суонси и Университета Гренобль Альпы за финансирование части этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Material : Биологические препараты
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 питательная смесь (ветчина) 500 млGibco by life technologies31331-028
Раствор реагента гентамицина, 50 мг/млGibco by life technologies15750-060
HEPES, специальный препарат, 1M, pH 7,5 фильтрованныйSigmaH-3375
ITS, инсулин-трансферрин-селенGibco by life technologies51500-057
L-аскорбиновая кислота-2-фосфат, сесквимагния сальф гидрат, 95%SigmaA8960-5G
нейтральный буферный формалин (NBF)Sigma AldrichHT501128
фосфатный буферный раствор (PBS) pH 7,4Gibco от life technologies10010023
Оборудование для Culture: < / прочный>
Абсордентный протектор, BenchkoteWhatmanTMCat No. 2300731,Полистереновая подложка, 460 см * 50 м
Для утилизации загрязненной пластиковой лабораторной посуды горлышко должно быть оставлено открытым, чтобы обеспечить проникновение пара, опасных отходов, STERILIN (белый мешок)
Проколы для биопсииMILTEX by KAIref 33-364 & 6 диаметр 4 и 6 мм Клинические
отходы для альтернативной обработки Medium Duty(одобренный ООН вес 5 кг, методы разблокировки, UN- SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (оранжевый пакет)
ПробиркиEppendorfПробирки Falcon 0,5 мл и 1,5 мл
15 мл и 50 мл
Pyrogens 1000ul Beveled Graded, фильтрующий наконечникStarlab, TipOne (стерильный)S1122-1830
без детектируемых РНКазы, ДНКазы, ДНК и Пирогены 20&микро; l Скошенный градуированный, фильтрующий наконечникStarlab, TipOne (стерильный)S1120-1810
без детектируемой РНКазы, ДНКазы, ДНК и Пирогенс 200мкл Скошенный Градуированный, наконечник фильтраStarlab, TipOne (стерильный)S1110-1810
ИнкубаторИнкубатор на 37° C, увлажненная атмосфера с 5% CO2
Оптический микроскоп
Пипетка-мальчик25 мл, 10 мл и 5 мл стерильные пластиковые пипетки
Пипетки (25-10-5 мл)CellStar, Greiner Bio-one
Пластиковый пинцетOxford InstrumentAGT 5230
Скальпельные
наконечникиP1000, P200 и P10 с наконечниками P1000, P200 и P10 (стерильные)
Капюшон
Вакуумный насос
Водяная баня 37° Планшеты
12 и 24 лунок на 12 и 24 лунки
< оборудование для защиты: >
лицевой щиток
перчатки
лабораторный халат
защитные очки
<сильно>Оборудование для сбора данных: программное обеспечение
Fiji программное обеспечениес открытым исходным кодом
Набор инструментовс открытым исходным кодом Программное обеспечение
Автоклавируемый мешок для утилизации Accurpette VWR без детектируемых РНКазы, ДНКазы, ДНК и для культуры тканей для для реконструкции PyHST

Ссылки

  1. Little, C. B., Ghosh, P. Variation in proteoglycan metabolism by articular chondrocytes in different joint regions is determined by post-natal mechanical loading. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (1), 49-62 (1997).
  2. Khan, I. M., et al. Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor β1 induce precocious maturation of articular cartilage. Arthritis and Rheumatology. 63 (11), 3417-3427 (2011).
  3. Khan, I. M., et al. In vitro growth factor-induced bio engineering of mature articular cartilage. Biomaterials. 34 (5), 1478-1487 (2013).
  4. Ascorbate in Cell Culture. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/ascorbate.html (2020).
  5. McNulty, A. L., Vail, T. P., Kraus, V. B. Chondrocyte transport and concentration of ascorbic acid is mediated by SVCT2. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembrane. 1712 (2), 212-221 (2005).
  6. Clark, A. G., Rohrbaugh, A. L., Otterness, I., Kraus, V. B. The effects of ascorbic acid on cartilage metabolism in guinea pig articular cartilage explants. Matrix Biology. 21 (2), 175-184 (2002).
  7. Transferrin in Cell Culture. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/transferrin.html (2020).
  8. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in Vitro. International Journal of Molecular Sciences. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  9. French, M. M., Athanasiou, K. A. Differentiation Factors and Articular Cartilage Regeneration. Topics in Tissue Engineering. Ashammakhi, N., Ferretti, P. , (2003).
  10. Zhang, Y., et al. Platelet-rich plasma induces post-natal maturation of immature articular cartilage and correlates with LOXL1 activation. Science Reports. 7 (1), 3699(2017).
  11. Schepman, K., Engelbert, R. H. H., Visser, M. M., Yu, C., De Vos, R. Kashin Beck Disease: More than just osteoarthrosis - A cross-sectional study regarding the influence of body function-structures and activities on level of participation. International Orthopedics. 35 (5), 767-776 (2011).
  12. Sudre, P., Mathieu, F. Kashin-Beck disease: From etiology to prevention or from prevention to etiology. International Orthopedics. 25 (3), 175-179 (2001).
  13. Allander, E. Kashin-Beck Disease. An analysis of Research and public health activities based on a bibliography 1849-1992. Scandinavian Journal of Rheumatology. 23 (99), 1-36 (1994).
  14. Bissardon, C., et al. Sub-ppm level high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), (2019).
  15. Bissardon, C. Role of Selenium in Articular Cartilage Metabolism, Growth and Maturation. , University of Swansea. Swansea (GB). Available from: https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01942169 (2020).
  16. Bissardon, C., Charlet, L., Bohic, S., Khan, I. Role of the selenium in articular cartilage metabolism, growth, and maturation. Global Advances in Selenium Research from Theory to Application - Proceedings of the 4th International Conference on Selenium in the Environment and Human Health, 2015. , (2016).
  17. Winkel, L. H. E., et al. Environmental selenium research: From microscopic processes to global understanding. Environment Science Technology. 46 (2), 571-579 (2012).
  18. Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: From pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 87 (1034), 20130606(2014).
  19. Horng, A., et al. Cartilage and soft tissue imaging using X-rays: Propagation-based phase-contrast computed tomography of the Human Knee in comparison with clinical imaging techniques and histology. Investigative Radiology. 49 (9), 627-634 (2014).
  20. Labriet, H., et al. High-Resolution X-Ray Phase Contrast Imaging of Maturating Cartilage. Microscopy and Microanalysis. 24, S2 382-383 (2018).
  21. Rougé-Labriet, H., et al. X-ray Phase Contrast osteo-articular imaging: a pilot study on cadaveric human hands. Science Reports. 10 (1911), 41598(2020).
  22. Mittone, A., et al. Characterization of a sCMOS-based high-resolution imaging system. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (6), 1226-1236 (2017).
  23. Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206 (1), 33-40 (2002).
  24. Mirone, A., Brun, E., Gouillart, E., Tafforeau, P., Kieffer, J. The PyHST2 hybrid distributed code for high speed tomographic reconstruction with iterative reconstruction and a priori knowledge capabilities. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 324, 41-48 (2014).
  25. Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: from pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 58 (1), 1-35 (2013).
  26. Vo, N. T., Atwood, R. C., Drakopoulos, M. Superior techniques for eliminating ring artifacts in X-ray micro-tomography. Optic Express. 26 (22), 28396(2018).
  27. Moo, E. K., Osman, N. A. A., Pingguan-Murphy, B. The metabolic dynamics of cartilage explants over a long-term culture period. Clinics. 66 (8), 1431-1436 (2011).
  28. Stender, M. E., et al. Integrating qPLM and biomechanical test data with an anisotropic fiber distribution model and predictions of TGF-β1 and IGF-1 regulation of articular cartilage fiber modulus. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (6), 1073-1088 (2013).
  29. Labriet, H., et al. 3D histopathology speckle phase contrast imaging: from synchrotron to conventional sources. Medical Imaging 2019: Physics of Medical Imaging. Bosmans, H., Chen, G. H., Gilat Schmidt, T. , (2019).
  30. Zdora, M. C., et al. X-ray Phase-Contrast Imaging and Metrology through Unified Modulated Pattern Analysis. Physics Review Letters. 118 (20), 203903(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitro

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.