Method Article

Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей

DOI:

10.3791/61610

⸱

August 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetes Pharmacology, Novo Nordisk A/S, 2Touchstone Diabetes Center, Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описан технический подход к выделению субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из депо внутрибрюшной белой жировой ткани (WAT) мышей путем сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, или отделения иммуномагнитных шариков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стромально-васкулярная фракция (SVF) белой жировой ткани (WAT) удивительно неоднородна и состоит из многочисленных типов клеток, которые функционально способствуют расширению и ремоделированию WAT во взрослом возрасте. Огромным препятствием для изучения последствий этой клеточной гетерогенности является невозможность легко выделить функционально различные субпопуляции клеток из WAT SVF для анализа in vitro и in vivo. Технология секвенирования одиночных клеток недавно выявила функционально различные фибровоспалительные и адипогенные субпопуляции периваскулярных клеток PDGFRβ+ во внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей. Фибровоспалительные предшественники (называемые «FIP») представляют собой неадипогенные клетки, продуцирующие коллаген, которые могут проявлять провоспалительный фенотип. Клетки-предшественники адипоцитов (APC) PDGFRβ+ обладают высокой адипогенной способностью как in vitro, так и in vivo после трансплантации клеток. В данной статье мы описываем несколько методов выделения этих субпопуляций стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT мышей. FIP и APC могут быть выделены с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) или с помощью технологии иммуномагнитных гранул на основе биотинилированных антител. Выделенные клетки могут быть использованы для молекулярного и функционального анализа. Изучение функциональных свойств субпопуляции стромальных клеток в изоляции расширит наши текущие знания о ремоделировании жировой ткани в физиологических или патологических условиях на клеточном уровне.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белая жировая ткань (WAT) является основным местом хранения энергии у млекопитающих. В этой ткани адипоциты, или «жировые клетки», хранят избыточные калории в виде триглицеридов, упакованных в большие однокамерные липидные капли. Кроме того, адипоциты выделяют множество факторов, которые регулируют различные аспекты энергетического гомеостаза 1,2,3. Адипоциты составляют основную часть объема ВАТ; однако адипоциты составляют менее 50% от общего числа клеток, обнаруженных в WAT 4,5. Неадипоцитарный компартмент WAT, или ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы и процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному использованию и уходу за животными Юго-западного медицинского центра Техасского университета.

1. Выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) из гонадной белой жировой ткани

  1. Рассеките гонадную белую жировую ткань у 6-8-недельных мышей и поместите жировые пакеты в 1x раствор PBS.
  2. Объедините до 4 жировых депо (рекомендуется 2-4 депо от 1-2 мышей) и измельчите ткань в стакане объемом 10 мл, содержащем 200 мкл буфера для пищеварения (1x HBSS, 1,5% BSA и 1 мг/мл коллагеназы D).
  3. Переложите измельченную салфетку в центрифужную проби....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает две стратегии, которые позволяют выделить отдельные популяции стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей. АПК и ФИП могут быть выделены с помощью FACS (рис. 1) или иммуномагнитного разделения шариков с биотинилированными антителами (рис. 2). В обоих подходах используются реагенты и антитела, которые коммерчески доступны. Отделение иммуномагнитных шариков приводит к отделению адипогенных клеток от неадипогенных из gWAT SVF.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиная линия C57BL/6 является наиболее часто используемой линией мышей в исследованиях ожирения, вызванного диетой. Мыши C57BL/6 быстро набирают вес при посадке на диету с высоким содержанием жиров (HFD) и развивают некоторые характерные черты метаболического синдрома, связанные с ожирением (например, резистентность к инсулину и гиперлипидемию). Примечательно, что расширение WAT, происходящее в связи с кормлением с высоким содержанием жиров (HFD), происходит специфическим для депо образом 19,20,21,22,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.A.P. является сотрудником и акционером компании Novo Nordisk A/S

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Лизе Хансен и Кирстен Вестергаард за прекрасную техническую помощь, а также. Шереру, Н. Джоффину и К. Кру за критическое прочтение рукописи. Авторы благодарят UTSW Flow Cytometry Core за отличное руководство и помощь в разработке описанных здесь протоколов. R.K.G. поддерживается NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 и NIDDK R01 DK119163. J.P. спонсируется премией за докторскую степень от Инновационного фонда Дании.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильно>механическое препарирование тканей и выделение SVF>
40 и 100 &микро; m клеточные фильтрыFisher Scientific352340/352360
1X Фосфатный буферный раствор (PBS)Fisher Scientific21040CV
5 мл полипропиленовые пробиркиFisher Scientific352053
<сильный>Буфер для сбраживания (для 10 мл)
10 мл HBSSSigmaH8264
10 мг коллагеназы D (1 мг/мл конечная куб.см.)Roche11088882001
0,15 г BSA (1,5 % конечного куб. см.)Fisher ScientificBP1605-100
Иммуномагнитное разделение АПК и не-АПК
5X MojoSort Buffer (MS buffer)BioLegend480017
5 мл MojoSort Magnet (MS magnet)BioLegend480019
100 µ L MojoSort Стрептавидиновые наношарикиBioLegend480015
Purity Check и FACS
10X Буфер для лизиса эритроцитовeBioscience00-4300-54
Fc блок (CD16/CD32 мыши)eBioscience553141
<сильные>антитела
Биотин CD45BioLegend103103концентрация: ≤ 0,25 &; г на 10^6 клеток
Виды: Мышь
Клон: 30-F11
Биотин CD31BioLegend102503Концентрация: ≤ 0,25 &микро; г на 10^6 клеток
Виды: Mouse
Клон: MEC13.3
Biotin CD9BioLegend124803Концентрация: ≤ 0,25 µ г на 10^6 клеток
Виды: Mouse
Клон: MZ3
Biotin LY6CBioLegend128003Концентрация: ≤ 0,25 µ г на 10^6 клеток
Виды: Mouse
Клон: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5BioLegend102419Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: 390
CD45-PerCP/Cy5.5BioLegend103131Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PEBioLegend136006Концентрация: Разведение 1:50
Виды: Mouse
Клон: APB5
LY6C-APCBioLegend128016Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: HK1.4
CD9-FITCBioLegend124808Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: MZ3
Cell Culture и Дифференцировка
<сильная>Гонадная питательная среда APC (для 500 мл)
288 мл DMEM с 1 г/л глюкозыCorning10-014-CV
192 мл MCDB201SigmaM6770
10 мл фетальная бычья сыворотка (FBS)** лот#14E024Sigma12303C
5 мл 100% премикс ITSBD Bioscience354352
5 мл 10 мМ L-аскорбиновая кислота-2-2фосфатSigmaA8960-5G
50 и микро; L 100 г/мл FGF-basicR& D системы3139-FB-025/CF
5 мл Pen/StrepCorning30-001-CI
500 &микро; L GentamycinGibco15750-060
**ПРИМЕЧАНИЕ: Адипогенная способность первичных АПК может варьироваться от партии к партии коммерческого FBS. Следует протестировать несколько партий/источников FBS.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Funcke, J. B., Scherer, P. E.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose Tissue Stromal CellsFluorescence Activated Cell SortingImmunomagnetic Bead SeparationStromal Vascular Fraction IsolationAdipogenic Progenitor CellsFibroinflammatory Progenitor CellsFlow Cytometry AnalysisCell Culture DifferentiationPerigonadal White AdiposePDGFR Beta Positive Cells

Related Articles