Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61610

⸱

16 августа 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetes Pharmacology, Novo Nordisk A/S, 2Touchstone Diabetes Center, Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описан технический подход к выделению субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из депо внутрибрюшной белой жировой ткани (WAT) мышей путем сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, или отделения иммуномагнитных шариков.

Аннотация

Стромально-васкулярная фракция (SVF) белой жировой ткани (WAT) удивительно неоднородна и состоит из многочисленных типов клеток, которые функционально способствуют расширению и ремоделированию WAT во взрослом возрасте. Огромным препятствием для изучения последствий этой клеточной гетерогенности является невозможность легко выделить функционально различные субпопуляции клеток из WAT SVF для анализа in vitro и in vivo. Технология секвенирования одиночных клеток недавно выявила функционально различные фибровоспалительные и адипогенные субпопуляции периваскулярных клеток PDGFRβ+ во внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей. Фибровоспалительные предшественники (называемые «FIP») представляют собой неадипогенные клетки, продуцирующие коллаген, которые могут проявлять провоспалительный фенотип. Клетки-предшественники адипоцитов (APC) PDGFRβ+ обладают высокой адипогенной способностью как in vitro, так и in vivo после трансплантации клеток. В данной статье мы описываем несколько методов выделения этих субпопуляций стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT мышей. FIP и APC могут быть выделены с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) или с помощью технологии иммуномагнитных гранул на основе биотинилированных антител. Выделенные клетки могут быть использованы для молекулярного и функционального анализа. Изучение функциональных свойств субпопуляции стромальных клеток в изоляции расширит наши текущие знания о ремоделировании жировой ткани в физиологических или патологических условиях на клеточном уровне.

Введение

Белая жировая ткань (WAT) является основным местом хранения энергии у млекопитающих. В этой ткани адипоциты, или «жировые клетки», хранят избыточные калории в виде триглицеридов, упакованных в большие однокамерные липидные капли. Кроме того, адипоциты выделяют множество факторов, которые регулируют различные аспекты энергетического гомеостаза 1,2,3. Адипоциты составляют основную часть объема ВАТ; однако адипоциты составляют менее 50% от общего числа клеток, обнаруженных в WAT 4,5. Неадипоцитарный компартмент WAT, или стромально-васкулярная фракция (SVF), довольно гетероген и содержит сосудистые эндотелиальные клетки, тканевые резидентные иммунные клетки, фибробласты и популяции клеток-предшественников адипоцитов (APC).

WAT исключительна своей замечательной способностью расширяться в размерах по мере роста спроса на хранение энергии. Поддержание этой пластичности тканей имеет важное значение, поскольку адекватное хранение липидов в WAT защищает от вредного эктопического отложения липидов в нежировых тканях6. Способ, которым отдельные депо WAT претерпевают это расширение в ответ на избыток калорий, является критическим фактором, определяющим чувствительность к инсулину в условиях ожирения. Патологическое расширение ВАТ, наблюдаемое у лиц с ожирением и метаболическим синдромом, характеризуется преимущественным расширением висцеральных депо ВАТ за счет метаболически благоприятной подкожной жировой ткани. Кроме того, инсулинорезистентность при ожирении связана с патологическим ремоделированием ВАТ. Это характеризуется гипертрофическим ростом имеющихся адипоцитов (увеличением в размерах), недостаточным ангиогенезом, хроническим метаболическим воспалением, накоплением компонентов внеклеточного матрикса (фиброзом) и гипоксией тканей 8,9. Эти WAT-фенотипы ожирения связаны со стеатозом печени и инсулинорезистентностью, аналогично тому, что наблюдается при липодистрофии (отсутствии функциональной WAT). Напротив, здоровое расширение WAT наблюдается в метаболически здоровой популяции с ожирением и характеризуется преимущественным расширением защитного подкожного WAT и расширением депо через гиперплазию адипоцитов10. Рекрутирование новых адипоцитов опосредовано дифференцировкой адипоцитов de novo из клеток-предшественников адипоцитов (APC) (так называемая «адипогенез»). Гиперплазия адипоцитов совпадает с относительно более низкими степенями фиброза WAT и метаболического воспаления 6,11. Множество типов клеток в микроокружении WAT напрямую влияют на здоровье и расширяемость WAT при ожирении12. Таким образом, определение функций различных типов клеток, присутствующих в WAT, остается высокоприоритетным для данной области.

За последнее десятилетие было использовано несколько стратегий для определения и изоляции нативных APC от WAT SVF13 человека и мыши. Такие стратегии выделяют АПК на основе экспрессии на клеточной поверхности общих мезенхимальных маркеров стволовых/прогениторных клеток с использованием методов разделения клеток на основе антител. Эти подходы включают флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS) с использованием антител, меченных флуорофорами, или иммуномагнитное разделение шариков (т.е. химически модифицированные антитела). Белки клеточной поверхности, предназначенные для выделения APC, включают PDGFRα, PDGFRβ, CD34 и SCA-1. Эти подходы помогли обогатить APC; Однако клеточные популяции, выделенные на основе этих маркеров, достаточно неоднородны. Совсем недавние исследования секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq) выявили молекулярную и функциональную гетерогенность стромальных клеток в пределах изолированной стромально-васкулярной фракции (SVF) мышиного WAT 14,15,16,17. С помощью нашего собственного scRNA-seq и функционального анализа мы идентифицировали и охарактеризовали функционально различные иммуномодулирующие и адипогенные субпопуляции периваскулярных клеток PDGFRβ+ в стромальном компартменте внутрибрюшной WAT у взрослых мышей15. Фибровоспалительные предшественники, или FIP, представляют собой заметную субпопуляцию PDGFRβ+ клеток и могут быть выделены на основе экспрессии LY6C (LY6C+ PDGFRβ+ клеток)15. ФИП обладают адипогенной способностью, оказывают сильное провоспалительное реагирование на различные раздражители, продуцируют коллаген и секретируют антиадипогенные факторы15. Провоспалительная и фиброгенная активность этих клеток увеличивается в связи с ожирением у мышей, что делает эти клетки регуляторами ремоделирования ВАТ. Субпопуляция LY6C-CD9-PDGFRβ+ представляет собой клетки-предшественники адипоцитов (APC). Эти APC обогащены экспрессией Pparg и других проадипогенных генов и легко дифференцируются в зрелые адипоциты in vitro и in vivo15. Здесь мы предоставляем подробный протокол для выделения этих отдельных клеточных популяций из внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей с использованием FACS и отделения иммуномагнитных гранул с биотинилированными антителами. Этот протокол может быть использован для выделения функционально различных субпопуляций жировых предшественников из множественных внутрибрюшных депо WAT взрослых самцов и самок мышей15. Изучение этих функционально различных клеточных популяций по отдельности может внести большой вклад в наше текущее понимание молекулярных механизмов, которые регулируют адипогенез и ремоделирование внутрибрюшной жировой ткани в здоровом и больном состоянии.

В приведенном ниже протоколе подробно описано выделение жировых предшественников из придатка яичка матки мышей; однако та же процедура может быть использована для выделения соответствующих клеток из брыжеечных и забрюшинных депо WAT как самцов, так и самок мышей15. Подробный протокол о том, как идентифицировать и изолировать эти депо у мышей, можно найти в Bagchi et al.18. Этот протокол был оптимизирован для использования мышами в возрасте 6-8 недель. Частота и дифференцировочная способность АПК могут снижаться в связи со старением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы и процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному использованию и уходу за животными Юго-западного медицинского центра Техасского университета.

1. Выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) из гонадной белой жировой ткани

  1. Рассеките гонадную белую жировую ткань у 6-8-недельных мышей и поместите жировые пакеты в 1x раствор PBS.
  2. Объедините до 4 жировых депо (рекомендуется 2-4 депо от 1-2 мышей) и измельчите ткань в стакане объемом 10 мл, содержащем 200 мкл буфера для пищеварения (1x HBSS, 1,5% BSA и 1 мг/мл коллагеназы D).
  3. Переложите измельченную салфетку в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую буфер для разложения объемом 10 мл.
  4. Смесь выдерживать при температуре 37 °C на водяной бане в течение 1 ч при встряхивании.
  5. Отфильтруйте переваренную ткань через клеточное ситечко 100 мкм, чтобы удалить непереваренную ткань.
  6. Отфильтрованный образец разбавить до 30 мл PBS, содержащим 2% FBS, и центрифугировать при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость, которая содержит зрелые адипоциты.
  7. Немедленно приступайте к предпочтительному методу выделения клеток.

2. Изоляция АПК и ФИП с помощью FACS

  1. Растворите гранулу в 1 мл 1x буфера для лизиса эритроцитов, слегка встряхивая пробирку.
  2. Инкубировать при RT в течение 1-2 мин.
  3. Добавьте 10 мл 2% FBS/PBS и пропустите через сетчатое фильтр 40 μм в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  4. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Аспирируйте среду и ресуспендируйте гранулу в 400-800 мкл 2% FBS/PBS, содержащего блок Fc (1:200).
  6. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 10 минут.
  7. Перенесите 400 мкл-800 мкл клеточных суспензий, содержащих ≤106 клеток/мл, в пробирки объемом 1,5 мл и добавьте антитела. Концентрации антител указаны в разделе «Таблица материалов ».
    1. Подготовьте отдельные контрольные трубки для 1) неокрашенных клеток, 2) одноцветных регуляторов и 3) регуляторов FMO (флуоресценция минус один).
    2. Окрашивают образцы антителами PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.
  8. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 15 минут в защищенном от света месте.
  9. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  10. Аспиратируйте среды и ресуспендируйте клетки в 400 мкл 2% FBS/PBS.
  11. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  12. Аспирация среды и ресуспендирование клеток в 400-800 мкл 2% FBS/PBS. Затем пропустите через фильтрующие колпачки 40 мкм в полистирольные пробирки с круглым дном объемом 5 мл для FACS.
  13. Выполните следующие действия для гейтинга.
    1. Используйте незагрязненные и одноцветные элементы управления для компенсации.
    2. Используйте элементы управления FMO для установки экспериментальных гейтов.
    3. Используйте стратегию стробирования, показанную на рисунке 1, для получения APC и FIP. Гейт APC как CD45-CD31-PDGFRβ+ LY6C-CD9- и FIPS как CD45-CD31-PDGFRβ+ LY6C+ клетки.
  14. Соберите отсортированные клетки в пробирки, содержащие 500 μл 100% сыворотки, и поддерживайте клетки на льду.
  15. Центрифугируйте ячейки при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C. Добавьте 2% FBS/PBS для промывки ячеек путем повторного центрифугирования при 600 x g в течение 5 минут при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости, используйте гранулированные клетки.
  16. Ресуспендируйте гранулированные клетки в соответствующем объеме гонадной питательной среды APC (для культивирования клеток) или соответствующем буфере для последующего анализа.

3. Иммуномагнитное разделение адипогенных и неадипогенных фракций

  1. Выделите SVF из гонадной белой жировой ткани, следуя шагам 1.1-1.7.
  2. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу SVF в 10 мл 1x коммерчески доступного MS Buffer.
  3. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр 40 мкм.
  4. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулированные клетки в 100 мкл 1x MS Buffer.
  6. Выполните истощение клеток CD31+ и CD45+ , как описано ниже (Рисунок 2A, Шаг 1). Это делается для удаления эндотелиальных и кроветворных клеток линии.
    1. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию до ≤ 1 x 108 клеток/мл.
    2. Добавьте конъюгированные с биотином антитела CD31 и CD45 в клеточную суспензию в концентрации ≤ 0,25 мкг на 106 клеток и инкубируйте на льду в течение 15 мин.
    3. Промойте ячейки, добавив 4 мл 1x MS Buffer.
    4. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    5. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу 100 мкл 1x MS буфера.
    6. Добавьте 10 μл наногранул стрептавидина и инкубируйте клетки на льду в течение 15 минут.
    7. Промойте ячейки, добавив 4 мл 1x MS буфера.
    8. Центрифугируйте при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C, затем аспирируйте надосадочную жидкость.
    9. Ресуспендируйте клетки в 2,5 мл 1x MS буфера и перенесите в полипропиленовую пробирку объемом 5 мл.
    10. Поместите трубку в магнитную решетку на 5 минут.
    11. Соберите немаркированные клетки, вылив клеточную суспензию в чистую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте стряхивания или промокания свисающих капель, так как это приводит к загрязнению нежелательными клеточными фракциями.
    12. Снимите трубку с магнита и повторите шаги 3.6.9. по 3.6.11. Еще два раза, итого 3 стирки.
  7. Разделение адипогенной и неадипогенной фракций (рис. 2А, шаг 2)
    1. Продолжайте работу с немеченой фракцией (т.е. CD45-CD31-фракция).
    2. Центрифугируйте пробирку объемом 15 мл, содержащую немеченые клетки, при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл 1x MS буфера.
    4. Добавить конъюгированные с биотином антитела LY6C и CD9 соответственно в концентрации ≤ 0,25 мкг на 106 клеток и инкубировать на льду в течение 15 мин.
    5. Выполните шаги 3.6.3. к 3.6.12. , чтобы завершить второе отделение.
    6. Собирайте несвязанные дроби. Немеченые клетки (LY6C-CD9-) представляют собой адипогенную фракцию, содержащую APC (рис. 2A, шаг 3).
    7. Извлеките трубку из магнита, ресуспендируйте и элюируйте связанные клетки в 1x MS буфере. Элюатная или меченая фракция (LY6C+ CD9+) представляет собой неадипогенную фракцию, содержащую FIP (рис. 2A, шаг 3).
    8. Центрифуга для меченых и немеченых фракций при 600 x g в течение 5 мин до грануляторов при 4 °C.
  8. Немедленно приступайте к культивированию клеток (шаг 6) или используйте недифференцированные предшественники для предпочтительных анализов (шаг 4 и/или шаг 5).

4. Оценка чистоты адипогенных и неадипогенных фракций методом проточной цитометрии

  1. Ресуспендируйте изолированные гранулами клеточные фракции в 200-400 мкл 2% FBS/PBS, содержащего Fc-блок (1:200).
  2. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 10 минут.
  3. Перенесите клеточную суспензию в пробирки объемом 1,5 мл и добавьте антитела. Концентрации антител указаны в Таблице материалов.
    1. Подготовьте отдельные контрольные трубки для 1) неокрашенных ячеек, 2) одноцветных регуляторов и 3) регуляторов FMO.
    2. К образцам добавьте антитела к CD45, CD31, CD9 и LY6C.
  4. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 15 минут в защищенном от света месте.
  5. Центрифугируйте при 600 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  6. Аспиратируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 400 мкл 2% FBS/PBS.
  7. Центрифугируйте суспензию при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  8. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 400-800 мкл 2% FBS/PBS. Отфильтруйте через фильтрующие колпачки 40 мкм в полистирольные пробирки с круглым дном объемом 5 мл для анализа с помощью проточной цитометрии.
  9. Анализ проточной цитометрии для оценки чистоты
    1. Используйте незагрязненные и одноцветные элементы управления для компенсации.
    2. Используйте элементы управления FMO для установки экспериментальных гейтов.
    3. Используйте стратегию стробирования для живых и одиночных клеток, как показано на рисунке 2B.
    4. Выполните стробирование, как показано на рисунке 2B для CD45, CD31, LY6C и CD9.
    5. Используйте программное обеспечение для проточной цитометрии для оценки частот CD45--CD31-LY6C-CD9-клеток (APC) и CD45-CD31-LY6C+ клеток (FIP) в пределах выделенных фракций.

5. Анализ экспрессии генов с помощью количественной ПЦР для оценки чистоты FIP и APC

  1. Извлеките мРНК из магнитных или FACS-изолированных клеток с помощью коммерчески доступного набора для экстракции (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Используйте 1 г РНК для синтеза кДНК с помощью набора для обратной транскриптазы кДНК (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
  3. Определение относительных уровней мРНК APC и FIPs-селективных генов (табл. 1) методом количественной ПЦР с использованием зеленого мастер-микса SYBR для ПЦР.
    1. Настройте реакцию образца для ПЦР следующим образом: 5 мкл 2x зеленого красителя SYBR, 1 мкл кДНК (~50 нг/мкл), по 0,5 мкл каждого прямого и обратного праймера (10 мкМ) и 3 мкл воды.
    2. Для количественного прогона ПЦР используют следующие стандартные условия ПЦР: стадия удержания: 50 °C в течение 2 мин, 95 °C в течение 10 мин; Этап ПЦР (40 циклов): 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 1 мин.
  4. Нормализуйте значения до уровня генов домашнего хозяйства (Rps18) путем вычисления ΔΔ-Ct.
  5. Чтобы оценить статистическую значимость, выполните непарный t-критерий Стьюдента.

6. Клеточная культура и дифференцировка

  1. Центрифугируйте магнитно-изолированные или FACS-изолированные клетки при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  2. Ресуспендируйте гранулу в 500 мкл гонадной питательной среды APC и проложите 40K клеток/лунку из каждой фракции в 48-луночном культуральном планшете.
  3. Заменяйте носители каждые 1-2 дня. APC начнут подвергаться дифференцировке в адипоциты по мере приближения к слиянию. FIP, содержащиеся в той же среде, устойчивы к адипогенезу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает две стратегии, которые позволяют выделить отдельные популяции стромальных клеток из внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей. АПК и ФИП могут быть выделены с помощью FACS (рис. 1) или иммуномагнитного разделения шариков с биотинилированными антителами (рис. 2). В обоих подходах используются реагенты и антитела, которые коммерчески доступны. Отделение иммуномагнитных шариков приводит к отделению адипогенных клеток от неадипогенных из gWAT SVF...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мышиная линия C57BL/6 является наиболее часто используемой линией мышей в исследованиях ожирения, вызванного диетой. Мыши C57BL/6 быстро набирают вес при посадке на диету с высоким содержанием жиров (HFD) и развивают некоторые характерные черты метаболического синдрома, связанные с ожирением (например, резистентность к инсулину и гиперлипидемию). Примечательно, что расширение WAT, происходящее в связи с кормлением с высоким содержанием жиров (HFD), происходит специфическим для депо образом 19,20,21,22,23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

T.A.P. является сотрудником и акционером компании Novo Nordisk A/S

Благодарности

Авторы выражают благодарность Лизе Хансен и Кирстен Вестергаард за прекрасную техническую помощь, а также. Шереру, Н. Джоффину и К. Кру за критическое прочтение рукописи. Авторы благодарят UTSW Flow Cytometry Core за отличное руководство и помощь в разработке описанных здесь протоколов. R.K.G. поддерживается NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 и NIDDK R01 DK119163. J.P. спонсируется премией за докторскую степень от Инновационного фонда Дании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>механическое препарирование тканей и выделение SVF>
40 и 100 &микро; m клеточные фильтрыFisher Scientific352340/352360
1X Фосфатный буферный раствор (PBS)Fisher Scientific21040CV
5 мл полипропиленовые пробиркиFisher Scientific352053
<сильный>Буфер для сбраживания (для 10 мл)
10 мл HBSSSigmaH8264
10 мг коллагеназы D (1 мг/мл конечная куб.см.)Roche11088882001
0,15 г BSA (1,5 % конечного куб. см.)Fisher ScientificBP1605-100
Иммуномагнитное разделение АПК и не-АПК
5X MojoSort Buffer (MS buffer)BioLegend480017
5 мл MojoSort Magnet (MS magnet)BioLegend480019
100 µ L MojoSort Стрептавидиновые наношарикиBioLegend480015
Purity Check и FACS
10X Буфер для лизиса эритроцитовeBioscience00-4300-54
Fc блок (CD16/CD32 мыши)eBioscience553141
<сильные>антитела
Биотин CD45BioLegend103103концентрация: ≤ 0,25 &; г на 10^6 клеток
Виды: Мышь
Клон: 30-F11
Биотин CD31BioLegend102503Концентрация: ≤ 0,25 &микро; г на 10^6 клеток
Виды: Mouse
Клон: MEC13.3
Biotin CD9BioLegend124803Концентрация: ≤ 0,25 µ г на 10^6 клеток
Виды: Mouse
Клон: MZ3
Biotin LY6CBioLegend128003Концентрация: ≤ 0,25 µ г на 10^6 клеток
Виды: Mouse
Клон: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5BioLegend102419Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: 390
CD45-PerCP/Cy5.5BioLegend103131Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PEBioLegend136006Концентрация: Разведение 1:50
Виды: Mouse
Клон: APB5
LY6C-APCBioLegend128016Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: HK1.4
CD9-FITCBioLegend124808Концентрация: Разведение 1:400
Виды: Mouse
Клон: MZ3
Cell Culture и Дифференцировка
<сильная>Гонадная питательная среда APC (для 500 мл)
288 мл DMEM с 1 г/л глюкозыCorning10-014-CV
192 мл MCDB201SigmaM6770
10 мл фетальная бычья сыворотка (FBS)** лот#14E024Sigma12303C
5 мл 100% премикс ITSBD Bioscience354352
5 мл 10 мМ L-аскорбиновая кислота-2-2фосфатSigmaA8960-5G
50 и микро; L 100 г/мл FGF-basicR& D системы3139-FB-025/CF
5 мл Pen/StrepCorning30-001-CI
500 &микро; L GentamycinGibco15750-060
**ПРИМЕЧАНИЕ: Адипогенная способность первичных АПК может варьироваться от партии к партии коммерческого FBS. Следует протестировать несколько партий/источников FBS.

Ссылки

  1. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  4. Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
  5. Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
  6. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  7. Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
  8. Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324(2009).
  9. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  10. Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
  11. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  12. Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30(2016).
  13. Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
  14. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
  15. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636(2018).
  16. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501(2019).
  17. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
  18. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).
  19. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
  20. Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
  21. Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
  22. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  23. Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861(2018).
  24. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  25. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  26. Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
  27. Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890(2018).
  28. Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
  29. Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PDGFR
Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.