Этот метод позволяет записывать силу подергивания и тетаничных сокращений и потенциалов действия в трех типах моторных агрегатов в крысиной медиальной мышце гастроконемиуса. Функциональная изоляция одного моторного агрегата вызвана электрической стимуляцией аксона.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Функциональная изоляция однодвигательных агрегатов крысиных медиальных мышц гастроконемиуса
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этой работе излагается функциональная изоляция моторных агрегатов (МУ), стандартный электрофизиологический метод определения характеристик моторных агрегатов в мышцах заднего мозга (таких как медиальный гастрокнеймиус, подошва или подошва мышц) у экспериментальных крыс. Ключевым элементом метода является применение электрических стимулов, поставляемых в моторный аксон, изолированный от брюшного корня. Стимулы могут быть доставлены с постоянными или переменными межимпульсными интервалами. Этот метод подходит для экспериментов на животных на разных стадиях зрелости (молодых, взрослых или старых). Кроме того, этот протокол может быть использован в экспериментах по изучению изменчивости и пластичности моторных агрегатов, вызванных большим спектром вмешательств. Результаты этих экспериментов могут как увеличить базовые знания в области физиологии мышц и быть переведены в практическое применение. Эта процедура фокусируется на хирургической подготовке для записи и стимуляции MUs, с акцентом на необходимые шаги для достижения стабильности подготовки и воспроизводимости результатов.
Введение
Моторные агрегаты (МУ) являются самыми маленькими функциональными единицами скелетных мышц. Поэтому понимание их функции, пластичности и контрактильные свойства, а также механизмы их силового регулирования имеют решающее значение для прогресса в мышечной физиологии. Основные контрактильные свойства MUs и пропорции их физиологических типов были задокументированы для многочисленных мышц, преимущественно мышц задней части тела у экспериментальных животных. Однако и пластичность свойств MU, и механизмы силового регулирования MU до сих пор до конца не поняты.
Принцип описанного метода является обширная денервация мышц задней конечности, за исключением исследованных один и ламинэктомии на поясничных позвонков для того, чтобы подготовить тонкие желудочные корни, каждый из которых содержит один "функциональный" моторный аксон, стимулировали электрически для записи силы и действия потенциала МУ. Используя технику, описанную в этой работе, можно изолировать более половины MUs медиальной мышцы гастрокнеймиуса в успешном эксперименте. Крыса медиальной gastrocnemius состоит в среднем из 52 MUs (женщины) или 57 MUs (мужчины) из трех физиологических типов: S (медленно), FR (быстро устойчивый) и FF (быстрый жир)1,2, и имеют переменные контрактильныесвойства 3. Для экспериментов, сравнивающих средние значения для МУ в контрольных и экспериментальных группах, необходима изоляция и запись 10-30 МУ для каждой из этих групп. Критически, индивидуальные MUs могут быть доступны для стимуляции для периодов времени превышая один час. Кроме того, поскольку этот метод позволяет записывать как силу MU, так и потенциал действия, этот метод подходит для изучения явлений, связанных с силовым производством, оценки эффекта усталости и наблюдения за взаимосвязью между силой и потенциалом действия.
Предыдущие исследования подтвердили, что МУ контрактильные свойства пластичные и могут модулироваться многочисленными вмешательствами. Эксперименты с использованием техники, описанной здесь были выполнены на крысы медиальной gastrocnemius4 или других мышц заднегоконечностей крысы 5,6, а также на кошачьихмышц 7, используя аналогичный метод одной изоляции MU. Другая серия экспериментов с использованием поездов стимулов, поставляемых с переменными межимпульсными интервалами, обеспечила наблюдения относительно процессов управления двигателем, и результаты в целом обращают внимание наисториюстимуляции, включая значительные последствия сдвига во времени шкалы даже одного стимула, решающее значениедля силового производства 8,9.
MUs также могут быть изучены с использованием альтернативных методов. Во-первых, одним из методов является прямая стимуляция мотонейронов. Берк использовал внутриклеточную стимуляцию мотонейронов у кошачьего медиального гастрокневиуса и подошвы со стеклянными микроэлектродами, используемыми параллельно для определения электрофизиологических свойствэтих нейронов 1,10. Другие методы были предложены для изучения MUs в мышцах человека, которые требуют значительно более низкого вмешательства. Для всех этих методов, стимулирующие и записи электродов вставляются в мышцы или нервы, и сила записывается из пальца или с ноги. Первый из этих методов был использован для изучения MUs в первой спинной interosseous мышцы. Для этой мышцы, заразив с низкой силой, в электромиограмме, записанной с помощью электрода иглы, вставленного в мышцу, были выявлены потенциалы действия только одного активного моторного агрегата. Затем фрагменты мышечной силы, записанные параллельно и после каждого действия потенциал были усреднены (шип-срабатывает усреднение). Этот метод позволяет извлечения силы одного моторного блока из мышечной силы записи11. Однако методологическая слабость этой процедуры заключается в том, что ни одна сила подергивания, а скорее фрагменты тетаничных сокращений были усреднено. Человеческие MUs также могут быть изучены с помощью второго метода внутримышечной электрической микростимуляции с помощьюэлектрода, вставленного в мышцу 12, который стимулирует фрагмент аксонального дерева, что приводит к активации одного моторного блока. Третий метод - микростимуляция с вставленным в нерв электродом. Когда электрод активирует только один моторный аксон в нерве, только один моторный блок контракты13. Эти последние методы имеют некоторые ограничения, включая стабильность и качество записи, этические ограничения и доступ к экспериментальному материалу. Этот протокол широко используется у кошек в 70-х и 80-х14.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры должны быть одобрены местным комитетом по этике и соблюдать руководящие принципы Европейского союза по уходу за животными, а также национальный закон о защите животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый экспериментатор, участвующий в этой процедуре, должен пройти подготовку по основным хирургическим процедурам и получить действительную лицензию на выполнение экспериментов на животных.
1. Анестезия
- Анестезировать крысу с помощью внутриперитонеальной инъекции пентобарбитала натрия (начальная доза 60 мгкг -1).
- Примерно через 5 минут проверьте глубину анестезии, ущипнув крысиный ухо или передовую тупыми щипсями. Перейти к следующим шагам протокола только тогда, когда рефлекторное действие не наблюдается.
- Во время операции проверяйте животное на рефлекторные действия каждые 10-15 минут и дополняйте анестезию, если животное реагирует на щепотку движением (обычно, 10мг/кг -1ч -1 пентобарбитал натрия, IP).
2. Хирургия
- Подготовь животное к хирургической процедуре путем бритья меха над левой задней частью от пятки до бедра (первый сегмент, мышечная и нервная изоляция), правая задняя часть от пятки до бедра (второй сегмент, наземный электрод) и задняя часть от хвоста до грудных сегментов (третий сегмент, ламинэктомия). Антисептик не нужен из-за острого характера эксперимента.
- Поместите крысу на живот на грелку (37 градусов по Цельсию ± 1 градус по Цельсию).
- Ламинэктомия
- Используя остро тупые ножницы, вырежьте кожу вдоль позвоночника от крестца до грудных позвонков.
- Отделить кожу от основных мышц.
- Используя тупые ножницы кончика, вырезать мышцы longissimus по обе стороны крестца и поясничных спинных процессов.
- Определите позвонок S1 как самый низкий сегмент. Используя острые тупые ножницы, вырезать и удалить спинные процессы от L6 до L2 позвонков. Далее, используя тонкие rongeurs, удалить поперечные процессы L6-L2 и выполнить ламинэктомии над L6 - L2 сегментов (сначала поперечные процессы, затем ламина, начать с L6 позвонков сегмента), чтобы разоблачить поясничных сегментов спинного мозга, покрытых dura mater. Будьте осторожны, чтобы не сократить сакральной кости и L1 спиновой процесс, который будет использоваться в качестве точки фиксации для иммобилизации животных.
- Используя острые ножницы, вырезать спинной мозг (его хвостовой фрагмент) и спинных и желудочковых корней на уровне сегмента L2 позвонков, на верхней границе ламинэктомии. Поместите небольшие кусочки высушенной гелеобразной пены, чтобы остановить кровотечение. Далее поместите тонкую, пропитанную солевым раствором вату над открытыми сегментами спинного мозга.
- Изоляция медиальной мышцы гастрокнейма и ее нерва
- Используя остро-тупые ножницы, сделайте продольный разрез на задней стороне левой задней конечности, от ахиллова сухожилия до бедра.
- Возьмите кожу с тисью и отделить кожу от основных мышц по обе стороны разреза.
- Найдите popliteal fossa в задней части коленного сустава, который покрыт мышцей бицепса фемориса. Используя ножницы, сделайте разрез между передней и задней частью этой мышцы.
- Двигаясь вверх, вырезать две головы бицепса femoris вся дорогу до бедра подвергать седалищного нерва.
- Используя тупые типсы и ножницы, отделяйте боковой от медиальной головы мышцы гастрокнеймиуса и отрежьте дистальную вставку (ахиллово сухожилие) медиальной мышцы гастрокнейма. Сохранить фрагмент ахиллова сухожилия как можно больше времени для того, чтобы использовать его для подключения к силе превлододер.
- Определите медиальный желудочно-кишечный нерв (МГ). Используя типсы и ножницы, вырезать все оставшиеся залоги седалищного нерва, в том числе залога задних бицепсов и semitendinosus. Оставьте запас кровеносных сосудов в медиальной gastrocnemius нетронутыми.
- Нить неупругой лигатуры через ахиллово сухожилие и сделать три узла.
- Поместите пропитанный раствором кусок ваты под открытый нерв и мышцы.
- Используя зубчатые миппы, закройте кожу над прооперированным районом.
- Используя остро тупые ножницы, сделайте разрез на 2 см в коже и лежащей в основе соединительной ткани вдоль передней стороны левой задней конечности для иммобилизации металлическим зажимом (3.1.6.).
3. Подготовка к записи и стимуляции
- Позвоночная колонка и фиксация ног и расположение мышц
- Используя стальной зажим, исправить левую заднюю конечность, поставив зажим на голени.
- Поместите крысу в специально изготовленную регулируемую раму (изолированная медная проволока, 1 мм), подтяните лоскуты кожи вокруг ламинэктомии с помощью четырех лигатур и шов кожи к раме, чтобы сформировать бассейн для парафинового масла (размером примерно 50 мм х 50 мм) над открытым спинным мозгом.
- Используя дюмонский #55, поднимите матер дуры на пересечении спинного мозга, разрежьте ее до сакральной кости и убирайте ее.
- Используя тупой стеклянный стержень, отдельные левые и правые спинные и брюшной корни на последовательных уровнях, заботясь, чтобы не повредить их.
- Заполните бассейн над спинным мозгом теплым (37 градусов по Цельсию) парафиновое масло, покрывая открытые брюшной и спинной корни.
- Поместите крысу на изготовленную на заказ алюминиевую пластину (длина 260 мм, ширина 120 мм, высота 80 мм) с бассейном (длина 135 мм, ширина 100 мм, глубина 45 мм) для задних конечностей, подключенных к системе отопления замкнутой петли. Пластина является местом, где животное будет обездвижено и эксперимент будет выполнен.
- Исправить зажим положить на левый задний с металлическим баром, чтобы обездвижить задний.
- Исправьте позвоночник, поставив стальные зажимы на сакральной кости и позвонка L1, чтобы обездвижить тело животного и устранить артефакты в силу записей, связанных с дыхательными движениями.
- Соедините левую медиальную мышцу гастрокнеймиуса с неупругой лигатурой к препровогам силы (при соблюдении 50 мкм/250 мН, дальность измерения 0-1000 мН) через ахиллово сухожилие.
- Заполните камеру для задних конечностей теплым (37 градусов по Цельсию) парафиновое масло, чтобы покрыть медиальной мышцы гастрокнемиуса и поддерживать температуру масла при температуре 37 градусов по Цельсию ± 1 КК с помощью зонда температуры и автоматической системы.
- Размещение электродов для записи и стимуляции потенциалов действия
- Вставьте биполярный электрод серебряной проволоки через среднюю часть медиальной мышцы гастрокнемиуса, перпендикулярно его длинной оси. Поддерживайте расстояние около 5 мм между двумя электродами, расположенными вдоль длинной оси мышцы. Эти электроды будут использоваться для записи потенциалов действия моторных агрегатов (MUAPs). Подключите электроды к малошумный усилитель.
- Растянуть оперировать мышцу до пассивного напряжения 100 мН, контролируемого преминдасером силы. Для крыс медиальной gastrocnemius на этом участке MUs трех типов развивать самую высокую силу подергивания15.
- Используя остро-тупые ножницы, сделайте разрез на 2 см в коже правой задней конечности и вставьте электроде из серебряной проволоки, который будет использоваться в качестве эталонного электрода.
- Поместите и зафиксируете изготовленную на заказ изолированную металлическую пластину (размер 30 мм х 13 мм) над открытыми корнями позвоночника. Положите на тарелку левые пары вентралных и спинных корней (L4, L5 и L6).
- Добавьте солевой раствор в бассейн, образованный кожей вокруг ламинэктомии. Уровень солевого раствора должен быть ниже изолированной пластины.
- Поместите серебряную проволоку, стимулирующую электрод (два серебряных провода диаметром 0,5 мм, длина 50 мм) над открытыми спинальными корнями, поместите положительный полюс на 3 мм над пластиной в масле, в то время как отрицательный полюс в солевом растворе (добавлен в бассейн, ниже пластины) и подключим к стимулятору.
4. Записи моторных агрегатов
- Стимулируя электрическими прямоугольными импульсами (продолжительность 0,1 мс, амплитуда до 0,5 В), выберите вентраловые корни (L4, L5 и L6); стимуляция брюшного корня вызывает сокращение мышц, в то время как нет такого эффекта для спинных корней. Исключите спинные корни из пластины. Для медиальной гастрокнеймии большинство аксонов находятся в вентеральный корень L5.
- Используя пару типсов Dumont #55 и увеличительные очки, разделите вентральные корни L5 или L4 на очень тонкие пучки аксонов (захватите разрезанный конец брюшного корня с помощью типсов и очистите корень на части); поместите один из этих пучков на электрод серебряной проволоки и стимулировать (0,1 мс прямоугольных импульсов амплитуды до 0,5 В) для достижения активности одного MU. Твердая поддержка (металлический бар) очень полезна для манипулирования тонкими пучки аксонов, которые могут быть использованы в качестве ручной поддержки для использования типсов. Обратите внимание также, что необходим дополнительный источник света.
- Постепенно увеличивая интенсивность стимула, определить единый MU на основе вызываемого "все или ни один" характер подергивания сокращения и действия потенциального стимула. Тщательно проверьте вызываемую активность при стимуляции вокруг порога.
- Когда более одного MU заключает контракт в изученных мышц и повышение уровня силы, а также увеличение амплитуды или изменение формы действия потенциал видны, вернуться к шагу 4.2 и разделить пучок аксонов снова. Обратите внимание, что сильнейшие MUs в крысы медиальной gastrocnemius имеют около 70 раз больше подергивания силы, чем самые слабые, и когда очень сильный MU дергается второй, слабый MU может быть не очевидно. Обратите внимание также, что некоторые МУ имеют свои мышечные волокна, расположенные вне зоны записи электрода и не видны в электромиограмме; в таком случае изменения амплитуды стимула могут иметь эффект в силе, но не в потенциале действия.
- Стимулировать двигательный агрегат с помощью протокола стимуляции, необходимого для цели эксперимента. Для базового протокола стимуляции, необходимого для расчета всех основных свойств контрактиля моторного агрегата и потенциалов действия, включите следующее.
- Включите 5 стимулов на 1 Гц (5 одиночных подергивания, записанных и усредненных; усреднение устраняет шум, что особенно важно для самых слабых MUs).
- Включите ряд стимулов на частотах 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 и 150 Гц с продолжительностью 500 мс (эти записи позволяют вычислить силово-частотную связь, максимальную тетаничную силу на 150 Гц, а также провисание при стимуляции 20-40 Гц).
- Включите тест усталости (тетани, вызванный поездами 14 стимулов на частоте 40 Гц, повторяется каждую секунду в течение 4 минут).
- Включите по крайней мере 10 интервалов времени между всеми элементами протокола выше.
- Повторите процесс с последовательными изолированными моторными агрегатами.
- Прекратите эксперимент и усыпляйте животное с помощью внутриперитонеального введения смертельной дозы пентобарбитального натрия (180 мгкг -1).
5. Электронный аппарат
ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютерная программа на заказ управляет стимулятором, предоставляя возможность создания переменных моделей стимуляции, в том числе указанных в шаге 4.4. Программа сотрудничает с аналоговым цифровым преобразователь (не менее 10 кГц для MUAP и силовых записей).
- Подключите усилитель переменного тока к компьютеру с помощью аналогового до цифрового преобразователя и параллельно осциллоскопу.
- Подключите преобразователь силы к компьютеру с помощью аналогового к цифровому преобразователь и параллельно осциллоскопу. Используйте препонент силы для контроля пассивной мышечной силы во время эксперимента. Обратите внимание, что во время эксперимента пассивная сила может уменьшиться; Поэтому необходимо увеличить длину мышц, чтобы сохранить постоянную пассивную мышечную силу.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Параметры сокращения моторных агрегатов и потенциал действия могут быть рассчитаны на основе записей при условии стабильного состояния записей. На рисунке 1 представлена репрезентативная запись одного подергивания быстрого MU. Верхний след показывает потенциал действия моторного блока. Задержка между доставкой стимула и появлением потенциала действия моторного блока обусловлена временем проведения от брюшного корня до мышц. На рисунке 2 показана репрезентативная...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
При правильном исполнении опытными учеными хирургический компонент описанного протокола должен быть завершен в течение примерно двух часов. Особо следует позаботиться о поддержании стабильных физиологических условий животного во время операции, в частности температуры тела и глубины анестезии, которые следует систематически контролировать путем оценки пинна и рефлексов абстиненции. После операции, она должна быть возможность поддерживать стабильные условия записи, по крайней мере шесть часов.
...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Польского национального исследовательского центра 2018/31/B/N'7/01028.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Преобразователь силы | на заказ | ||
| Щипцы | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 с экстра легким и тонким хвостовиком |
| Щипцы | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Щипцы |
| Щипцы | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Специальная чашеобразная схема для превосходного захвата |
| Щипцы | Fine Science Инструменты | No 11023-10 | Тонкие щипцы 1x2 |
| зуба | Тонкие научные инструменты | No 11251-20 | Dumont #5 |
| Гемостаты | Тонкие научные инструменты | No 13003-10 | Хартмана |
| Травяные | инструменты | S1U5A | |
| Биоамплифер с низким уровнем шума | World Precision Instruments | Код заказа 74030 | |
| Иглодержатели | Fine Научные инструменты | No 12503-15 | С губками из карбида вольфрама |
| Rongeurs | Тонкие научные инструменты | No 16021-14 | Ножницы Фридмана-Пирсона |
| Тонкие научные инструменты | No 14101-14 | Прямые острые/тупые с большими петлями | |
| для пальцев Ножницы Изящные | научные инструменты | No 14075-11 | Изогнутые тупые/тупые |
| ножницы | Изящные научные инструменты | No 14084-08 | Экстра тонкие боннские |
| ножницы | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Прямые, идеально подходят для разрезания нервов |
| Стимулятор | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
Ссылки
- Burke, R. E., Levine, D. N., Tsairis, P., Zajac, F. E. Physiological types and histochemical profiles in motor units of the cat gastrocnemius. Journal of Physiology. 234, 723-748 (1973).
- Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H. The number of motor units in the medial gastrocnemius muscle of male and female rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 58, 821-828 (2007).
- Grottel, K., Celichowski, J. Division of motor units in medial gastrocnemius muscle of the rat in light of variability of their principal properties. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 50, 571-588 (1990).
- Celichowski, J., Krutki, P. Variability and plasticity of motor unit properties in mammalian skeletal muscle. Biocybernetics and Biomedical Engineering. 32 (4), 33-45 (2012).
- Gardiner, P. F., Olha, A. E. Contractile and electromyographic characteristics of rat plantaris motor unit types during fatigue in situ. Journal of Physiology. 385, 13-34 (1987).
- Drzymała-Celichowska, H., Kaczmarek, P., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of slow motor unit forces at constant and variable interpulse intervals in rat soleus muscle. Journal of Electromyography and Kinesiology. 30, 1-8 (2016).
- Krutki, P., Celichowski, J., Łochyński, D., Pogrzebna, M., Mrówczyński, W. Interspecies differences of motor units properties in the medial gastrocnemius muscle of cat and rat. Archives Italiennes de Biologie. 144, 11-23 (2006).
- Burke, R. E., Rudomin, P., Zajac, F. E. The effect of activation history on tension production by individual muscle units. Brain Research. 109, 515-529 (1976).
- Celichowski, J. Mechanisms underlying the regulation of motor unit contraction in the skeletal muscle. Journal of Physiology and Pharmacology. 51, 17-33 (2000).
- Burke, R. E., Levine, D. N., Salcman, M., Tsairis, P. Motor units in cat soleus muscle: physiological, histochemical and morphological characteristics. Journal of Physiology. 238, 503-514 (1974).
- Milner-Brown, H. S., Stein, R. B., Yemm, R. The contractile properties of human motor units during voluntary isometric contractions. Journal of Physiology. 228, 285-306 (1973).
- Taylor, A., Stephens, J. A. Study of human motor unit contractions by controlled intramuscular microstimulation. Brain Research. 117, 331-335 (1976).
- Westling, G., Johansson, R. S., Thomas, C. K., Bigland-Ritchie, B. Measurement of contractile and electrical properties of single human thenar motor units in response to intraneural motor-axon stimulation. Journal of Neurophysiology. 64, 1331-1338 (1990).
- Burke, R. E. Motor units: anatomy, physiology and functional organization. APS Handbook of Physiology Series, Section 1, The Nervous System. 11, part 1, Motor Control 345-422 (1981).
- Celichowski, J., Grottel, K. The dependence of the twitch course of medial gastrocnemius muscle of the rat and its motor units on stretching of the muscle. Archives Italiennes de Biologie. 130, 315-325 (1992).
- Celichowski, J., Grottel, K., Bichler, E. Differences in the profile of unfused tetani of fast motor units with respect to their resistance to fatigue in the rat medial gastrocnemius muscle. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 20, 681-685 (1999).
- Krutki, P., et al. Division of motor units into fast and slow on the basis of profile of 20 Hz unfused tetanus. Journal of Physiology and Pharmacology. 59, 353-363 (2008).
- Drzymała-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of motor unit forces in the rat medial gastrocnemius muscle. Journal of Electromyography and Kinesiology. 20, 599-607 (2010).
- Kaczmarek, P., Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H., Kasiński, A. The image of motor unit architecture in the mechanomyographic signal during single motor unit contraction. In vivo and simulation study. Journal of Electromyography and Kinesiology. 19, 553-563 (2009).
- Celichowski, J., Krutki, P., Bichler, E. Axonal conduction velocity of motor units of rat's medial gastrocnemius muscle. Journal of Physiology (Paris). 90, 75-78 (1996).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
