Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация кальция у свободно ведущих себя caenorhabditis elegans с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61626

⸱

29 апреля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Institute for Quantum Life Science, National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 3National Institute for Radiological Sciences, National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 4JST, PRESTO

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь сообщается о системе визуализации кальция у свободно ведущих себя Caenorhabditis elegans с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией. Эта система позволяет исследователям вызывать нелокализованные вибрации с хорошо контролируемыми свойствами при наномасштабном смещении и количественно оценивать токи кальция во время реакций C. elegans на колебания.

Аннотация

Нелокализованные механические силы, такие как вибрации и акустические волны, влияют на широкий спектр биологических процессов от развития до гомеостаза. Животные справляются с этими раздражителями, изменяя свое поведение. Понимание механизмов, лежащих в основе такой поведенческой модификации, требует количественной оценки нейронной активности во время интересующего поведения. Здесь мы сообщаем о методе визуализации кальция при свободном поведении Caenorhabditis elegans с нелокализованной вибрацией определенной частоты, смещения и продолжительности. Этот метод позволяет производить хорошо контролируемую, нелокализованную вибрацию с использованием акустического преобразователя и количественно определять вызванные реакции кальция при одноэлементном разрешении. В качестве доказательства принципа показан кальциевая реакция одного интернейрона, AVA, во время реакции выхода C. elegans на вибрацию. Эта система облегчит понимание нейронных механизмов, лежащих в основе поведенческих реакций на механические раздражители.

Введение

Животные часто подвергаются воздействию нелокализованных механических раздражителей, таких как вибрации или акустические волны 1,2. Поскольку эти стимулы влияют на гомеостаз, развитие и размножение, животные должны изменить свое поведение, чтобы справиться с ними 3,4,5. Однако нейронные цепи и механизмы, лежащие в основе такой поведенческой модификации, плохо изучены.

Механосенсорное поведение у нематоды, Caenorhabditis elegans, представляет собой простую поведенческую парадигму, в которой черви обычно изменяют поведение от движения вперед к обратной реакции побега, когда они сталкиваются с нелокализованной вибрацией6. Нейронная цепь, лежащая в основе этого поведения, состоит в основном из пяти сенсорных нейронов, четырех пар интернейронов и нескольких типов двигательных нейронов 7,8. Кроме того, черви привыкают к таким механическим раздражителям после интервальной тренировки, включающей повторную стимуляцию 9,10,11. Таким образом, эта простая поведенческая реакция представляет собой идеальную систему для исследования нейронных механизмов, лежащих в основе как нелокализованного вибрационного поведения, так и памяти. Проиллюстрирован протокол визуализации кальция у свободно ведущих себя червей под воздействием нелокализованных колебаний. По сравнению с ранее сообщенными системами, эта система проста тем, что не требует дополнительной камеры для слежения; однако это позволяет нам изменять частоту, смещение и продолжительность нелокализованной вибрации. Поскольку активация интернейронов AVA индуцирует обратную реакцию побега, черви, совместно экспрессирующие GCaMP, индикатор кальция, и TagRFP, нечувствительный к кальцию флуоресцентный белок, под контролем AVA-специфического промотора были использованы в качестве примера (см. Таблицу материалов для деталей). Протокол демонстрирует активацию нейронов AVA, когда червь переключается с движения вперед на движение назад. Этот протокол облегчает понимание механизма нейронной цепи, лежащего в основе механосенсорного поведения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культивирование червей до получения кальциевой визуализации

  1. За четыре дня до эксперимента по визуализации кальция переместите двух взрослых червей ST12 на новую пластину среды роста нематод (NGM) (Таблица материалов), на которой Escherichia coli OP50 имеют полосы в квадратном рисунке (примерно 4 мм х 4 мм) с помощью клеточного распространителя, чтобы червь проводил большую часть времени в бактериях во время визуализации кальция12.
  2. Инкубируйте эту пластину NGM в течение 4 дней при 20 °C в инкубаторе (Таблица материалов).

2. Настройка оборудования

  1. Подготовьте микроскоп, оснащенный пьезоэлектрическим устройством для стимуляции13, объективом 2x, высокоскоростной камерой sCMOS, оптикой для разделения изображения, моторизованной ступенью x-y, светодиодным источником света для возбуждения и компьютером (рисунок 1). Основные характеристики камеры sCMOS включают 2560 x 2160 активных пикселей, размером 6,5 мкм, с 10-касательной связью камеры в качестве опции интерфейса. Основные характеристики моторизованной ступени X-Y включают диапазон хода 110 мм x 75 мм, максимальную скорость 250 мм / с, максимальное ускорение 2000 мм / с2 и однонаправленную повторяемость 0,25 мкм.
  2. Включите компьютер и контроллер моторизованной ступени x-y.
  3. Включите усилитель и установите для регулятора громкости значение 10, а для регуляторов низких и высоких частот — значение 8.
  4. Чтобы возбудить GCaMP и TagRFP, включите индикаторы светодиодного источника света 488 нм и 560 нм. Установите датчики 470 нм и 550 нм модуля управления в источнике света на 5%, чтобы интенсивность светодиодного света подходила для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этой интенсивности светодиодов фотоотбеливание флуоресценции GCaMP и TagRFP не происходит во время записи.

3. Настройка программного обеспечения для визуализации кальция

  1. Загрузите и установите три пакета программного обеспечения в Windows: программное обеспечение для макросов мыши, программное обеспечение для управления свойством вибрации, программное обеспечение для запуска программного обеспечения отслеживания и программное обеспечение для анализа данных (Таблица материалов).
  2. Дважды щелкните файл программного обеспечения для отслеживания.
  3. Нажмите кнопку Run и подождите 5 минут, чтобы стабилизировать программное обеспечение (рисунок 2A).
  4. Предоставьте информацию о времени экспозиции и биннинге. Время экспозиции 0,033 с при биннинге 2 x 2 обеспечивает плавное получение изображения (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толькокаждое 10-е полученное изображение отображается для того, чтобы уменьшить нагрузку на память.
  5. Предоставьте информацию для получения изображения (рисунок 2C). Например, если 500 изображений записываются дважды с интервалом 10 с, введите 1 000 в поле «Всего изображений », 500 в поле «Изображения » и 10 в поле «Интервал(ы »).
  6. Включите кнопку Acquisition (рисунок 2D).
  7. Разделение флуоресцентного изображения с помощью оптики разделения изображения и двух изображений (канал GCaMP, 500-525 нм (рисунок 2E); Каналы TagRFP, 584-676 нм (рисунок 2F)) проецируются на две половины камеры sCMOS. Откалибруйте координаты каналов GCaMP и TagRFP (рисунок 2G). Сохраните настройки программного обеспечения.
  8. Установите каталог для вывода файла данных (рисунок 2H).
  9. Отключите кнопку «Получение» (рисунок 2D).
  10. Дважды щелкните по программному обеспечению макросистемы мыши (рисунок 3A) и установите свойства вибрации (рисунок 3B). Прочитайте файл Assay.txt с помощью макросистемы мыши, чтобы курсор мыши управлялся на основе координат и расписания в этом файле (рисунок 3A). Установите координаты курсора мыши (пурпурные квадраты на рисунке 3A) и дождитесь стимуляции после начала записи (пурпурный на рисунке 3A). Установите значения частоты и амплитуды в программном обеспечении для контроля вибрации (рисунок 3B).

4. Подготовка червей к кальциевой визуализации

  1. Перенесите одного червя, экспрессирующего как GCaMP, так и TagRFP, из инкубированной пластины в новую свежую пластину NGM, на которой была нанесена E. coli OP50.
  2. Прикрепите пластину NGM к пьезоэлектрическому акустическому преобразователю с помощью прозрачной клейкой ленты (рисунок 4). Не прижимайте пластину к приводу, так как это изменяет частоту вибрации.

5. Кальциевая визуализация под контролем специфических вибрационных свойств

  1. Включите кнопку Acquisition (рисунок 2D).
  2. Найдите червя под ярким светом и светом возбуждения (488 нм и 560 нм).
  3. Установите значение масштаба микроскопии равным 2,5x. Поле зрения составляет 1,1 мм x 1,1 мм с разрешением 2,6 мкм/пиксель.
  4. Выключите яркий свет и включите кнопку самонаведения (рисунок 2I), чтобы отслеживать флуоресцентное пятно червя. Эта кнопка самонаведения запускает движение ступени X-Y, чтобы сохранить область максимальной интенсивности червя в середине поля зрения на изображении TagRFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С точки зрения промотора flp-18 , флуоресцентная интенсивность нейронов AVA является самой сильной, а нейроны из других нейронов слабы или не обнаруживаются. Поэтому система низкого увеличения не требуется для отслеживания, и сцена перемещается по всей записи.
  5. Убедитесь, что значения полос интенсивности на рисунках 2E и 2F составляют приблизительно 1000. Если это не так, настройте датчики 470 нм и 550 нм модуля управления в источнике света.
  6. Нажмите кнопку Run в макросистеме мыши, чтобы разрешить управление курсором мыши по расписанию, описанному на рисунке 3A. Это начинает записываться с помощью программного обеспечения отслеживания и стимулировать с помощью программного обеспечения волновых генов при отслеживании червя.
  7. Проверьте, правильно ли создан выходной BMP-файл.

6. Анализ данных

  1. Создайте папку на рабочем столе и назовите ее CalciumImaging.
  2. Создайте папку внутри папки CalciumImaging и назовите ее CIResult для выходных файлов результатов.
  3. Дважды щелкните файл DualViewImaging.nb , написанный в программном обеспечении для анализа данных для Windows.
  4. Вставьте путь к файлу в папку CIResult (например, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (рисунок 5).
  5. Вставьте путь к папке, включая BMP-файл (например, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (рисунок 5), в котором XXX обозначает имя папки, включая файлы BMP.
  6. Одновременно нажмите клавиши Shift и Return , чтобы начать автоматический анализ. В этом анализе используется значение области максимальной интенсивности поля зрения на изображении TagRFP (см. легенду рисунка 6 для подробной процедуры расчета в программе).
  7. Проверьте, правильно ли созданы следующие выходные файлы в папке CIResult.
    XXX-GCaMP.tif (файл изображения, иллюстрирующий следы интенсивности GCaMP для всех изображений)
    XXX-GCaMP.xls (файл электронной таблицы со списком интенсивностей GCaMP во всех изображениях)
    XXX-TagRFP.tif (файл изображения, иллюстрирующий следы интенсивности TagRFP для всех изображений)
    XXX-TagRFP.xls (файл электронной таблицы со списком интенсивностей TagRFP на всех изображениях)
    XXX-Ratio.tif (файл изображения, иллюстрирующий следы значения соотношения для всех изображений)
    XXX-Ratio.xls (файл электронной таблицы со значением соотношения во всех изображениях)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь червь, экспрессирующий как GCaMP, так и TagRFP под контролем интернейрон-специфического промотора AVA, используется в качестве примера визуализации кальция у свободно ведущих себя C. elegans. Данные каналов GCaMP и TagRFP были получены в виде серии изображений, некоторые из которых показаны на рисунке 6 и в виде фильма (Дополнительный фильм 1). Смещение пластины Петри, вызванное нашей нелокализованной вибрационной системой (рисунок 7),

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как правило, количественная оценка нейронной активности требует введения зонда и / или ограничений на движение тела животного. Однако для исследований механосенсорного поведения инвазивное введение зонда и сами ограничения представляют собой механические раздражители. C. elegans предоставляет систему для обхода этих проблем, потому что ее особенности прозрачны и потому что она имеет простую, компактную нейронную цепь, состоящую только из 302 нейронов. Сочетая эти преимущества с ранее разработанным методом вызова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis за предоставление штаммов, используемых в этом исследовании. Эта публикация была поддержана JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), по инновационным направлениям проекта «Наука о мягких роботах» (Грант No. JP18H05474), PRIME от Японского агентства медицинских исследований и разработок (номер гранта 19gm6110022h001) и фонда Shimadzu.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Программное обеспечение для анализа данных
DualViewImaging.nbавторДля анализа полученных данных
Mathematica12WolframДля запуска программного обеспечения для анализа данных DualViewImaging
Escherichia coli и C. elegans штаммы
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50Пища для C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314) штаммCaenorhabditis Genetics CenterKG1180Светочувствительный мутант
lite-1(ce314) штамм, экспрессирующий NLS-GCaMP-NLS и TagRFP под контролем автора AVA-специального промотораST12lite-1(ce314) мутант, несущий гены, экспрессирующие NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; сигнал ядерной локализации) и TagRFP под контролем flp-18 промотор в качестве экстрахоромосомного массива
<сильный>Лазерный доплеровский виброметр
Ласе Доплеровский виброметрPolytec JapanIVS-500Для количественной оценки  частота и смещение, генерируемые акустическим преобразователем
Mouse macrosystem
Assay.txtАвторСкрипт для временного и специального управления курсором мыши в Windows
HiMacroExVectorhttps://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.htmlБесплатно скачать программу для управления курсором мыши на основе скрипта
Nematode growth media plate
Agar очищенный, порошокNakarai tesque01162-15Для Подготовка пластин NGM
Bacto peptonBecton Dickinson211677Для приготовления пластин NGM
Хлорид кальцияWako036-00485Подготовка пластин NGM
ХолестеринWako034-03002Подготовка пластин NGM
ди-Фотассия гидрогенфосфатNakarai tesque28727-95Подготовка пластин NGM
LB бульон, LennoxNakarai tesque20066-95Для культивирования E. coli OP50
Сульфат магния безводныйTGIM1890Для приготовления NGM планшетов
Дигидрогенфосфат калияNakarai tesque28720-65Для приготовления NGM планшетов
Sodium ChlorideNakarai tesque31320-05Для приготовления NGM планшетов
Чашки Петри (60 мм)Nunc150270Для приготовления пластин NGM
<сильное>Нелокализованное вибрационное устройство
УсилительLEPYLP-A7USBДля стимуляции с управляемой вибрацией
Акустический преобразовательMinebeaMitsumiLVC25Для стимуляции с управляемой вибрацией
WaveGene Ver. 1.5Thrivehttp://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.htmlСкачать бесплатно программное обеспечение для управления свойством вибрации
<сильный>Неинвазивный кальциевый визуализация
2-канальный настольный 3-фазный бесщеточный сервоконтроллер постоянного токаThorlabsBBD202Совместимый контроллер для MLS203-1 каскадов
479/585 нм BrightLine двухполосный полосовой фильтрSemrockFF01-479/585-25Для получения двухканальных изображений (GCaMP и TagRFP)
505/606 нм BrightLine двухгранный стандартный эпифлуоресцентный дихроичный светоделительSemrockFF505/606-Di01-25x36Для получения двухканальных изображений (GCaMP и TagRFP)
512/25 нм BrightLine однополосный полосовой фильтрSemrockFF01-512/25-25Для получения двухканальных изображений (GCaMP и TagRFP)
630/92 нм BrightLine однополосный полосовой фильтрSemrockFF01-630/92-25Для получения двухканальных изображений (GCaMP и TagRFP)
КомпьютерDellPrecision T7600Windows7 с процессором Intel Xeon ES-2630 и 8 ГБ оперативной памяти
Высокоскоростной x-y моторизованный столикThorlabsMLS203-1Быстрый XY сканирующий стол
Разделение изображения оптикиHamamatsu photonicsA12801-01Для получения двухканальных изображений (GCaMP и TagRFP), генерируемых W-VIEW GEMINI Рассеивающая оптика
Светодиодный источник светаCoolLEDpE-4000Для генерации возбуждающего света 470 нм и 560 нм
МикроскопOlympusMVX10
sCMOS камераAndorZyla
x 2 ОбъективOlympusMVPLAPO2XCРабочее расстояние 20 мм и числовое апертура 0,5
<сильный>Плазмид
pKDK66 автор плазмидыpKDK66Маркер совместной инъекции
pTAK83 автор плазмидыpTAK83Плазмида для экспрессии TagRFP под контролем  flp-18 промотор
pTAK144 автор плазмидыpTAK144Плазмида для экспрессии NLS-GCaMP5G-NLS под контролем flp-18 promoter
Tracking software
homingback.viавторSubVi файл для отслеживания флуоресцентного пятна червя через управление обратной связью sCMOS камеры и x-y моторизованной сцены
LabVIEWНациональные инструментыДля запуска программного обеспечения слежения
Zyla Control ver.2.6CI.viавторДля отслеживания флуоресцентного пятна червя через управление с обратной связью камеры sCMOS и моторизованного столика

Ссылки

  1. Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
  2. Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
  3. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
  4. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
  5. Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
  6. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  7. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  8. Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
  9. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  10. Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88(2013).
  11. Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
  14. Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
  15. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
  16. Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
  17. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
  18. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
  19. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  20. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
  21. Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
  23. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C. elegansакустический преобразовательмаркировка GCaMPнейрон AVAреакция избеганияпрограммное обеспечение для контроля вибрацийвысокоскоростная CMOS-камераразрешение на уровне одной клетки
Визуализация кальция у свободно ведущих себя caenorhabditis elegans с хорошо контролируемой, нелокализованной вибрацией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.