Методическая статья

In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики

DOI:

10.3791/61648

⸱

15 сентября 2020 г.

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отслеживание отдельных событий перевода позволяет проводить кинетические исследования механизмов перевода с высоким разрешением. Здесь мы демонстрируем одномекулярный анализ in vitro, основанный на взаимодействии изображений между флуоресцентно помеченными антителами и эпитопными зарождающимися пептидами. Этот метод позволяет одномекулярной характеристики инициации и пептидной кинетики удлинения во время активного в пробирке крышка-зависимый перевод.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтез белка, зависящий от крышки, является преобладающим переводом в эукариотических клетках. Хотя различные биохимические и генетические подходы позволили проведить обширные исследования зависящего от ограничения перевода и его регулирования, кинетической характеристики этого пути перевода с высоким разрешением по-прежнему не хватает. Недавно мы разработали анализ in vitro для измерения кинетической системы перевода, зависящей от колпачка, с разрешением одной молекулы. Анализ основан на флуоресцентно помечены антитела связывания с зарождающейся эпитоп-тегами полипептида. Путем изображения связывания и диссоциации антител к зарождающимся пептидно-рибосомно-мРНК комплексов и из них можно отслеживать прогрессию перевода на отдельных мРНК. Здесь мы представляем протокол для установления этого анализа, включая подготовку мРНК и PEGylated слайдов, визуализацию перевода в режиме реального времени и анализ траекторий одной молекулы. Этот анализ позволяет отслеживать отдельные события перевода, зависящие от ограничения, и решает ключевые кинетики перевода, такие как инициация и удлинение ставок. Анализ может быть широко применен к отдельным системам перевода и должен в целом принести пользу в пробирке исследований зависит от ограничения перевода кинетики и переводческих механизмов контроля.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перевод в эукариотических системах происходит преимущественно через 7-метилгуанозин(м 7G) крышка-зависимых путей1. Исследования показывают, что инициационный шаг эукариотического перевода является ограничением скорости и общей цельюдля регулирования 2,3,4. Механизмы капремонтозависимых переводов были широко изучены с использованиемгенетических 5,биохимических 6,7,8, структурных9игеномных 10 навалочных подходов. Хотя эти методы выявили различные механизмы, которые регулируют ограничения зависимых инициации, их разрешение ограничивает их ансамбль усреднение сигналов от неоднородных и асинхронных событий посвящения. Совсем недавно, отдельные события перевода in vivo были визуализированы методами, которые измеряют флуоресцентные антитела, связывающиеся с эпитопами на зарождающихсяполипептидах 11,12,13,14. Тем не менее, эти новые подходы также ограничены в их способности решать отдельные события посвящения, потому что множественные флуоресцентные антитела должны связывать зарождающийся пептид, чтобы отдельные события перевода были решены из высокого внутриклеточного фона флуоресценции. Во многих биологических взаимодействиях, решенные отдельные кинетические события предоставили критические идеи в понимании сложных многоступенчатых и повторяющихся биологических процессов, которые невозможно синхронизировать на молекулярном уровне. Необходимы новые методы, которые могут отслеживать динамику отдельных событий перевода для лучшего понимания ограничения зависимости от инициации и регулирования.

Недавно мы разработали анализ in vitro, который измеряет зависящая от крышки инициация кинетики с одномекулярнойразрешением 15. Учитывая большое количество известных и неизвестных белковых факторов, участвующихв этом пути инициации 3,16, одномекулярный анализ был разработан, чтобы быть совместимым с существующими системами перевода без клеток in vitro, чтобы извлечь выгоду из их сохранения клеточных факторов инадежной переводческой активности 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Кроме того, использование систем перевода без клеток позволяет проводить более совместимые сопоставления между одномекулярными наблюдениями и предыдущими результатами. Этот подход обеспечивает прямую интеграцию новых одномекулярных кинетических идей в существующие механистические рамки ограничения зависимой инициации. Для установления одномекулярного анализа традиционная система перевода без клеток модифицировалась тремя способами: в начале открытого считывочного кадра (ORF) репортер mRNA вставляется последовательность кодирования эпитопа; 3 "конец репортер мРНК биотинилированных для облегчения мРНК конца привязывая к одной молекулы обнаружения поверхности; и флуоресцентно помеченные антитела дополняются экстрактом перевода. Эти модификации требуют только основных методов молекулярной биологии и общедоступных реагентов. Кроме того, эти модификации и условия одномекулярной визуализации сохраняют кинетику перевода реакций перевода без навалочныхклеток 15.

В этом анализе (Рисунок 1), 5 "конец ограничен и 3"-конец биотинилированных репортер мРНК обездвижены на стрептавидин покрытием обнаружения поверхности в камере потока. Затем камера потока заполняется безклеточной переводной смесью, дополненной флуоресцентно помеченными антителами. После перевода мРНК произошло около 30-40 кодонов вниз потечению эпитопной последовательности 26,27, эпитоп выходит из рибосомного туннеля выхода и становится доступным для взаимодействия с флуоресцентно помеченными антителами. Это взаимодействие происходит быстро, и его обнаружение с помощью одномекулярных методов визуализации флуоресценции позволяет отслеживать перевод кинетики с одномекулярной разрешением во время активного перевода без клеток. Этот анализ должен в целом принести пользу в пробирке исследований кап-зависимых перевод кинетики и ее регулирования, особенно для систем с рабочей массой in vitro анализа.

Предпосылкой для создания этого одномекулярного анализа является рабочая навалом без клеток перевод анализа, который может быть достигнут с помощью перевода экстракт, который является либо коммерчески доступным или подготовлены следующие ранее описанныеметоды 28. Эукариотический перевод экстракт может быть получен из различных клеток, в том числе грибковых, млекопитающих ирастений 28. Для визуализации для этого анализа требуется микроскоп TIRF, оснащенный настраиваемой лазерной интенсивностью и углом инцидента, моторизованной стадией образца, моторизованной системой жидкости и устройством контроля температуры образца. Такие требования являются общими для современных одноямператекулярных экспериментов TIRF in vitro и могут быть достигнуты по-разному. Эксперимент, представленный здесь, использует объективную систему TIRF, состоит из коммерчески доступных микроскопов, программного обеспечения и аксессуаров, перечисленных в таблице материалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поколение репортеров мРНК

  1. Изменение шаблона транскрипции ДНК, который кодирует объемный анализ "untagged" репортер mRNA, вставив N-терминус эпитоп тегов кодирования последовательности для создания шаблона транскрипции ДНК для "тегами" репортер mRNA (Рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Взаимодействие 3xFLAG/anti-FLAG рекомендуется для этого анализа из-за его превосходной чувствительности и короткой длины тега 3xFLAG. Тем не менее, анализ совместим с другими парами эпитопа/антитела.
  2. Синтезировать нетегированные и помеченные РНК с использованием линейных шаблонов ДНК и комплекта транскрипции in vitro (см. таблицу материалов). Как правило, 10-20 пмоль в пробирке транскрибируется РНК достаточно для последующей обработки РНК, чтобы обеспечить систематическое одномолекулярное исследование.
  3. Cap РНК 5 "конец (Рисунок 2B) см 7G укупорки комплект (см.Таблицу материалов ) после рекомендации производителя.
  4. Биотинилат РНК 3 "конец(рисунок 2B) с использованием биотинилирования комплект (см. Таблицу материалов) в соответствии с протоколом, предоставленным комплектом. Очистка РНК путем извлечения фенол-хлороформа с последующим очищением с помощью спиновой колонки. Elute РНК в 10-20 йл без RNase воды. Приблизительно 40–50% необнафтенные входные РНК восстанавливаются.
  5. Оцените целостность и концентрацию РНК путем денатурации электрофореза акриламинида геля и окрашивания РНК, как описано ранее29.
  6. Выполните навалом ячейкибез перевода 30 с 3 "конец-биотинилированные помечены репортер мРНК, чтобы подтвердить, что модифицированная мРНК сохраняет свойства перевода, которые являются представляющими интерес. Например, зависящий от ограничения перевод может быть подтвержден путем измерения и сравнения деятельности репортера в массовых сотовых переводческих реакциях с необнаблённой и ограниченной репортерной mRNAs (см. результаты представителя).

2. Подготовка камеры потока

  1. Выберите соответствующую толщину крышки, как указано в микроскопе объективного листа спецификации. Выберите стеклянную или кварцевую горку для систем визуализации объективного или призмного типа общего внутреннего отражения (TIRF)31,соответственно.
  2. Выполните очистку, засолинизацию, PEGylation и камерную сборку крышки и слайда в соответствии с протоколом, описанным Chandradoss et al.32 со следующими изменениями.
    1. Вымойте слайды, содержащие просверленные отверстия в 10% щелочном жидком моющее средство (v/v) в течение 20 мин с sonication. Объедините слайды и крышки для всех оставшихся шагов очистки.
    2. Пропустите шаг мыть ацетона. Продлите время инкубации пираньи с 20 минут до 1 ч. Инкубировать первый раунд PEGylation на 3 ч. Инкубировать второй раунд PEGylation с MS (PEG)4 для 3 ч.

3. Подготовка оборудования

  1. По крайней мере, за 3 часа до проведения одномекулярного эксперимента включите инкубатор микроскопа и уменьшите поток воздуха до низкой скорости, чтобы избежать чрезмерного акустического нарушения экспериментов. Установите температуру инкубатора до оптимальной температуры для системы перевода без клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод чрезвычайно чувствителен к температуре. Оптимальная температура реакции специфична для каждой клеточной системы экстракта. Характеристика температуры реакции является жизненно важным шагом в развитии системы перевода без навалочных клеток. Этот одномекулярный анализ должен проводиться при той же оптимальной температуре, что и соответствующее условие массового перевода.
  2. По крайней мере 1 ч перед выполнением одномекулярного эксперимента включите лазер, нажав кнопку лазерной энергии за лазерной коробкой, включите ключ безопасности лазера и нажмите кнопку запуска; включите микроскоп и нажмите на панель управления сенсорным экраном, чтобы выбрать режим изображения, цель и набор фильтров.
  3. Включите камеру EMCCD, контроллер Prior stage и шприц-насос, нажав кнопки питания. Включите компьютер и открытое программное обеспечение Andor Solis (программное обеспечение 1) для управления камерой EMCCD, TirfCtrl (программное обеспечение 2) для управления лазером, PriorTest (программное обеспечение 3) для управления моторизованной стадии, и Coolterm для управления шприц насоса. Позвольте камере остыть и стабилизироваться до назначенной рабочей температуры до начала сбора данных.
  4. В программном обеспечении 2, подтвердите, что правильные параметры установлены для длины волны лазера, объективного типа и рефракционного индекса стекла и образца. Нажмите кнопку Connect. Чтобы установить интенсивность лазера, нажмите кнопку управления рядом с лазерной длиной волны, затем в лазерном управлении всплывающее окно, перетащите интенсивность слайд-бар. Установите лазер под нужный угол, перетащив слайд-бар положения волокна или ввода соответствующей глубины проникновения. Убедитесь, что коробка Затвора проверяется для поддержания лазера в режиме Off, когда нет изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте и закройте лазерный затвор, проверив поле затвора. При первоначальном установлении анализа, различные интенсивности лазера и углы инцидента должны быть проверены на оптимальное обнаружение одной молекулы. Оптимальная интенсивность лазера уравновешивает яркую одноямекулярную флуоресценцию и быстрое фотоотравлив флюорофоров. Угол инцидента должен быть увеличен за критический угол, чтобы уменьшить высокий флуоресцентный фон от диффузных помеченных антител до тех пор, пока антитела, связанные с мРНК, не будут четко решены. В качестве эталона, 532 нм лазер был установлен на 10 ЗВт на цели с лазерным углом инцидента установлен на 71,5 "висследовании 15 с использованием Cy3 помечены анти-FLAG с маркировкой соотношение 2-7 красителей на антитело.
  5. В программном обеспечении 1, выберите Kinetic в режиме приобретения, ввесть параметры времени экспозиции, кинетической длины серии, и EM получить значение. Выберите каталог и назначьте имена файлов для сохранения файла изображения данных.
  6. Установите шприц насос скромный, чтобы быстро скорость потока для последующего шага мытья труб.
    Pipette aliquot 70% этанола в трубку микрофуза, вставьте шприц насос трубки конца в раствор этанола, и использовать Coolterm для переключения шприц насоса между снять и обойтись режимы три раза, чтобы мыть трубки. Повторите использование воды без RNase.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина труб должна быть достаточно длинной, чтобы позволить перевод смеси обойтись на шаг 5 только связаться с трубкой, а не шприц. Объем полоскания здесь должен быть больше, чем объем дозированного перевода смеси для обеспечения того, чтобы перевод смеси на этапе 5 остается в контакте с дезинфицируемой трубки.
  7. После окончательного полоскания воды была обойтись, удалить остаточную воду изнутри трубки, dabbing трубки конца на чистую ткань протрите. Поддерживайте конец тюбингов сухой, установив его в чистую трубку микрофуза.

4. Иммобилизация биотинилированной мРНК на 3 конца

  1. Поддерживайте клеточный экстракт и перевод смеси замороженных на сухом льду до незадолго до их использования. Оттепель оставшихся замороженных реагентов и поддерживать их на льду.
  2. Поместите камеру потока в держатель образца микроскопа с стороной крышки, обращенной вниз, и закрепите ее на месте лентой. Используйте ленту для покрытия входов и точек каналов потока, которые не используются.
  3. Pipette объемом 1,5x (относительно объема канала; также применяется к другим шагам в шаге 4 и шаг 5) 0,2 мг/мл стрептавидина в канал потока и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Чтобы удалить несвегаемый стрептавидин, мыть канал три раза путем трубопроводов в 3x объемЕ буфера мытья T50 (20 мМ Трис HCl, рН 7,0, 50 мМм NaCl, 0,2 U /L RNase ингибирования реагента) за стирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы жидкие отходы не текли обратно в канал. Если выход канала потока не подключен к трубке сбора отходов, поместите сложенную бумагу ткани рядом с розеткой, чтобы поглотить жидкость, которая вытекает из канала.
  5. Перенесите перевод экстракта и перемешайте из сухого льда на лед и дайте им оттаять.
  6. Положите каплю масла погружения на цель. Поместите держатель образца микроскопа с камерой потока в стадию микроскопа. Принесите цель близко к крышке до погружения нефти на объективные контакты крышки. Переместите этап выборки так, чтобы положение канала потока было прямо над объективом цели.
  7. В программном обеспечении 2 откройте лазерный затвор и отрегулируйте уровень интенсивности лазера.
  8. На сенсорном экране управления микроскопом выберите вкладку Фокус и нажмите кнопку Поиск фокусировки и запуск. Звуковой сигнал слышен, когда фокус плоскости успешно достигнута.
  9. Изображение поверхности канала потока в режиме Live в программном обеспечении 1. Оптимизируйте фокус для более четкого изображения, регулируя объективное положение с помощью тонкого управления шагом на сенсорном экране.
  10. В программном обеспечении 3, переместить этап для оценки уровня фона флуоресценции в различных областях поверхности обнаружения канала потока. Если флуоресценция низкая, продолжайте эксперимент. Если фон флуоресценции чрезмерно высок, подумайте об отказе от канала потока.
  11. В программном обеспечении 2 закройте лазерный затвор.
  12. Pipette из T50 мыть буфер из потока канала и сразу же пипетки в 2x объем биотинилированных мРНК решение канала потока. Инкубация в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой партии подготовки мРНК, концентрации мРНК и инкубацио время должно быть проверено для достижения плотности поверхности мРНК, необходимой для обнаружения одной молекулы. Соответствующая плотность поверхности мРНК опосредует связывание антител, которое показывает флуоресцентные пятна с перекрывающимися не более чем на 5% (см. результаты представительов). В качестве отправной точки рекомендуется биотинилированная мРНК при концентрации 2-20 нм.
  13. Вымойте канал три раза, трубя 3x объем перевода совместимый буфер на стирку.

5. Сборка и доставка смеси перевода на канал потока для обнаружения одной молекулы

  1. На льду соберите 3x тома смесиперевода 30 в трубке микроцентрифуга после протокола массового перевода из шага 1.7, за исключением опустить мРНК и дополнить оптимизированной концентрацией флуоресцентно помеченных антител. Кратко закрутить трубку микроцентрифуга для того чтобы собрать смешивание перевода на дне пробки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При установлении анализа проверяются различные концентрации антител. Оптимальная концентрация показывает низкое количество неспецифических антител, связывающихся с поверхностью обнаружения, и быструю привязку антител к зарождающемуся пептиду (см. шаги 7.1. и 7.2., соответственно, для деталей калибровки анализа).
  2. Перенесите смесь перевода на внутреннюю сторону крышки трубки микрофуги 0,7 мл. Установите шприц-насос в режим снятия. Вставьте конец трубки насоса в смесь перевода. Начните снятия шприца, чтобы собрать смесь перевода в трубки насоса. Обратный параметр шприц-насоса в режим дозирования и установить поток на оптимальную скорость для доставки смеси перевода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте генерации пузырьков в переводе смеси при передаче его в трубы насоса. Избегайте снятия перевода смесь слишком глубоко в части трубки, которая не была дезинфицирована и промыть в шаге 3.6. При установлении анализа проверяются различные скорости потока доставки для определения оптимальной скорости (см. шаг 6.2. для получения подробной информации о калибровке анализа).
  3. Если есть разрыв между окончанием трубки и перевод смеси, начать шприц насоса и позволяют перевод смеси для достижения конца трубки, а затем остановить шприц насоса.
  4. Вставьте конец трубки насоса в вход канала потока. Избегайте введения пузырьков воздуха в смесь перевода при выполнении соединения. Стабилизуем соединение путем завинчивания изготовленного на заказ металлического кронштейна на пластину держателя образца микроскопа. Оцените фокус микроскопа и область изображения флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трубки могут быть зажаты в камеру потока с пользовательской частью, как описано ранее33. Другие типы жидкостных систем также могут быть использованы для этого анализа34. Поле зрения должно выглядеть аналогичным до и после подключения труб. Если после подключения появляется больше флуоресцентных пятен, смесь перевода, скорее всего, вытекает из трубки доставки. В зависимости от приложения, канал с утечкой перевода смеси, возможно, потребуется отказаться.
  5. Подтвердите, что параметры приобретения фильма верны и что соответствующее имя файла и каталог были введены для сохранения файлов.
  6. Переместите сцену на изображение области в центре поверхности обнаружения канала потока. На сенсорном экране управления микроскопом выберите вкладку Continuous AF и нажмите кнопку Focus Search and Start, чтобы сохранить фокусное положение во время эксперимента. Звуковой сигнал слышен, когда фокус плоскости успешно достигнута.
  7. В программном обеспечении 2 откройте лазерный затвор. В программном обеспечении 1 нажмите кнопку Take Signal, чтобы начать запись. После примерно 5 с записи введите команду Run в Coolterm, чтобы доставить смесь перевода в канал потока. Рекорд до 2 ч с разрешением времени 0,5-2 с/кадр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальный промежуток сбора данных зависит от того, как быстро экстракт перевода теряет активность с течением времени, что может быть удобно охарактеризовано выполнением перевода без навалочных клеток с люциферазой репортер мРНК и измерения активности люциферазы в реакции перевода в разныхточках времени 35.
  8. Когда сбор данных завершен, выключите лазер, выключите непрерывный AF на сенсорном экране управления микроскопом и разберут трубы из камеры потока.
  9. Pipette из перевода смеси из потока канала входе, передать его в трубку микрофуза, и оснастки заморозить раствор, поместив трубку в жидкий азот. Позже хранить при -80 градусов по Цельсию.
  10. Вымойте шприц насос трубки три раза с RNase свободной воды, то три раза с 70% этанола. Свями 70% этанола в трубку шприц насоса для хранения.
  11. Выключите микроскоп и все аксессуары. убирать.

6. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных для этого анализа требует распространенных методов в одномекулярных биофизических исследованиях. Все вычислительные интенсивные шаги могут быть достигнуты с помощью существующих алгоритмов и программного обеспечения (ссылки приведены ниже на соответствующих этапах).

  1. Факультативно: Если это применимо, преобразуй приобретенный файл серии изображений в формат, совместимый с выбранным программным обеспечением обработки изображений или языком программирования.
  2. Определите отправную точку реакции перевода и время обмена реагентами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за диффузии флуоресцентных антител в переводе смеси, фоновая флуоресценция интенсивности изображенной области будет увеличиваться во время обмена реагентами в канале от совместимого с переводом буфера к переводу смеси. Отправной точкой реакции перевода является точка времени завершения обмена реагентами. Эта точка завершения найдена путем измерения интенсивности фоновой флуоресценции во время доставки смеси перевода и определения точки времени, когда увеличение интенсивностифлуоресценции плато 15, как описано ниже.
    1. Рассчитайте общее количество флуоресценции на кадр изображения и свяйте соответствующий профиль времени. Определите внезапное увеличение общей флуоресценции в графике времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее увеличение флуоресценции связано с увеличением концентрации флуоресцентно помеченных антител во время обмена реагентов.
    2. Определите конечной точкой общей фазы увеличения флуоресценции и установите эту точку времени в качестве отправной точки (т.е. времени 0) реакции перевода. Определите как стартовые, так и конечные точки общей фазы увеличения флуоресценции и установите разницу во времени в качестве времени обмена реагентами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий промежуток времени обмена реагентами зависит от размеров канала потока и выбранной скорости потока. Вполне возможно, что некоторые факторы перевода могут начать связываться с мРНК до завершения обмена реагентами, что может уменьшить разрешение установленного времени начала первого раунда. Поэтому рекомендуется тестировать различные скорости потока при настройке анализа и выбрать скорость потока, которая позволяет завершить обмен реагентов в пределах 3-4 с для скорости сбора данных 0,5-2 с/кадр.
  3. Дополнительно: Выполните коррекцию дрейфа фильма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение связанных антител в изображении данных может меняться с течением времени из-за дрейфа частей микроскопа и аксессуаров. Дрифт, визуально заметный в фильме, требует коррекции, прежде чем продолжить анализ данных. Несколько алгоритмов пространственной коррекции дрейфа и скриптовдоступны 36,37,38.
    1. На каждом изображении найдите локаляю максиму в пиксельных счетах, чтобы определить положение связанных антител в каждом кадре с точностью пиксельного уровня. Установите порог для подсчета пикселей таким образом, чтобы были выбраны только пятна, которые явно находятся выше фонового шума.
    2. Рассчитайте изменения отдельных позиций антител в каждом направлении между двумя последовательными кадрами изображения.
    3. Участок гистограммы антител позиционных изменений между двумя последовательными кадрами и сделать это отдельно для каждого направления. Гауссиан вписывается в каждую гистограмму и устанавливает центральное положение пиков как направленный дрейф между двумя последовательными кадрами.
    4. Чтобы противодействовать наблюдаемому дрейфу, переложите каждый кадр изображения в противоположном направлении на расчетную сумму дрейфа.
  4. Постройте одномекулярные траектории.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение / отслеживание программного обеспечения доступно для выявления ярких пятен и извлечь их интенсивности из серииизображений данных 39,40.
    1. Определите позиции антител, описанные в шаге 6.3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальный осмотр рекомендуется для обеспечения того, чтобы выбранный порог не означает чрезмерного или недостаточного сбора частиц. Визуальный осмотр может быть достигнут путем наложения выявленных центроидных позиций на каждый кадр изображения и визуальной оценки их согласия (см. результаты представителя).
    2. Объедините выбранные частицы со всех кадров и удалите избыточные положения частиц.
    3. Визуально проинспектировать изображения связанных антител и выбрать квадратную площадь, в прилагая пикселей с графами, которые явно выше фона и представитель индивидуально связанных антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция распространения тоска (т.е. размер квадрата для одной молекулы) определяется оптической установкой и размером пикселя детектора.
    4. Для каждой позиции частицы создайте одномекулярную траекторию, вычислив общую интенсивность всех пикселей в квадратной области вокруг положения частицы. Траектории строятся для каждой позиции, кадра за кадром и для всего фильма данных.
  5. Дополнительно: Применить нелинейный фильтр41 вперед-назад, чтобы уменьшить фоновый шум в одномекулярных траекториях.
  6. Дополнительно: Оцифровыв траектории с существующимиалгоритмами обнаружения шагов 42,43,44,45.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор алгоритма step-detection зависит от сложности одномекулярной динамики. Для простейшего сценария только изолированного рибосомного перевода (т.е. без полисомного образования) и хорошего соотношения сигнала к шуму, пороговое применение к подсчетам флуоресценции достаточно для определения сроков связывания антител и диссоциации событий в одномекулярных траекториях. Визуальный осмотр по крайней мере 100 траекторий для каждого состояния рекомендуется для обеспечения того, чтобы шаги траектории были надлежащим образом выбраны стратегией обнаружения шагов.
  7. Определите время первого события связывания антител для каждой траектории (т.е. первого времени прибытия, t1), либо используяоцифрованные траектории, либо применяя порог к недигитизированным траекториям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение распределения первого времени прибытия можно сравнить между различными условиями перевода. Кроме того, распределение первого времени прибытия может быть установлено на сдвинутую (3-параметрную) функциюжурнала-нормального для определения среднего значения 15 lt; t1.gt;. Поскольку распределение первого времени прибытия обычно искажено и имеет длинный хвост, не вычисляйте среднее значение, непосредственно усредняя время первого прибытия.
  8. Необязательно: анализ времени и расчет средней скорости синтеза пептида.
    1. Используйте оцифрованные траектории для определения моносомных (одноберосных) событий перевода в каждой траектории и расчета единого связывающего события в расчете времени как разницы во времени между соответствующими событиями связывания антител и диссоциации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритмы обнаружения шагов для оцифровки траекторий, как правило, менее надежны, когда несколько молекулярных событий пересекаются во времени. Поэтому рекомендуется исключить полисомные события из анализа времени обитуемого времени. Для высокоэфирных переводческих систем, обогащенных полисомными событиями и нечасто отображающих моносомные события, смесь помеченных и необрюхаемых антител может быть использована для увеличения возможности наблюдения изолированных событий перевода на одномекулярных траекториях.
    2. Подготовь распределение к нормальной функции журнала и используйте установленную функцию для расчета среднего времени обитали.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет среднего непосредственно путем усреднения наблюдаемого времени обита не рекомендуется, поскольку распределение времени обита, как правило, искажено длинными хвостами.
    3. Определите количество аминокислот, которые переводятся во время связывания антител, вычитая сумму длины аминокислоты эпитопа и 35 (средняя аминокислотная длина зарождающегося пептида в рибосомном туннеле выхода) из общего количества кодонов ORF.
    4. Чтобы определить среднюю скорость синтеза пептидов, разделите количество переведенных аминокислот на среднее время обитуемого времени.
  9. Необязательно: Расчет среднего времени начала первогораунда (lt;t1_I
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия посвящения и удлиниения, такие как контекст последовательности сайта посвящения и последовательность кодирования, как правило, намеренно сохраняются для изучения кинетики посвящения. Таким образом, среднее время первого прибытияLt; t1 йgt;от шага 6.7. могут быть использованы непосредственно для расчета изменения в первом раунде инициации кинетики между различными условиями. Следующая коррекция необходима только для определения фактического значения времени начала первого раунда.
    1. Разделите сумму длины эпитопа и 35 (средняя аминокислотная длина зарождающегося пептида в рибосомном туннеле выхода) на среднюю скорость синтеза пептида (от шага 6.8.4.) для расчета среднего времени удлинения пептида этой N-терминальнойобласти (Lt;t1_tag
    2. В качестве первого времени прибытия является сумма первого раунда времяинициации и т1_tag , вычестьlt;t1_tag1_I1_I1_tag

7. Калибровка анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги калибровки при первоначальном установлении анализа.

  1. Чтобы изучить специфичность связывания антител, выполните этапы протокола в разделах 4 и 5 отдельно для нетегов и помеченных мРНК(рисунок 2). Уровни связывания антител в каналах с этими соответствующими мРНК представляют собой степень неспецифического связывания антител с поверхностью обнаружения и специфического антитела, связывающего с зарождающимся пептидом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специфическое к неспецифическому коэффициенту связывания рекомендуется быть Nogt;10 и может быть увеличено с различными стратегиями пассивации поверхности, более низкой концентрацией антител, или более высокой плотностью поверхности мРНК.
  2. Чтобы измерить скорость связывания антител, выполните протокол дополнительным шагом между шагом 4 и шагом 5.
    1. После шага 4, инкубировать канал с переводом смеси, которая не хватает антител для предварительного создания мРНК / рибосомы / пептидных комплексов.
    2. Затем перейти к шагу 5 и поток антител-дополненной смеси перевода в канал.
    3. Количественная оценка средней скорости связывания антител с заранее сгенерированным зарождающимся пептидом с экспоненциальной установкой к гистограмме первого времени прибытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание антител с предварительно сгенерированным пептидом должно быть быстрым, в порядке секунд, и должно быть быстрее, чем перевод кинетики. Более высокая концентрация антител может быть использована для увеличения скорости связывания антител.
  3. Фотосемь флюорофора помечены антитела.
    1. Подготовьте слайд в соответствии с протоколом в шаге 2, но пропустите шаг PEGylation. Соберите камеру потока после шага засолинизации. Силановое покрытие позволяет эффективно связывать неспецифические антитела с поверхностью обнаружения.
    2. Добавьте в канал флуоресцентно помеченные антитела для достижения одноямекулярной плотности неспецифических антител, связывающихся с поверхностью обнаружения. Начните с добавления флуоресцентно помеченных антител, которые сильно разбавляют в буфере мытья T50 и постепенно увеличивают концентрацию антител до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность одной молекулы.
    3. Изображение поверхности обнаружения до тех пор, пока большая часть флуоресценции антител больше не обнаруживается.
    4. Участок общее количество видимых антител с течением времени, чтобы оценить скорость потери флуоресценции антител из-за флюорофора фотоотравливания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка антител обычно дает несколько флюорофоров на антитела. Индивидуальные антитела остаются обнаруживаемыми до тех пор, пока все конъюгированные фторфоры не будут фотоблей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После протокола описано позволяет изображения отдельных взаимодействий антител с зарождающейся N-терминал помечены полипептидов с одной молекулы резолюции во время активного клеточного перевода 3 ' конец-tethered репортер mRNA (Рисунок 1). Минимальный демонстрационный эксперимент сообщается с использованием трех синтетических mRNAs: LUC (кодирование untagged luciferase), LUCFLAG (кодирование 3xFLAG-тегами люциферазы), и л.с.LUCFLAG(...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По сравнению с типичными в пробирке TIRF одномекулярных экспериментов, одноямекулярная визуализация с анализом, описанным здесь, дополнительно сложна из-за использования клеточного экстракта и высокой концентрации флуоресцентно помеченных антител. По сравнению с более распространенной практикой одного раунда поверхностного PEGylation, второй раунд PEGylation (шаг 2) значительно снижает неспецифические антитела связывания с поверхностьюобнаружения 15. Высокая концентрация диффузных флуорес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01GM121847); Мемориальный онкологический центр Слоан Кеттеринг (MSKCC) Грант/Основной Грант (P30 CA008748); и Инициатива MSKCC по функциональной геномике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100X масляная цель, N.A. 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1)Bio-Rad161-0144
Щелочное жидкое моющее средствоDecon5332
Аминосилан (N-(2-Аминоэтил)-3-Аминопропилтриметоксисилан)UCT Specialties, LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Программное обеспечение Andor SolisAndorДля управления Andor EMCCD
Полосовой фильтрChroma532/640/25
Полосовой фильтрChromaNF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVALaysan Bio IncBiotin-PEG-SVA
Коэнзим А свободная кислотаProlume309-250
Программное обеспечениеCoolterm Для управления шприцевым насосом
Настольный компьютерDellДля управления микроскопом, камерой, столиком и насосом.
Дихроичное зеркалоSemrockR405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNXFisher ScientificNC1139450
Dual-Luciferase Reporter Система анализаPromegaE1910
Эпоксидная смолаDevcon14250
Светлячок люциферин D-люциферин свободная кислотаProlume306-250
Ледяная уксусная кислотаFisher ScientificBP1185500
Биооксид водородаSigma-Aldrich216763-500ML
Погружное маслоOlympusZ-81226Aнизкой автофлуоресценцией
PromegaE1500
MEGASCRIPT T7 Набор для транскрипцииThermo fisherAM1334
MethanolFisher НаучныйMMX04751
МикроскопOlympusIX83
Предметное стекло для микроскопаThermo Scientific3048
Моноклональный анти-ФЛАГ M2-Cy3Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS(PEG)4Thermo Scientific22341
NaCl (5M)Thermo ScientificAM9760G
No 1.5 микроскоп Защитное стеклоFisherband12-544-C
Olympus Лазер, 532 нм 100 мМOlympus цифровая лазерная системаCMR-LAS 532 нм 100 мВт
Olympus Программное обеспечение Olympus TirfCtrlOlympusДля контроля интенсивности лазера и угла падения
Оптический столTMC контроль вибрации63-563С виброизоляцией
Фенол хлороформ изоамиловый спирт смесьSigma-Aldrich77617-100мл
Pierce RNA 3' End Biotinylation KitThermo Scientific20160
Гранулы гидроксида калияSigma-AldrichP1767-500G
Prior моторизованная ступень трансляции XYPriorPS3J100
Prior PriorTest программное обеспечениеПредыдущийДля управления Преор моторизованная стадия
Рекомбинантный ингибитор РНКазин РНКазыPromegaN2515
Stage top ИнкубаторIn vivo Scientific (мировые прецизионные инструменты)98710-1С изготовленной на заказ акриловой клеткой
Окрашивание банкиFisher Scientific08-817
StreptavidinThermo Scientific43-4301
Серная кислотаFisher ScientificA300212
SYBR green IIFisher ScientificS7564
ШприцHamilton1725RN
Шприцевой насосHarvard аппарат55-3333
Tris (1M), pH = 7.0Thermo ScientificAM9850G
ультразвуковая ваннаBranson
МочевинаSigma-AldrichU5378-500G
Система укупорки вакциныНовая Англия BiolabsM2080S
Zymo-Spin IC колонкиZymo ResearchC1004
Система анализа люциферазы с CPX1800H

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6(2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24(2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357(2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи