Методическая статья

Двухэтапная стратегия, которая сочетает эпигенетическую модификацию и биомеханические сигналы для создания плюрипотентных клеток млекопитающих

DOI:

10.3791/61655

⸱

29 августа 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод, который сочетает в себе использование химического эпигенетического стирания с сигналами, связанными с механозондированием, для эффективной генерации плюрипотентных клеток млекопитающих без необходимости трансфекции генов или ретровирусных векторов. Таким образом, эта стратегия является многообещающей для трансляционной медицины и представляет собой заметный прогресс в технологии органоидных стволовых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточный фенотип может быть изменен или модифицирован различными методами, с преимуществами и ограничениями, которые специфичны для каждой техники. Здесь мы описываем новую стратегию, которая сочетает в себе использование химического эпигенетического стирания с сигналами, связанными с механозондированием, для создания плюрипотентных клеток млекопитающих. Необходимо сделать два основных шага. На первом этапе взрослые зрелые (терминально дифференцированные) клетки подвергаются воздействию эпигенетического ластика 5-аза-цитидина, чтобы привести их в плюрипотентное состояние. Эта часть протокола была разработана на основе растущего понимания эпигенетических механизмов, контролирующих судьбу и дифференцировку клеток, и включает в себя использование эпигенетического модификатора для стирания дифференцированного состояния клеток, а затем вгоняет в переходное окно высокой пластичности.

На втором этапе стертые клетки инкапсулируют в микробиореакторы политетрафторэтилена (PTFE), также известные как жидкие шарики, для содействия перегруппировке 3D-клеток для расширения и стабильного поддержания приобретенной высокой пластичности. PTFE является нереакционноспособным гидрофобным синтетическим соединением, и его использование позволяет создать клеточную микросреду, которая не может быть достигнута в традиционных системах 2D-культур. Эта система поощряет и повышает поддержание плюрипотентности с помощью сигналов, связанных с биомеханозонированием.

Технические процедуры, описанные здесь, представляют собой простые стратегии, позволяющие индукции и поддерживать состояние высокой пластичности во взрослых соматических клетках. Протокол позволил получить клетки высокой пластичности у всех протестированных видов млекопитающих. Поскольку он не связан с использованием трансфекции генов и свободен от вирусных векторов, он может представлять собой заметный технологический прогресс для применения в трансляционной медицине. Кроме того, система микробиореакторов обеспечивает заметный прогресс в технологии органоидов стволовых клеток путем воссоздания in vitro специфической микросреды, которая позволяет проводить долгосрочную культивирование клеток с высокой пластичностью, а именно в виде ЭСК, иПСК, эпигенетически стертых клеток и МСК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В течение последних десятилетий широко распространенная концепция однонаправленной прогрессии в направлении клеточной приверженности и дифференцировки была полностью пересмотрена. Было продемонстрировано, что спецификация ячейки может быть обращена вспять, и терминально дифференцированная клетка может быть подтолкнута к менее зафиксированному и более высокому разрешительному состоянию, используя различные методы.

Среди нескольких предложенных способов один из наиболее перспективных методов включает использование химических соединений для индуцирования клеток в так называемую химически индуцированную плюрипотентность. Малые молекулы, используемые в этом подходе, способны взаимодействовать и модифицировать эпигенетическую сигнатуру взрослой зрелой клетки, избегая необходимости в любом трансгенном и/или вирусном векторе 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Многочисленные исследования недавно показали, что можно переключать клетки с одного фенотипа на другой, предоставляя специфические биохимические и биологические стимулы, которые индуцируют реактивацию гиперметилированных генов 11,12,13,14,15. Эти события деметилирования позволяют превращать терминально дифференцированные клетки в примитивный предшественник, мультипотентную или высокопластичную/плюрипотентную клетку 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Параллельно многие исследования в последнее время сосредоточены на понимании сигналов, связанных с механозондированием, и, более конкретно, на возможности использования механических сил для непосредственного влияния на пластичность и/или дифференцировку клеток 16,17,18,19. Действительно, было ясно продемонстрировано, что внеклеточный матрикс (ECM) играет ключевую роль в контроле судьбы клеток. В частности, биомеханические и биофизические сигналы, производимые ECM, непосредственно регулируют молекулярные механизмы и сигнальные пути, влияя на поведение и функции клеток20,21. Эти последние данные проложили путь к разработке новых систем 3D-культур, которые более точно имитируют микросреду клеток in vivo, воспроизводя механические и физические стимулы, определяющие поведение клеток.

Здесь мы описываем двухэтапный протокол, который сочетает в себе использование химического эпигенетического стирания с сигналами, связанными с механозондированием, для генерации плюрипотентных клеток млекопитающих. На первом этапе клетки инкубируют с деметилирующей молекулой 5-аза-цитидин (5-аза-CR). Этот агент способен индуцировать значительное глобальное деметилирование ДНК посредством комбинированного эффекта прямого действия 8,10, опосредованного транслокацией 2 (TET2) и косвенного ингибирования ДНК-метилтрансфераз (DNMT)22,23. Этот этап индуцирует удаление эпигенетических блоков с последующей реактивацией экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью, и, следовательно, генерацию клеток высокой пластичности 1,2,3,8,10, далее именуемых «эпигенетически стертыми клетками». На втором этапе клетки инкапсулируются в систему 3D-культуры. С этой целью в качестве микробиореактора используется нереакционноспособное гидрофобное синтетическое соединение политетрафторэтилен (PTFE; с размером частиц 1 мкм), что позволяет создать клеточную микросреду, недостижимую с помощью традиционных 2D-культуральных систем10. Частицы порошка PTFE прилипают к поверхности капли жидкости, в которой клетки повторно суспендируются, и изолируют жидкое ядро от опорной поверхности, обеспечивая при этом газообмен между внутренней жидкостью и окружающей средой24. Полученный таким образом «микробиореактор PTFE», также известный как «Жидкий мрамор», побуждает клетки свободно взаимодействовать друг с другом, способствуя 3D-перегруппировке клеток 25,26,27, а также расширяет и стабильно поддерживает приобретенное состояние высокой пластичности через биомеханозондирующие сигналы 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Миланского университета. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальными институтами здравоохранения США (NIH). Изоляция клеток человека от здоровых взрослых людей была одобрена Этическим комитетом ospedale Maggiore Policlinico, Милан. Все методы в нашем исследовании были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

1. Выделение фибробластов кожи

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные ниже, могут быть применены к фибробластам, выделенным из различных видов млекопитающих, включая мышей, свиней и человека. Мышиные клетки были выделены из 7-недельных самцов мышей, а ткань кожи свиней была собрана на местной скотобойне. Клетки человека были выделены из взрослых пациентов после письменного информированного согласия.

  1. Приготовить 0,1% раствор желатина свиней.
    1. Взвесьте 0,1 г свиного желатина и растворите его в 100 мл воды. Стерилизуйте желатиновый раствор путем автоклавирования перед использованием.
    2. Покрыть 35 мм чашку Петри 0,1% свиным желатином, добавив 1,5 мл приготовленного раствора. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  2. Вырежьте биопсии кожи млекопитающих (мыши, свиней и человека) длиной около 2-5 см и поместите их в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) Dulbecco, содержащий 2% антимикотический раствор антибиотика. Хранить при температуре + 4 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсийные сборы должны проводиться по согласованию и после одобрения Этического комитета в соответствии с установленными руководящими принципами.
  3. Тщательно промыть собранные биопсии три раза свежим стерильным ПБС, содержащим 2% антимикотический раствор антибиотика.
  4. Соберите биопсии с последней промывки и поместите их в стерильную 100-миллиметровую чашку Петри. Используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать их на кусочки размером примерно 2 мм3 .
  5. В конце 2 ч инкубации удаляют избыток раствора желатина из 35-мм чашки Петри (описанной на этапе 1.1.2) и, используя стерильный хирургический пинцет, сразу же помещают 5-6 фрагментов кожи в каждую предварительно покрытую культуральную чашку.
  6. Смочите фрагменты, добавив 100 мкл капель изоляционной среды фибробластов (табл. 1) поверх каждого из них. Культивирование при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить испарение среды, поместите чашку Петри толщиной 35 мм в чашку Петри толщиной 100 мм или больше, содержащую стерильную воду. Убедитесь, что обе чашки Петри закрыты.
  7. После 24 ч культуры проверьте количество среды в 35 мм культуры чашки Петри. При необходимости добавьте 500 мкл среды выделения фибробластов, чтобы сохранить фрагменты влажными.
  8. Осторожно удалите среду и обновляйте ее не реже чем через 2 дня посева с помощью пипетки.
  9. Когда фибробласты начинают вырастать из фрагментов кожи, помещаются в 35 мм чашку Петри (описана в шаге 1.5.) и начинают образовывать клеточный монослой (обычно через 6 дней). Удалите кусочки кожи с помощью стерильного хирургического пинцета и культивируйте в 2 мл среды выделения фибробластов.
  10. Продолжают культивировать клеточный монослой при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе до 80% слияния и обновлять среду через день.

2. Культура первичной клеточной линии фибробластов

  1. Когда фибробласты достигнут 80% слияния, осторожно удаляют изоляционную среду фибробластов и трижды промывают клетки 3 мл PBS, содержащего 1% антимикотический раствор антибиотика.
  2. Для отсоединения клеток добавляют 600 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в чашку для культивирования и инкубируют при 37 °C в течение 3-5 мин.
  3. Добавьте 5,4 мл питательной среды фибробластов для нейтрализации трипсина, когда клетки начнут отделяться от чашки для культивирования (таблица 1).
  4. Вытесняйте клетки путем многократного и мягкого пипетирования. Пластинчатые клетки в новой культуральной посуде (без желатина), сохраняя соотношение прохождения между 1:2 и 1:4 (в зависимости от скорости роста).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование не требуется.
  5. Поддерживают клетки в культуре и меняют среду каждые 2 дня, пока они не достигнут 80% слияния и проходят их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размножайте фибробласты два раза в неделю для поддержания энергичного роста.

3. Воздействие фибробластов на 5-аза-CR

  1. Приготовить свежий 1 мМ 5-аза-CR стоковый раствор.
    1. Взвесьте 2,44 мг 5-аза-CR и растворите его в 10 мл ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы. Повторное суспендирование порошка путем вихря. Стерилизуйте раствор фильтром 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 5-аза-CR раствор должен быть приготовлен непосредственно перед использованием.
    2. Готовят 5-аза-CR рабочий раствор, разбавляя 1 мкл 5-аза-CR запасного раствора (3.1.1.) в 1 мл культуральной среды фибробластов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация рабочего раствора 5-аза-CR составляет 1 мкМ 1,2,3,8,9.
  2. Трипсинизируют клетки, как описано ранее (2.1.-2.3.) и вытесняют клетки путем многократного и мягкого пипетирования.
  3. Соберите клеточную суспензию и переложите ее в коническую трубку.
  4. Подсчитывайте ячейки с помощью счетной камеры под оптическим микроскопом при комнатной температуре. Рассчитать объем среды, необходимый для повторной суспендации клеток для получения 4 х 104 клеток в 30 мкл культуральной среды фибробластов, дополненной 1 мкМ 5-аза-CR (см. этап 3.1.2.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формула, которая будет использоваться, зависит от конкретного типа камеры.
    figure-protocol-1
  5. Центрифугируют клеточную суспензию при 150 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и повторно суспендировать гранулу с культуральной средой фибробластов, дополненной 1 мкМ 5-аза-CR (см. этап 3.1.2.). Объем используемой питательной среды фибробластов см. на этапе 3.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отрицательного контроля повторно суспендируют клетки с одинаковой концентрацией в культуральной среде фибробластов без 5-аза-CR и продолжают инкапсуляцию клеток в порошке PTFE (этап 4.1.-4.13.).

4. Инкапсуляция фибробластов в микробиореакторах PTFE

  1. Наполните чашку Петри толщиной 35 мм порошком политетрафторэтилена (PTFE) для получения слоя (рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 35 мм бактериологические чашки Петри, чтобы избежать адгезии жидкого мрамора. Чтобы получить тонкую гидрофобную и пористую оболочку, используйте порошок ptfe со средним размером частиц 1 мкм и полученный с максимальным измельчением 2,0 NPIRI. Это позволяет создавать газопроницаемые жидкие шарики. Кроме того, полупрозрачное покрытие облегчает наблюдение за процессами агрегации клеток в режиме реального времени Больший размер частиц приводит к высокой полидисперсности, что может вызвать повышенное испарение, деформацию и потерю сферической формы, а также преждевременное растворение микробиореакторов.
  2. Распределите 30 мкл одной капли, содержащей 4 x 104 клетки (см. шаги 3.4.- 3.5.), на слой порошка (рисунок 1B).
  3. Осторожно поверните 35-миллиметровую чашку Петри круговыми движениями, чтобы гарантировать, что порошок PFTE полностью покроет поверхность капли жидкости, образуя жидкий мраморный микробиореактор (рисунок 1C).
  4. Возьмите микробиореактор из жидкого мрамора с помощью наконечника пипетки объемом 1000 мкл, разрезанного по краю, чтобы приспособиться к диаметру мрамора (рисунок 1D, E). Нанесите микробиореактор из жидкого мрамора на чистую бактериологическую чашку Петри, чтобы стабилизировать ее (рисунок 1F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать трение для захвата мрамора внутри наконечника, вырежьте наконечники пипетки диаметром примерно меньше диаметра жидкого мрамора.
  5. Перенесите жидкий мраморный микробиореактор из чашки Петри в 96-луночную пластину (один мрамор/лунку) (рисунок 1G).
  6. Медленно добавляйте 100 мкл среды с края скважины. Микробиореактор начинает плавать поверх среды (рисунок 1H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микробиореактор разрывается при прямом контакте с жидкостью из-за нарушения гидрофобности PTFE. В качестве альтернативного подхода микробиореакторы из жидкого мрамора могут быть индивидуально помещены в 35-миллиметровую бактериологическую культуральную чашку. В этом случае, чтобы предотвратить испарение жидкого мрамора, 35-мм чашка Петри, содержащая микробиореактор, должна быть вставлена в 100-миллиметровую чашку Петри, предварительно аликвотированную стерильной водой.
  7. Инкубировать жидкий мраморный микробиореактор в течение 18 ч при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе 1,2,3,8,9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер частиц PTFE 1 мкм может обеспечить оптимальный газообмен между внутренней жидкостью и окружающей средой.
  8. После инкубации 5-аза-CR в течение 18 ч соберите жидкий мраморный микробиореактор, используя наконечник пипетки объемом 1000 мкл, разрезанный по краю (см. этап 4.5).
  9. Поместите микробиореактор в новую 35-миллиметровую бактериологическую чашку Петри (рисунок 1D-F).
  10. Используйте иглу, чтобы проколоть жидкий мрамор и разбить его.
  11. Восстановленные сформированные сфероиды с наконечником пипетки объемом 200 мкл, разрезанным по краю, под стереомикроскопом (рисунок 1I,J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эпигенетически стертые клетки, инкапсулированные в PTFE, образуют 3D-сферическую структуру (по одному агрегату в каждом жидком мраморе).
  12. Чтобы оценить приобретение плюрипотентного состояния в ответ на 5-аза-CR, проверьте начало экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью, OCT4, NANOG, REX1 и SOX2, с помощью качественной ПЦР (таблица 2).
  13. Перейдите ко второму шагу протокола, как описано ниже.

5. Культура в микробиореакторах PTFE эпигенетически стертых клеток

  1. Готовят свежую питательную среду ESC (таблица 1).
  2. Перенос органоидов в чашку Петри, содержащую среду ESC, для промывки остатков 5-аза-CR (см. шаги 5.1.-5.2.).
  3. Приготовьте новую 35-миллиметровую бактериологическую чашку Петри, содержащую слой порошка из ПТФЭ (см. также шаг 4.1.).
  4. Распределите один органоид в капле 30 мкл питательной среды ESC на слой порошка с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл, разрезанного по краю (см. шаги 4.9.; 5.3.).
  5. Осторожно поверните 35-миллиметровую чашку Петри круговыми движениями, чтобы сформировать новый жидкий мраморный микробиореактор, поднимите его с помощью кончика пипетки объемом 1000 мкл, вырежьте по краю и поместите вновь образованный микробиореактор в колодец из 96-луночной пластины (один мрамор / лунка) (см. шаги 4.3.-4.6.).
  6. Чтобы всплыть микробиореакторы, добавьте 100 мкл среды с края скважины, чтобы медленно омыть мрамор (см. примечание 4.7.).
  7. Культивируйте жидкие мраморные микробиореакторы при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 столько, сколько потребуется. Меняйте среду через день, следуя процедуре, описанной в 5.3.-5.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящей рукописи приведены результаты, полученные с культурой органоидов за 28 дней. Однако при необходимости может быть выполнен более длительный период культивирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает все этапы, которые должны быть выполнены для генерации и стабильного поддержания плюрипотентных клеток млекопитающих из взрослых соматических клеток. Этот метод был успешным с фибробластами, выделенными из различных видов млекопитающих, а именно мыши, свиней и человека. Репрезентативные результаты, представленные здесь, получены из всех клеточных линий, независимо от вида происхождения.

Морфологические анализы показывают, что после 18-часовой инкубации с деметилиру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В течение последних десятилетий несколько исследований были сосредоточены на разработке стратегий возврата терминально дифференцированной клетки к менее приверженному и более высокому разрешительному состоянию. Описанный здесь протокол позволяет генерировать и длительно поддерживать плюрипотентные клетки, начиная со взрослых зрелых терминально дифференцированных клеток. Метод сочетает в себе два независимых этапа, которые предполагают индукцию состояния высокой разрешительности, которое достигается за счет химического эп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Фондом Каррарези и MiND FoodS Hub ID: 1176436. Все авторы являются членами COST Action CA16119 In vitro 3-D общее руководство клетками и фитнес (CellFit).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МеркаптоэтанолSigma-AldrichM7522Компонент среды ESC
5-АзацитидинSigma-AldrichA23855-аза-CR, для эпигенетического стирания фибробластов
АденозинSigma-AldrichA4036Компонент нуклеозидной смеси для среды ESC
Антибиотик Антимикотический раствор (100&раз;)Sigma-AldrichA5955Компонент фибробластов и сред
ESC CFX96 Real-Time PCRBio-Rad LaboratoriesNAТермоамплификатор для количественной ПЦР
ЦитидинSigma-AldrichC4654Компонент нуклеозидной смеси для среды ЭСК
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, пируватаThermo Fisher Scientific41966052Для выделения фибробластов и питательной среды
DMEM, низкий уровень глюкозы, пируватThermo Fisher Scientific31885023для ESC среды
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буферSigma-AldrichD5652PBS; для биопсии и промывки клеток и для приготовления раствора
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021мРНК эстракция
ESGRO Рекомбинантный мышиный белок LIFSigma-AldrichESG1106Компонент среды ESC Фетальная
бычья сыворотка, квалифицированная, термоинактивированнаяThermo Fisher Scientific10500064Компонент фибробластов и ESC среды
FGF-Basic (AA10-155) Рекомбинантный белок человекаThermo Fisher ScientificPHG0024Компонент среды ESC
Желатин из свиной кожиSigma-AldrichG1890Для покрытия посуды
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNAТермоамплификатор для качественной ПЦР
Global DNA Methylation ELISA НаборCELL BIOLABSSTA-380Исследование метилирования
GoTaq G2 Flexi DNA PolymerasePromegaM7801Качественная ПЦР
ГуанозинSigma-AldrichG6264Компонент нуклеозидной смеси для ESC среды
Ham's F-10 Питательная смесьThermo Fisher Scientific31550031Для ESC среды
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Научный10828028Компонент среды ESC KOVA
стеклостек 10 с сеткамиHycor Biomedical87144Для подсчета клеток
Leica MZ APO СтереомикроскопLeicaNAДля наблюдения за органоидами
раствор L-глутаминаSigma-AldrichG7513Компонент фибробластов и ESC среды
MEM Раствор заменимых аминокислот (100X)Thermo Fisher Scientific11140035компонент среды ESC
Millex-GS 0,22 &; m поровые фильтрыMilliporeSLGS033SBДля стерилизации раствора
M-MLV Обратная транскриптаза, РНКаза H Minus, Point MutantPromegaM3681мРНК обратная транскрипция
Multiskan FC Микропланшетный фотометрThermo Fisher Scientific51119000Для ИФА планшет
для чтения Nikon Eclipse TE300 Инвертированный фазово-контрастный микроскопNikonNAДля клетки наблюдение
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNAThermal Cycler для обратной транскрипции
Poly(тетрафторэтилен) 1 μ m размер частицSigma-Aldrich430935Для создания микробиореактора
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Genomic DNA Estraction
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit ThermoFisher ScientificAM1728Количественная ПЦР
ТимидинSigma-AldrichT1895Компонент нуклеозидной смеси для среды ESC
Чашка для культуры тканей 100X20 мм, Стандартная833902 Sarstedtдля выделения фибробластов
Чашка для культуры тканей 35X10 мм, Стандартнаячашка Sarstedt833900Для выделения фибробластов
Чашка для культуры тканей 35X10 мм, СуспензияSarstedt833900500Бактериология чашка Петри для жидкой культуры мрамора
Тарелка для культуры тканей 96 Well,Standard,FSarstedt833924005Для жидкой мраморной культуры
Трипсин-ЭДТА растворSigma-AldrichT3924Для диссоциации фибробластов
Пробирка 15мл, 120х17мм, PSSarstedt62553041Для центрифугирования клеточной суспензии
UridineSigma-AldrichU3003Компонент нуклеозидной смеси для ESC среды

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

Похожие статьи