Клональный анализ сердца новорожденной мыши с использованием моделирования по принципу «Ближайший сосед»

Краткое содержание

Здесь представлен протокол использования многоцветного отслеживания родословной и моделирования ближайшего соседа для идентификации клонально полученных кардиомиоцитов во время роста и регенерации у мышей. Этот подход является объективным, работает в различных условиях маркировки и может быть адаптирован для включения различных конвейеров анализа изображений.

Аннотация

Заменив утраченный или дисфункциональный миокард, регенерация тканей является многообещающим подходом к лечению сердечной недостаточности. Тем не менее, проблема выявления добросовестной регенерации сердца ограничивает валидацию потенциальных регенеративных факторов. Одним из методов обнаружения новых кардиомиоцитов является многоцветное отслеживание линии с клональным анализом. Эксперименты с клональным анализом могут быть сложными для проведения, потому что слишком редкие условия маркировки не чувствительны к редким событиям, таким как пролиферация кардиомиоцитов, а диффузное мечение ограничивает способность разрешать клоны. Здесь представлен протокол для проведения клонального анализа сердца новорожденной мыши с использованием статистического моделирования распределений ближайших соседей для разрешения клонов кардиомиоцитов. Этот подход позволяет распознавать клоны в различных условиях мечения и обеспечивает надежный аналитический подход для количественной оценки пролиферации и регенерации кардиомиоцитов. Этот протокол может быть адаптирован к другим тканям и может широко использоваться для изучения регенерации тканей.

Введение

Гистологическим признаком сердечной недостаточности является потеря кардиомиоцитов (КМ) в результате травмы, старения или апоптоза¹. Восполнение утраченного или дисфункционального миокарда за счет регенерации тканей представляет собой потенциальную терапевтическую стратегию для лечения пациентов с сердечной недостаточностью. За последние несколько десятилетий плодотворные достижения в области биологии развития и регенеративной биологии выявили ограниченную способность сердца млекопитающих восполнять утраченные КМ 2,3,4,5. Эта захватывающая работа повысила вероятность того, что врожденные механизмы роста могут быть задействованы для регенерации. Поскольку врожденные регенеративные реакции функционально отсутствуют в сердце взрослого млекопитающего, для реализации терапевтической регенерации сердца необходимы методы повышения надежности эндогенной репарации.

Механизмы врожденной регенерации сердца, по-видимому, консервативны у разных видов. После травмы ранее существовавшие КМ размножаются с образованием новых КМ у рыбок данио ^6,7, тритонов ^8,9, мышей ^4,10, крыс¹¹ и свиней^12,13. Соответственно, многие группы стремятся выявить митогены, способные способствовать кардиомиогенезу. Однако такая работа является сложной. Задача не только заставить взрослых млекопитающих размножаться КМ является сложной задачей, но и выявить редкие пролиферативные события является сложной задачей ^1,14. Проблема идентификации редких циклических КМ осложняется тенденцией взрослых млекопитающих к преимущественно эндомитозу. Например, после повреждения сердца мыши почти 25% КМ в пограничной зоне вновь вступают в клеточный цикл, но только 3,2% КМ делятся⁴. Поскольку большинство циклических КМ дублируют свой геном, но не подвергаются цитокинезу, простое определение увеличения числа циклических КМ неоднозначно для истинного кардиомиогенеза. Таким образом, анализы на инкорпорацию нуклеозидов КМ или на наличие пролиферативных маркеров на КМ могут не полностью указывать на регенерацию. По мере того, как появляется все больше факторов-кандидатов на регенерацию сердца, необходимы анализы для лучшего выявления гиперплазии КМ.

Клональный анализ с помощью отслеживания родословной является ценным подходом к анализу кардиомиогенеза, поскольку он позволяет напрямую визуализировать клетки и их потомство. Традиционные подходы к клональному анализу включают редкое мечение одиночных клеток репортерным геном. Тем не менее, одноцветное отслеживание линии редких клеток может иметь ограниченную ценность для нечастых событий, таких как пролиферация КМ, поскольку шансы мечения пролиферирующего КМ низкие^. В качестве альтернативы, многоцветная трассировка родословной может повысить чувствительность клонального анализа¹⁶. Вкратце, отдельные клетки генетически помечены одним из нескольких флуоресцентных белков в случайном порядке, так что пролиферирующие клетки будут генерировать однородно окрашенные кластеры клеток, которые могут быть разрешены из соседних флуоресцентных клеток. Этот метод использовался для отслеживания роста в различных органах, а в последнее время был применен в исследованиях^{регенерации} сердца млекопитающих^. В то время как многоцветное отслеживание линии может обнаружить клональное расширение КМ на эмбриональной и неонатальной стадиях, врожденные регенеративные реакции не так легко обнаружить в сердце взрослой мыши после повреждения сердца^17,19. Одним из подходов к повышению чувствительности многоцветной трассировки родословной является повышение уровня маркировки и увеличение вероятности визуализации редких событий. Тем не менее, более широкое мечение происходит за счет невозможности отличить одинаково меченые клетки как происходящие от общего предка от клеток, которые были независимо помечены одним и тем же флуорофором. Здесь представлен протокол, который использует моделирование ближайшего соседа для идентификации клонально родственных КМ в сердце неонатальной мыши. Этот метод является непредвзятым, количественным и работает в различных условиях маркировки.

Протокол

Все процедуры по обращению с мышами, проведению операций по выживанию и извлечению сердец требуют одобрения местного институционального комитета по использованию животных.

1. Мыши для клонального анализа КМ

1. Скрещивание мышей Myh6-MerCreMer ²⁰ с мышами Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw 21} для получения Myh6-MerCreMer; R26R-Rainbow битрансгенные мыши.
   1. Поддерживайте популяции мышей, гомозиготных по аллелю R26R-Rainbow, и скрещивайте с мышами, гетерозиготными по аллелю Myh6-MerCreMer, таким образом, чтобы все эксперименты проводились на мышах, гетерозиготных по аллелю R26R-Rainbow. В качестве альтернативы можно использовать мышей, гомозиготных по аллелю R26R-Rainbow, чтобы увеличить цветовое разнообразие, но для этого потребуется система визуализации, которая может точно различать флуорофоры EGFP, mCerulean, mOrange и mCherry.
2. Проводят генотипирование в момент забора сердца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши Myh6-MerCreMer экспрессируют тамоксифен-индуцируемую Cre-рекомбиназу в КМ и могут быть генотипированы с использованием ПЦР-праймеров CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) и GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) для получения продукта из 200 пар оснований (bp). Мыши R26R-Rainbow конститутивно экспрессируют EGFP, но будут стохастически экспрессировать mCerulean, mOrange или mCherry после Cre-опосредованной рекомбинации. R26R-Rainbow может быть генотипирован с помощью праймеров для ПЦР CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAATA (R26-R) и TCAATGGGCGGGGGTT (Rainbow-R). Аллель дикого типа дает произведение 350.о., а аллель Радуги дает произведение 250.о.

2. Криотравма и мечение кардиомиоцитов

1. Выполняют криотравмы, как описано ранее, с незначительными изменениями^22,23. Осторожно поместите однодневных мышей (P1) на подушку с колотым льдом на 3 минуты, чтобы вызвать остановку сердца. Подтвердите адекватную анестезию путем выполнения щипка пальца ноги без рефлекторного отвода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время проведения анестезии имеет решающее значение. Выживание может быть нарушено, если мышей охлаждать слишком долго. Кроме того, возраст мышей имеет решающее значение. Регенеративная способность резко ослабевает в течение первой недели жизни¹⁰.
2. Поместите обезболенного щенка на холодный компресс и подложите его под объектив хирургического препарирующего микроскопа. С помощью микроножниц 6 мм выполните торакотомию между 4-м и 5-м ребрами, чтобы обнажить переднюю поверхность сердца.
3. С помощью криозонда, охлажденного в жидком азоте, поместите зонд на левый желудочек на 1-2 с. При фиктивных травмах проводят торакотомию без криотравмы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность криотравмы диктует степень травмы. Длительные травмы снизят выживаемость.
4. Закройте разрез полипропиленовым швом 6-0, прикрепленным к игле диаметром 0,15 мм.
5. Быстро согрейте щенка и вручную стимулируйте возобновление кровотока. Как только щенок начнет самопроизвольно двигаться, положите его на грелку.
6. Выздоровевшим детенышам вводят 20 мкг тамоксифена внутрибрюшинно. На этом этапе при необходимости введите анальгетики, такие как 0,25% бупивакаин вдоль линии шва. Верните щенков к матери.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Детеныши из одного помета вместе восстанавливаются и вместе возвращаются к матери. Такой рабочий процесс улучшает выживаемость и повторное принятие подстилки плотиной.

3. Забор сердца и обработка для гистологического анализа

1. Соберите сердца через 20 дней после травмы (dpi) или после рождения (P21), так как регенеративные реакции могут наблюдаться к этой временной точке¹⁰. Сначала усыпляют мышей в ингаляционной камере с_CO2 , а затем переносят в хирургический микроскоп.
   Примечание: Эвтаназия должна проводиться в соответствии с институциональными рекомендациями по использованию животных.
2. Как только достаточная анестезия подтвердится, проведите двойную торакотомию с использованием хирургических микроножниц, чтобы обнажить сердце. Затем перфузируйте сердце 1 мл 1 М KCl, 1 мл 4% параформальдегида и 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Адекватное промывание необходимо для ограничения внутрижелудочковых сгустков крови, которые могут вызвать аутофлуоресценцию во время получения изображения.
3. После перфузии рассеките сердце и поместите его в пробирку, содержащую не менее 1 мл PBS.
4. Используйте препарирующий микроскоп для обрезки сердец, чтобы оптимизировать внедрение. Горизонтальный срез под предсердием обеспечивает хорошую поверхность для заделки сердец для секций с короткой осью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно разрезать сердце поперечно, если требуются участки с длинной осью.
5. Поместите обрезанные сердцевины в 1 мл сахарозы 30% (масс./об.) при температуре 4 °C на 12–18 часов. Извлеките образцы из раствора сахарозы. Закладывайте обрезанную ткань в блоки с помощью тканевой замораживающей среды.
6. Быстро заморозьте вложенную ткань на сухом льду и храните блоки при температуре −80 °C.
7. Разрежьте замороженные блоки с цельным сердцем на секции по 10 мкм с помощью криостата, закрепите на заряженных предметных стеклах и храните предметные стекла при температуре −20 °C. Последовательно разделите сердца на 10 слайдов. Это делается путем установки секции на каждый из 10 слайдов, прежде чем вернуться к первому слайду, чтобы добавить еще одну секцию. Такая стратегия ограничивает вероятность захвата одних и тех же CM в нескольких разделах на одном слайде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и ограничивайте воздействие света, чтобы предотвратить потерю флуоресценции.
8. Когда все будет готово к визуализации, разморозьте предметные стекла и восстановите водный баланс в PBS. Добавьте установочный материал, предотвращающий выцветание, перед тем как наносить защитное стекло #1.5. Храните предметные стекла в закрытом контейнере при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения ожидаемых результатов при криотравме читатель может обратиться к предыдущей работе по^{этой теме}. Сердечные отделы имеют высокий уровень аутофлуоресценции. Использование гасителей, таких как Sudan Black, перед нанесением покровного стекла может помочь снизить автофлуоресценцию. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы избежать гашения флуорофоров, представляющих интерес.

4. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже шаги относятся к использованию коммерческого микроскопа (см. Таблицу материалов), который имеет вертикальную широкопольную флуоресцентную систему с фильтрующими кубами, оснащенными для различения флуорофоров mCerulean, EGFP, mOrange и mCherry, а также программное обеспечение, связанное с этой установкой (см. Таблицу материалов). Дополнительные действия будут варьироваться в зависимости от используемой системы визуализации.

1. Визуализируйте весь слайд с 5-кратным увеличением только с помощью фильтра GFP, чтобы создать карту слайдов.
2. Выберите отдельные участки на карте слайдов, которые не повреждены и имеют ограниченную автофлуоресценцию для визуализации. Из-за последовательного разрезания на наборы по 10 слайдов соседние срезы будут находиться на расстоянии не менее 100 мкм друг от друга, что исключает визуализацию одних и тех же КМ.
3. Выполняйте сканирование отдельных участков с помощью объектива 20x с фильтрами mCerulean, mOrange, mCherry и EGFP. Репрезентативные изображения показаны на рисунке 1.
4. Сохраняйте изображения в формате, позволяющем извлекать информацию об отдельных каналах. Будьте осторожны при выборе имен файлов в формате, который позволит идентифицировать сердце, флуорофор и положение участка в сердце. Для выполнения описанных ниже вычислительных этапов требуется систематический подход к именованию.

5. Анализ изображений для выявления меченых КМ

1. Выберите нетронутые фрагменты изображения из каждого набора и случайным образом распределите их среди всех скринеров. Убедитесь, что специалисты по скринингу придерживаются следующих шагов для каждого изображения.
2. Для каждого канала (mCerulean, mOrange и mCherry) используйте инструмент «Цветовой баланс» на ImageJ²⁴ , чтобы настроить яркость и контрастность изображения, чтобы помочь пользователю идентифицировать помеченные ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ - это бесплатный инструмент для анализа изображений, который можно загрузить с https://imagej.net. Для этого протокола использовалась версия 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. В ImageJ выберите «Установить измерения» в раскрывающемся меню «Анализ». В открывшемся окне выберите «Область | Центр масс | Ограничивающий прямоугольник | Предел порога».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль вычитания изображения иногда может использоваться для улучшения сигнала флуорофора относительно фоновой автофлуоресценции. Однако, если это выполняется, вычитание должно выполняться систематически для всех изображений в наборе данных.
4. Открыв интересующее изображение, выберите «Инструменты», а затем выберите «Менеджер ROI» в выпадающем меню «Анализ». Откроется окно «Менеджер ROI».
5. Выберите инструмент «Произвольное выделение» на панели инструментов ImageJ и обведите интересующую ячейку (рис. 2A). После трассировки нажмите «t» или используйте кнопку «Добавить [t]» в окне «Менеджер ROI» (Рисунок 2B). Повторите для всех ячеек одного канала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация и ROI должны быть выполнены для каждого канала отдельно.
6. После того, как все ячейки для данного канала будут выбраны, сохраните ROI в виде файла .zip. Для этого сначала выберите «Отменить выбор» в окне «Менеджер ROI», чтобы убедиться, что ни один ROI не выделен. Затем нажмите на вкладку «Еще» в окне «Менеджер ROI» и выберите опцию «Сохранить». Откроется навигатор рабочего стола, где ROI сохраняются в виде файла .zip.
7. Экспортируйте измерения для каждого из ROI в виде файла .csv. Для этого убедитесь, что ни один ROI не выделен, снова выбрав «Отменить выбор», а затем выберите «Измерить» в окне «Менеджер ROI». Откроется новое окно «Результаты» со всеми измерениями, выбранными ранее.
8. В окне «Результаты» выберите «Файл», затем выберите «Сохранить как» из выпадающего меню (Рисунок 2C). Это еще раз откроет навигатор рабочего стола, чтобы файл можно было сохранить в формате .csv.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно сохраните ROI и измерения, прежде чем переходить к сегментации следующего канала.
9. Будьте осторожны при выборе имен файлов в формате, который позволит идентифицировать сердце, канал и положение участка в сердце. Например, 'HeartType#_Set#_Section#_Channel' (например, 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' для ROI и 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' для соответствующих измерений).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже код предполагает описанное выше соглашение об именовании. Другое соглашение об именовании потребует внесения изменений в код.

6. Статистический анализ

Примечание: Клетки, несущие один и тот же флуорофор, представляют собой смесь клонально полученных клеток (родственников) и неродственных клеток, которые подверглись случайному событию рекомбинации для экспрессии одного и того же флуорофора (неродственных). Основываясь на априорных данных¹⁷, предполагается, что родственные клетки находятся ближе друг к другу, чем неродственные клетки, экспрессирующие тот же флуорофор. Таким образом, родственные и неродственные клетки могут быть дифференцированы на основе порога расстояния. Однако для того, чтобы определить пороговое значение, необходимо деконволюционировать распределения ближайших соседей для родственных и неродственных клеток. К счастью, распределения ближайших соседей для неродственных клеток можно оценить, оценив значения ближайших соседей от каждой клетки до ближайшей клетки, несущей другой флуорофор. В данной работе представлена методика статистического определения порогового расстояния для определения клональности и присвоения вероятности родства между клетками.

1. Используя файлы .csv, полученные из раздела 5, вычислите расстояния до ближайших соседей для каждой ячейки в срезе сердца. Скомпилируйте эти результаты по внутриканальным (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange и mCherry-mCherry) и межканальным (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry и mCherry-mCerulean) расстояниям. Сохраните результаты в двух .csv файлах: один для расстояний внутри канала и один для расстояний между каналами.
   1. Установите код Python²⁵ , для которого требуются библиотеки numpy и pandas.
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. Вычисляйте расстояния и экспортируйте файлы .csv для расстояний внутри канала и между каналами с помощью snippet_6_1.py Python.
2. Считывание расстояний внутри канала и между каналами в кадр данных R²⁶ , преобразуя идентификаторы сердца в категориальную переменную. Примените пороговое значение, выбранное специально, просмотрев гистограммы ближайших соседей (рис. 3A, C), чтобы свести к минимуму выбросы. Обязательно выберите порог, который покрывает более 90% расстояний между каналами и внутри канала, исключая при этом длинный хвост, чтобы избежать чрезмерной подгонки к шуму на больших расстояниях между ближайшими соседями. В этом протоколе используется пороговое значение 400 мкм (рис. 3). Используйте Rscript snippet_6_2.R для выполнения этого шага.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно смоделировать несколько срезов как отдельные переменные. Этот протокол ограничивает сложность модели до уровня сердца для простоты моделирования и оценки.
3. Получение натуральных логарифмов для расстояний внутри канала и между каналами. Поскольку ячейки являются занимающими пространство, а не точечными объектами, минимальное распределение расстояния до ближайшего соседа центрируется вокруг ненулевого значения и имеет асимметричные хвосты, поскольку максимальное расстояние между парами ячеек может быть значительно выше медианных значений (рис. 3A, C). Используйте логнормальное распределение для моделирования таких распределений (рис. 3B,D). Сделайте это с помощью Rscript snippet_6_3.R.
4. Используйте следующую байесовскую модель для оценки средних значений и дисперсий распределения ближайших соседей (α₂, σ²_{) и} неродственных (α₁, σ²₁), а также вероятности возникновения расстояний внутри канала из распределения родственников (π=e^β/(1+e^β)):
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   где Unif(a,b) – равномерное распределение на интервале [a,b], N(μ,σ²|lσ 2 , ограниченным интервалом (l,u), T₁(0,1|x>0) – стандартное распределение Коши (T с 1 степенью свободы), ограниченное положительной полулинией, bw.dist_i -^i-е зарегистрированное расстояние между канальными парами, а wi.dist_i -^i-е зарегистрированное расстояние внутри канальной пары. Обратите внимание, что зарегистрированные расстояния внутри канала имеют двухкомпонентное распределение смеси, отражающее примесь родственных и неродственных пар клеток.
   1. По возможности снабдите модель информативными априорными значениями. Например, согласно этому протоколу, родственные клетки должны быть ближе друг к другу, чем неродственные клетки, поэтому это предусмотрено в качестве априорного значения для среднего значения распределения расстояний. Затем используйте пакеты runjags²⁷ и coda²⁸ R, а также программу JAGS²⁹ для оценки параметров (Rscript snippet_6_4.R).
5. Выполните модель JAGS с числом цепочек, соответствующим количеству доступных процессоров. Для выполнения этого шага используйте Rscript snippet_6_5.R . Дайте программному обеспечению работать до конвергенции.
6. Используйте метрики для проверки сходимости алгоритма, такие как эффективный размер выборки (доступно с runjags), диагностика сходимости Гельмана-Рубина (доступно с runjags) и его автокорреляция (autocorr/autocorr.diag доступно в coda). Проверьте правильность аппроксимации оцененной модели для расстояний до ближайших соседей, изучив график Q-Q, на котором построено сравнение фактических и расчетных значений расстояний до ближайших соседей на уровне квантиля с использованием Rscript snippet_6_6.R (рис. 4C,F). Этот скрипт требует, чтобы пользователь отредактировал значения в строках 25-29 snippet_6_6.R на основе выходных данных команды 6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале для каждого из параметров³⁰ должен быть получен эффективный размер выборки (SSeff) более 10 000. Тем не менее, SSeff больше 2500 может подойти для некоторых сложных моделей. Диагностический показатель Гельмана-Рубина составляет 1,00 для идеальной сходимости и должен быть меньше 1,05 для удовлетворительной сходимости. Высокая автокорреляция указывает на медленное перемешивание в цепочках и является индикатором медленной сходимости. В случае хорошей модели график автокорреляции должен следовать за экспоненциальным затуханием. График Q-Q фактических и смоделированных распределений ближайшего соседа (рис. 4C,F) должен как можно точнее следовать диагонали.
7. После проверки точности моделей получите вероятность того, что пара клеток является родственной, в зависимости от расстояния между ними. Чтобы определить пороговое расстояние для определения того, являются ли клетки внутри канала родственниками, определите расстояние, на котором вероятность принадлежности к родству падает ниже 0,5. Это можно сделать с помощью Rscript snippet_6_7.R.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные пороговые значения могут быть выбраны на основе экспериментальных целей. Для некоторых применений пороговые значения могут быть нерелевантными, и вероятность быть родственной парой может быть непосредственно использована для взвешивания пар клеток.

Результаты

Следование протоколу для неонатальной криотравмы должно дать сердце P21 с травмой и без нее. Криоповрежденные сердца имеют хорошо очерченную травму, в то время как поверхность фиктивных сердец гладкая и однородная. При криоповрежденном сердце область повреждения должна быть последовательной от сердца к сердцу. После микроскопии должны быть получены изображения, аналогичные рисунку 1. Обратите внимание, что разрешение изображения позволяет идентифицировать отдельные КМ, а условия визуализации...

Обсуждение

Многоцветная трассировка линии является мощным подходом к выявлению закономерностей роста органов с разрешением одной клетки. Тем не менее, основным ограничением для многоцветной трассировки линий является необходимость разреженной маркировки клеток, что может снизить чувствительность для идентификации редких событий. Для таких органов, как сердце с печально известным низким уровнем обновления паренхиматозных клеток, это может привести к недооценке реакций роста. Здесь представлен пошаго...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
#1.5 Стеклянный покровный колпак	FisherScientific	12-544E
6-O пролен	Ethicon	8706H
Антивыцветающий монтажный материал	FisherScientific	00-4958-02
CO2 ингаляционная камера
Холодная упаковка
Cryomolds	VWR	15160-215
Криозонд	World Precision Instruments	501313
фильтрующие кубики
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw мыши
Программное обеспечение			https://imagej.net
KCl	1M FisherScientific	LC187951
криостат Leica CM3050
Микроножницы с жидким азотом
, 6 мм	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 мыши	Лаборатория Джексона	005657
иглодержатель	World Precision Instruments	14109
Параформальдегид 4%	FisherScientific
Фосфатный буферный физиологический раствор
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Вращающийся виброскоп
Сахароза 30% (масс./об.)	FisherScientific	BP220
Хирургические ножницы	препарирования World Precision Instruments	14393
Шприц для тамоксифена	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20μ g	Sigma	T5648
Среда для замораживания тканей	VWR	15148-031
Белый матовый/Плюс слайды	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 вертикальная широкопольная флуоресцентная система
Zen 2.5 Blue программное обеспечение