Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии

5.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61657

⸱

26 сентября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

В этой статье

Краткое содержание

Ультра-высокоскоростной западный метод blotting разработан путем улучшения кинетики антиген-антител связывания через циклические слива и пополнения (CDR) технологии в сочетании с иммунореакцией повышения агента.

Аннотация

Западная помарка (также известная как иммуноблот) является каноническим методом биомедицинских исследований. Он обычно используется для определения относительного размера и обилия конкретных белков, а также пост-трансляционных белковых модификаций. Этот метод имеет богатую историю и по-прежнему широко используется из-за своей простоты. Тем не менее, западная процедура blotting лихо занимает несколько часов, даже дней, чтобы завершить, с критическим узким местом является долго инкубации раз, которые ограничивают его пропускную способность. Эти инкубационные шаги необходимы из-за медленного диффузии антител от раствора навалом до обездвиженные антигены на мембране: концентрация антител вблизи мембраны намного ниже, чем концентрация навалом. Здесь мы представляем новшество, которое резко сокращает эти инкубационые интервалы за счет улучшения связывания антигенов через циклическое осушение и пополнение (CDR) раствора антител. Мы также использовали иммунореакцию повышения технологии для сохранения чувствительности анализа. Сочетание метода CDR с коммерческим иммунореакцией повышающий агент увеличило выходной сигнал и существенно сократило время инкубации антител. В результате ультра-высокоскоростной западной пятно может быть достигнуто в 20 минут без потери чувствительности. Этот метод может быть применен к западным пятнам, используя как хемилюминесцентные, так и флуоресцентные обнаружения. Этот простой протокол позволяет исследователям лучше исследовать анализ экспрессии белка во многих образцах.

Введение

Западная помарка (также известная как иммуноблот) является мощным и фундаментальным методом в широком диапазоне научных и клинических дисциплин. Этот метод используется для изучения присутствия, относительного изобилия, относительной молекулярной массы и пост-трансляционных модификаций белков1. В сочетании с цифровым анализом изображений, этот метод может надежно анализировать обилие белков и белковых модификаций2. Хотя западная помарка выполняется регулярно, это трудоемкий и трудоемкий метод. Требуются длительные инкубации антител с мембранами. Здесь мы описываем модификацию метода инкубации, которая преодолевает это ограничение без ущерба для чувствительности.

Во время инкубации мембраны антитела плавают в растворе, в то время как антигены обездвижены на мембране. Из-за их высокой близости, скорость связывания антител к антигену быстрее, чем диффузия антител от массового раствора к мембране. Это создает низкую концентрацию "слой истощения"(рисунок 1). Это может занять несколько часов для более отдаленных антител, чтобы достичь мембраны через пассивную диффузию, которая является основным фактором, ответственным за долгое время инкубации в этой технике. Этот эффект называется ограничением общественного транспорта (MTL)3. Было предложено, что повторяющиеся слива и пополнения антител содержащие раствор может нарушить слой истощения и преодолеть MTL4. Здесь мы разработали уникальный метод, который реализует эту циклическую концепцию осушения и пополнения (CDR), чтобы уменьшить эффект MTL в традиционном западном протоколе blotting и заметил, сократить необходимый инкубационный период.

Для того, чтобы сохранить чувствительность обнаружения с коротким временем инкубации, мы использовали иммунореакцию повышения технологии, которая ускоряет реакцию антиген-антитела, тем самым улучшая соотношение сигнала кшуму 5. Многие коммерчески доступные иммунореакции повышения агентов (IRE) состоят из 2 компонентов (Решение 1 и 2, см. Таблицу материалов). Запатентованный состав или механизм действия IRE не был раскрыт, но мы ранее обнаружили, что IRE уменьшила константу диссоциации между антигеном и антителами в твердых фазообразующих анализах, что указывает на увеличение сродства, по крайней мере частично, ответственного за усиливающий эффект IRE6. Сочетание CDR с IRE дает ультра-высокоскоростной западный протокол blotting, который уменьшает все время процедуры без ущерба для чувствительности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. SDS-PAGE и переход на мембрану PVDF

  1. Выполните SDS-PAGE, чтобы отделить белки на основе относительного размера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любая коммерческая или домашняя система геля в порядке. Пожалуйста, следуйте протоколу производителя.
  2. Передача разделенных белков из геля на мембрану PVDF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общие методы передачи (полусухая или влажная передача) подходят. Пожалуйста, следуйте протоколу производителя.

2. Блокирование мембран PVDF

  1. Инкубировать мембраны в соответствующих блокирующих буферов в течение 1 ч с агитацией при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от первичной системы антител и обнаружения следует выбрать соответствующий блокирующий буфер. Например, наиболее типичными блокаторами являются BSA, обезжиренное сухое молоко, кейсин и коммерческие синтетические полимеры. PBS и/или TBS с 0,1% Tween20 являются наиболее часто используемыми буферами. Этот блокирующий шаг может быть сделан в течение ночи при 4 градусов по Цельсию.

3. Инкубация первичными антителами

  1. Подготовка 10% иммунореакции повышения агента-1 раствор (IRE-1) с дистиллированной водой. Вортекс хорошо.
  2. Приготовьте разбавленное первичное антитело с 10% IRE-1. Смешайте его осторожно и тщательно.
  3. При использовании более крупной мембраны (4 см х 8 см - 8 см х 8 см), добавьте 8 мл раствора антител в 50 мл конической центрифуги трубок. При использовании меньшей мембраны (2 см х 8 см - 4 см х 8 см), добавьте 3 мл раствора антител в 14 мл круглого дна полипропиленовой трубки(таблица материалов).
  4. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте блокирующий раствор кратко. Вставьте мембрану PVDF в эту трубку с пальцами в перчатках и убедитесь, что вся мембрана прилипает к стене трубки. Когда мембрана PVDF вставляется в трубку, лицо "белковой стороне" мембраны, которая была первоначально в контакте с гелем внутрь. Закройте крышку плотно.
  5. Вставьте трубку 50 мл в стеклянную бутылку для гибридизации печи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда 14 мл трубки используются для этой инкубации, вставьте 14 мл трубки в 50 мл трубки, используя пару пластиковых держателей кольца держать внутреннюю трубку в центре 50 мл трубки.
  6. Включите печь гибридизации.
  7. Инкубировать мембрану с 6 оборотов в минуту вращения, по крайней мере 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мембрана всегда прилипает к стене и что (внутренняя) трубка горизонтальная, чтобы равномерно покрыть мембрану раствором антител. Калибруйте разбавление антитела и инкубационное время до фактического эксперимента.

4. Мембранная стирка

  1. Остановите вращение.
  2. Аккуратно удалите мембрану PVDF из трубки с помощью пинцета и поместите мембрану в контейнер с 50 мл PBS-T.
  3. Промыть мембрану кратко с PBS-T.
  4. Промыть мембрану в контейнере дистиллированной водой, пока не появятся пузырьки. Это для удаления большинства антител.
  5. Перенесите мембрану PVDF из контейнера в салатный спиннер, содержащий 250 мл PBS-T.
  6. Поместите корзину ситечко в спиннер. Убедитесь, что крышка была поставлена на надежно.
  7. Активировать спиннер и запустить его около 20-30 с.
  8. Отбросьте раствор и кратко промойте внутреннюю часть спиннера дистиллированной водой.
  9. Добавьте 250 мл PBS-T в спиннер снова.
  10. Повторите шаги 4.6 и 4.7.

5. Инкубация со вторичным антителом

  1. Подготовка 10% иммунореакции повышения агента-2 раствор (IRE-2) с дистиллированной водой. Вортекс хорошо.
  2. Приготовьте разбавленное вторичное антитело с 10% IRE-2. Смешайте его осторожно и тщательно.
  3. Выберите объем раствора антитела и трубки, как указано в шаге 3.3.
  4. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор кратко. Вставьте мембрану PVDF в трубку, как указано в шаге 3.4.
  5. Вставьте трубку 50 мл в стеклянную бутылку для гибридизации печи.
  6. Включите печь гибридизации.
  7. Инкубировать мембрану с 6 оборотов в минуту вращения, по крайней мере 5 мин. Убедитесь, что мембрана постоянно прилипает к стене и что (внутренняя) трубка горизонтальная, чтобы равномерно покрыть мембрану раствором антител.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откалибровать инкубационное время до фактического эксперимента. Когда вторичное антитело флуоресцентно конъюгированных, выполнять инкубацию в темноте.

6. Мембранная стирка

  1. Следуйте шагам от 4.1 до 4.10.

7. Приобретение изображений

  1. Обнаружение химилюминесцентных ламп
    1. Поместите кусок полуплантплантной гибкой пленки (10 см х 15 см) на плоскую поверхность.
    2. Смешайте 2 компонента химилюминесцентного субстрата в трубке объемом 5 мл.
    3. Немедленно перенесите 1,5 мл смешанного субстрата на полусплантную гибкую пленку и поместите на нее мембрану PVDF. Затем перенесите оставшуюся часть субстратного раствора на мембрану.
    4. Инкубировать мембрану PVDF со смешанным субстратом на полупрозрачной гибкой пленке в течение 1 мин.
    5. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор субстрата кратко.
    6. Сэндвич мембраны между парой прозрачности фильмов.
    7. Приобрети изображение в режиме хемилюминесцентных ламп.
  2. Флуоресцентное обнаружение
    1. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор кратко.
    2. Сэндвич мембраны между парой прозрачности фильмов.
    3. Приобрети изображение в флуоресцентном режиме.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 7.1 и 7.2 должны выполняться в непосредственной близости от аппарата визуализации для обеспечения максимальной чувствительности.
    4. Когда фоновый сигнал высок, выполните шаг стирки в контейнере с 80-100 мл PBS-T: 10 мин промыть 3 раза для первичного антитела и 5 мин промыть 6 раз для вторичного антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как первичные, так и вторичные антитела, разбавленные 10% IRE решениями, могут быть использованы до 8-10 раз без потеричувствительности 6. Раствор следует хранить при 4 градусах Цельсия в течение 1 месяца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот пример иллюстрирует эффективность метода CDR вместе с технологией иммуноэнгенса на западной помарке. Статическая инкубация проводилась на полупрозрачной гибкой пленке, где мембраны PVDF инкубировались раствором антитела, в то время как инкубация CDR находилась в печи гибридизации вращающимися трубками, содержащими мембраны и раствор антитела (Movie). На рисунке 2 показаны количества антигена и антитела, соответственно, необходимые для обнаружения хемилюминесцентных веществ на западных п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Западная помарка широко используемая аналитическая техника для того чтобы обнаружить специфически протеины которые были натыся 40 леттому назад 7,8. С тех пор техника продолжает развиваться, с последующими нововведениями, улучшая чувствительность, скорость иколичественную оценку техники 2,9,10,11,12,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявили, что не имеют прямого отношения к содержанию этой статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана Отделом интрамуральных исследований, Национальным институтом сердца, легких и крови, Национальными институтами здравоохранения. S.H. была поддержана Японской программой государственно-частного партнерства по обучению студентов за рубежом, а H.N. и K.Y. были стипендией Valor и V Drug Overseas Training Scholarship.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
14 мл Пробирка из полипропилена с круглым дном и высокой прозрачностью, градуированная, с защелкивающейся крышкойFalcon352059
прозрачной пленкой Apollo для лазерных принтеровН/Д Н/ДЛюбые виды прозрачной пленки для лазерного принтера подойдут.
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600Любая система получения изображений подходит для хемилюминесцентного и/или флуоресцентного обнаружения.
получить сигнал усилителя иммунной реакции растворTOYOBONKB-101
CARNATION Быстрорастворимое обезжиренное сухое молокоCarnationN/A
ECL антимышиный IgG, связанный с пероксидазой хрена F(ab')2 фрагмент от овецGE HealthcareNA9310V
ECL антикроличий IgG, связанный с пероксидазой хрена F(ab')2 фрагмент из ослаGE HealthcareNA9340V
HYBAID Micro-4н/д/дЛюбая гибридизационная печь хороша, если трубки равномерно вращаются в горизонтальном положении.
Мембрана Immobilon-P PVDF, 0,45 &; m размер порMillipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLICOR926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Secondary AntibodyLICOR926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrateseracare5430-0049
Мышиный анти-ß актиновый антителоMillipore SigmaA5316
Блокирующий буфер Odyssey (PBS)LICOR927-40100Блокирующий буфер для обнаружения флуоресценции
OXO Салатный спиннерOXO32480V2BЛюбой салатный спиннер хорош, если мембраны PVDF энергично промываются без разрывов.
Парапленочная герметизирующая пленкаBemisParafilm M PM996полупрозрачная гибкая пленка
Полиэтиленовые винтовые крышки с плоским верхом для конического дна центрифужных пробирокFalcon352070
Кольца для удержания пробирки 14 мл в центре пробирки 50 млн/дПриготовлено в механической мастерской
Кролик анти-6X Его метка антителоAbcamab9108
Tween20Миллипоры SigmaP2287
может н

Ссылки

  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
  3. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
  4. Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
  5. Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
  6. Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  8. Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
  9. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

циклическое удаление и восполнениедетектирование белковинкубация с антителамихемилюминесцентное детектированиефлуоресцентное детектированиеПВДФ-мембранаблокирующий буферцентрифуга для салата
Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.