Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Ультра-высокоскоростной западный метод blotting разработан путем улучшения кинетики антиген-антител связывания через циклические слива и пополнения (CDR) технологии в сочетании с иммунореакцией повышения агента.

Abstract

Западная помарка (также известная как иммуноблот) является каноническим методом биомедицинских исследований. Он обычно используется для определения относительного размера и обилия конкретных белков, а также пост-трансляционных белковых модификаций. Этот метод имеет богатую историю и по-прежнему широко используется из-за своей простоты. Тем не менее, западная процедура blotting лихо занимает несколько часов, даже дней, чтобы завершить, с критическим узким местом является долго инкубации раз, которые ограничивают его пропускную способность. Эти инкубационные шаги необходимы из-за медленного диффузии антител от раствора навалом до обездвиженные антигены на мембране: концентрация антител вблизи мембраны намного ниже, чем концентрация навалом. Здесь мы представляем новшество, которое резко сокращает эти инкубационые интервалы за счет улучшения связывания антигенов через циклическое осушение и пополнение (CDR) раствора антител. Мы также использовали иммунореакцию повышения технологии для сохранения чувствительности анализа. Сочетание метода CDR с коммерческим иммунореакцией повышающий агент увеличило выходной сигнал и существенно сократило время инкубации антител. В результате ультра-высокоскоростной западной пятно может быть достигнуто в 20 минут без потери чувствительности. Этот метод может быть применен к западным пятнам, используя как хемилюминесцентные, так и флуоресцентные обнаружения. Этот простой протокол позволяет исследователям лучше исследовать анализ экспрессии белка во многих образцах.

Introduction

Западная помарка (также известная как иммуноблот) является мощным и фундаментальным методом в широком диапазоне научных и клинических дисциплин. Этот метод используется для изучения присутствия, относительного изобилия, относительной молекулярной массы и пост-трансляционных модификаций белков^1. В сочетании с цифровым анализом изображений, этот метод может надежно анализировать обилие белков и белковых модификаций^2. Хотя западная помарка выполняется регулярно, это трудоемкий и трудоемкий метод. Требуются длительные инкубации антител с мембранами. Здесь мы описываем модификацию метода инкубации, которая преодолевает это ограничение без ущерба для чувствительности.

Во время инкубации мембраны антитела плавают в растворе, в то время как антигены обездвижены на мембране. Из-за их высокой близости, скорость связывания антител к антигену быстрее, чем диффузия антител от массового раствора к мембране. Это создает низкую концентрацию “слой истощения”(рисунок 1). Это может занять несколько часов для более отдаленных антител, чтобы достичь мембраны через пассивную диффузию, которая является основным фактором, ответственным за долгое время инкубации в этой технике. Этот эффект называется ограничением общественного транспорта (MTL)³. Было предложено, что повторяющиеся слива и пополнения антител содержащие раствор может нарушить слой истощения и преодолеть MTL⁴. Здесь мы разработали уникальный метод, который реализует эту циклическую концепцию осушения и пополнения (CDR), чтобы уменьшить эффект MTL в традиционном западном протоколе blotting и заметил, сократить необходимый инкубационный период.

Для того, чтобы сохранить чувствительность обнаружения с коротким временем инкубации, мы использовали иммунореакцию повышения технологии, которая ускоряет реакцию антиген-антитела, тем самым улучшая соотношение сигнала к^{шуму 5}. Многие коммерчески доступные иммунореакции повышения агентов (IRE) состоят из 2 компонентов (Решение 1 и 2, см. Таблицу материалов). Запатентованный состав или механизм действия IRE не был раскрыт, но мы ранее обнаружили, что IRE уменьшила константу диссоциации между антигеном и антителами в твердых фазообразующих анализах, что указывает на увеличение сродства, по крайней мере частично, ответственного за усиливающий эффект IRE^6. Сочетание CDR с IRE дает ультра-высокоскоростной западный протокол blotting, который уменьшает все время процедуры без ущерба для чувствительности.

Protocol

1. SDS-PAGE и переход на мембрану PVDF

1. Выполните SDS-PAGE, чтобы отделить белки на основе относительного размера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любая коммерческая или домашняя система геля в порядке. Пожалуйста, следуйте протоколу производителя.
2. Передача разделенных белков из геля на мембрану PVDF.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общие методы передачи (полусухая или влажная передача) подходят. Пожалуйста, следуйте протоколу производителя.

2. Блокирование мембран PVDF

1. Инкубировать мембраны в соответствующих блокирующих буферов в течение 1 ч с агитацией при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от первичной системы антител и обнаружения следует выбрать соответствующий блокирующий буфер. Например, наиболее типичными блокаторами являются BSA, обезжиренное сухое молоко, кейсин и коммерческие синтетические полимеры. PBS и/или TBS с 0,1% Tween20 являются наиболее часто используемыми буферами. Этот блокирующий шаг может быть сделан в течение ночи при 4 градусов по Цельсию.

3. Инкубация первичными антителами

1. Подготовка 10% иммунореакции повышения агента-1 раствор (IRE-1) с дистиллированной водой. Вортекс хорошо.
2. Приготовьте разбавленное первичное антитело с 10% IRE-1. Смешайте его осторожно и тщательно.
3. При использовании более крупной мембраны (4 см х 8 см – 8 см х 8 см), добавьте 8 мл раствора антител в 50 мл конической центрифуги трубок. При использовании меньшей мембраны (2 см х 8 см – 4 см х 8 см), добавьте 3 мл раствора антител в 14 мл круглого дна полипропиленовой трубки(таблица материалов).
4. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте блокирующий раствор кратко. Вставьте мембрану PVDF в эту трубку с пальцами в перчатках и убедитесь, что вся мембрана прилипает к стене трубки. Когда мембрана PVDF вставляется в трубку, лицо “белковой стороне” мембраны, которая была первоначально в контакте с гелем внутрь. Закройте крышку плотно.
5. Вставьте трубку 50 мл в стеклянную бутылку для гибридизации печи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда 14 мл трубки используются для этой инкубации, вставьте 14 мл трубки в 50 мл трубки, используя пару пластиковых держателей кольца держать внутреннюю трубку в центре 50 мл трубки.
6. Включите печь гибридизации.
7. Инкубировать мембрану с 6 оборотов в минуту вращения, по крайней мере 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мембрана всегда прилипает к стене и что (внутренняя) трубка горизонтальная, чтобы равномерно покрыть мембрану раствором антител. Калибруйте разбавление антитела и инкубационное время до фактического эксперимента.

4. Мембранная стирка

1. Остановите вращение.
2. Аккуратно удалите мембрану PVDF из трубки с помощью пинцета и поместите мембрану в контейнер с 50 мл PBS-T.
3. Промыть мембрану кратко с PBS-T.
4. Промыть мембрану в контейнере дистиллированной водой, пока не появятся пузырьки. Это для удаления большинства антител.
5. Перенесите мембрану PVDF из контейнера в салатный спиннер, содержащий 250 мл PBS-T.
6. Поместите корзину ситечко в спиннер. Убедитесь, что крышка была поставлена на надежно.
7. Активировать спиннер и запустить его около 20-30 с.
8. Отбросьте раствор и кратко промойте внутреннюю часть спиннера дистиллированной водой.
9. Добавьте 250 мл PBS-T в спиннер снова.
10. Повторите шаги 4.6 и 4.7.

5. Инкубация со вторичным антителом

1. Подготовка 10% иммунореакции повышения агента-2 раствор (IRE-2) с дистиллированной водой. Вортекс хорошо.
2. Приготовьте разбавленное вторичное антитело с 10% IRE-2. Смешайте его осторожно и тщательно.
3. Выберите объем раствора антитела и трубки, как указано в шаге 3.3.
4. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор кратко. Вставьте мембрану PVDF в трубку, как указано в шаге 3.4.
5. Вставьте трубку 50 мл в стеклянную бутылку для гибридизации печи.
6. Включите печь гибридизации.
7. Инкубировать мембрану с 6 оборотов в минуту вращения, по крайней мере 5 мин. Убедитесь, что мембрана постоянно прилипает к стене и что (внутренняя) трубка горизонтальная, чтобы равномерно покрыть мембрану раствором антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Откалибровать инкубационное время до фактического эксперимента. Когда вторичное антитело флуоресцентно конъюгированных, выполнять инкубацию в темноте.

6. Мембранная стирка

1. Следуйте шагам от 4.1 до 4.10.

7. Приобретение изображений

1. Обнаружение химилюминесцентных ламп
   1. Поместите кусок полуплантплантной гибкой пленки (10 см х 15 см) на плоскую поверхность.
   2. Смешайте 2 компонента химилюминесцентного субстрата в трубке объемом 5 мл.
   3. Немедленно перенесите 1,5 мл смешанного субстрата на полусплантную гибкую пленку и поместите на нее мембрану PVDF. Затем перенесите оставшуюся часть субстратного раствора на мембрану.
   4. Инкубировать мембрану PVDF со смешанным субстратом на полупрозрачной гибкой пленке в течение 1 мин.
   5. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор субстрата кратко.
   6. Сэндвич мембраны между парой прозрачности фильмов.
   7. Приобрети изображение в режиме хемилюминесцентных ламп.
2. Флуоресцентное обнаружение
   1. Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор кратко.
   2. Сэндвич мембраны между парой прозрачности фильмов.
   3. Приобрети изображение в флуоресцентном режиме.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 7.1 и 7.2 должны выполняться в непосредственной близости от аппарата визуализации для обеспечения максимальной чувствительности.
   4. Когда фоновый сигнал высок, выполните шаг стирки в контейнере с 80-100 мл PBS-T: 10 мин промыть 3 раза для первичного антитела и 5 мин промыть 6 раз для вторичного антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как первичные, так и вторичные антитела, разбавленные 10% IRE решениями, могут быть использованы до 8-10 раз без потери^{чувствительности 6.} Раствор следует хранить при 4 градусах Цельсия в течение 1 месяца.

Representative Results

Discussion

Западная помарка широко используемая аналитическая техника для того чтобы обнаружить специфически протеины которые были натыся 40 лет^{тому назад 7,8.} С тех пор техника продолжает развиваться, с последующими нововведениями, улучшая чувствительность, скорость и^{количественную оценку техники 2,9,10,11,12,13.} Улучшенный ультра-высокоскоростной западный протокол blotting представленный здесь делает несколько существенных улучшений к существующей технике. Мы уменьшаем время инкубации, не жертвуя чувствительностью, снижая порог обнаружения с помощью IRE. Специального или дорогостоящего оборудования не требуется: для преодоления MTL достаточно вращающейся трубки в гибридной печи. Ключевым нововведением является то, что CDR эффективно устраняет слой истощения в анализе. Хотя аппарат роликовой культуры обычно используется для уменьшения объема раствора, потенциал этого метода для преодоления MTL и сокращения инкубации раз не был проиллюстрирован. Из-за резкого сокращения общего времени для всей процедуры(рисунок 4), гораздо большее количество западных данных пятно в день могут быть получены, когда заблокированные мембраны находятся в руке, что почти невозможно сделать это с традиционным западным протоколом blotting. Следует отметить, что инкубация мембраны на качалки платформы шейкера эквивалентна статической инкубации^4,6. Промывка мембран PVDF в бытовом коммерческом салатном спиннере с большим объемом стирального раствора также уменьшает продолжительность процедуры(рисунок 4).

Успешное использование этого протокола зависит от оптимизации разбавления антител раствором IRE и инкубации времени. Широкий спектр титровати антител рекомендуется в начале анализов, так как CDR в сочетании с IRE существенно повышаетчувствительность (рисунок 2). Еще одним фактором, который следует учитывать, является время инкубации. Когда один имеет хорошие западные результаты пятно с 1 ч инкубации с первичными антителами в статических условиях, инкубацио время может быть сокращено до 5-10 мин в условиях CDR в целом. Например, при ночной инкубации с первичными антителами следует оценить чуть более длительное время инкубации CDR (30 мин – 6 ч). Время разбавления и инкубации вторичными антителами также имеет решающее значение. Инкубации более 30 мин в условиях CDR обычно дают более высокий фон. Таким образом, требуется тщательная титрование вторичных антител с инкубацией до 30 мин. Когда фоновый сигнал высок после тщательного титровавания антител, должны быть выполнены обширные шаги стирки (10 мин полоскания 3 раза для первичного антитела и 5 мин полоскания 6 раз для вторичного антитела в контейнере с 80-100 мл стирального раствора).

Качество западных данных пятно часто зависит от антител, используемых. Когда у нас было трудное антитело, используемое для западной помарки, белковые маркеры иногда показывали существенные сигналы даже после тщательного титровавания антител и обширного мытья. Так как мы заметили, что метод CDR с IRE имеет тенденцию к увеличению неспецифической привязки, добавление блокирующих реагентов (таких как обезжиренное молоко и другие) в разбавивки антител может улучшить соотношение сигнала к^{шуму 14}. Это трудоемкий скрининг шаг, но это стоит попробовать.

Западная помарка стала важной для количественных^{применений 2}. Полукомантификация может быть выполнена с помощью обнаружения хемилюминесцентных веществ. Процедура, представленная здесь, применима к зачистке и повторному зондированию с этой целью^6. Из-за более широкого динамического диапазона, флуоресцентное обнаружение является лучшим вариантом. С помощью этого протокола флуоресцентное обнаружение обеспечивает линейный динамический диапазон для количественного^{анализа 6.} Стоит отметить, что время инкубации CDR с флуоресцентным обнаружением кажется более длительным, чем при обнаружении гемилюминесцентных ламп.

Западная помарка имеет широкий спектр применений и остается универсальным методом для изучения изобилия белка, белково-белковых взаимодействий и пост-трансляционных модификаций. Например, антиуглеводные антитела могут быть легко использованы для западной пятно с этим^{протоколом 14}. Поскольку различные углеводные moieties, выраженные на внешней поверхности вирусных, бактериальных и фугу являются патоген-специфическими, они являются бесценными целями для распознавания патогенов и диагностики инфекционных заболеваний. Таким образом, применение этого простого протокола может повлиять на многие области исследования, бритья часов ожидания не только для экспериментов, но и клинические иммунодиагностики, которые полагаются на западные технологии blotting.

Materials

14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap	Falcon	352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers	N/A	N/A	Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk	Carnation	N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate	seracare	5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner	OXO	32480V2B	Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film	Bemis	Parafilm M PM996	semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes	Falcon	352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube	N/A	N/A	Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287