Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61665

⸱

6 октября 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University-University of Adelaide Joint Centre for Agriculture and Health, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 2College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Heifei, China, 3School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эта работа описывает использование технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 для нокаутирования эндогенного гена OsABCG15 с последующим модифицированным протоколом трансформации Agrobacterium-опосредованногодля производства стабильной мужской стерильной линии в рисе.

Аннотация

Мужская стерильность является важной агрономической чертой для производства гибридных семян, которая обычно характеризуется функциональными дефектами в мужских репродуктивных органах/геймерах. Последние достижения в области технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 позволяют обеспечить высокую эффективность редактирования и временем для мутаций эндогенных генов-кандидатов на конкретных участках. Кроме того, Agrobacterium-опосредованная генетическая трансформация риса также является ключевым методом модификации генов, который был широко принят многими государственными и частными лабораториями. В этом исследовании мы применили инструменты редактирования генома CRISPR-Cas9 и успешно создали три мужские стерильные линии мутантов путем целевого редактирования генома OsABCG15 в japonica cultivar. Мы использовали модифицированный метод преобразования риса при посредничестве Agrobacterium,который мог бы обеспечить отличные средства генетической выхолощения для производства гибридных семян риса. Трансгенные растения могут быть получены в течение 2-3 месяцев и гомозиготные трансформанты были проверены генотипированием с использованием усиления ПЦР и секвенирования Sanger. Базовая фенотипическая характеристика мужской стерильной гомозиготной линии была выполнена микроскопическим наблюдением за рисовыми мужскими репродуктивными органами, анализом жизнеспособности пыльцы йодным йодом калия (I2-KI),окрашивая полутонкое поперечное сечение развивающихся пыль.

Введение

Рис является наиболее важной продовольственной культурой, особенно в развивающихся странах, и представляет собой основной продукт питания для более чем половины населения мира. В целом спрос на рисовое зерно растет и, по прогнозируется, увеличится на 50% к 2030 году и на 100% к 2050году 1,,2. Будущие улучшения урожайности риса должны будут извлечь выгоду из различных молекулярных и генетических ресурсов, которые делают рис отличной моделью для монокотайледонных исследований растений. К ним относятся эффективная система трансформации, передовая молекулярная карта и общедоступная база данных тегов выраженной последовательности, которые были созданыв течение многих лет 3,4. Одной из стратегий повышения урожайности является гибридноепроизводство семян 5,центральным элементом которого является способность манипулировать мужской плодовитости. Понимание молекулярного контроля мужской плодовитости зерновых культур может помочь перевести ключевые знания в практические методы для улучшения производства гибридных семян и повышенияурожайности 6,,7.

Генетическая трансформация является ключевым инструментом для фундаментальных исследований и коммерческого сельского хозяйства, поскольку она позволяет внедрение иностранных генов или манипуляции эндогенных генов в растениеводствах, и приводит к генерации генетически модифицированных линий. Соответствующий протокол преобразования может помочь ускорить генетические и молекулярные исследования биологии для фундаментального понимания регуляциигенов 8. У бактерий генетическая трансформация происходит естественным путем; однако, в растениях, это выполняется искусственно с использованием методов молекулярнойбиологии 9,10. Agrobacterium tumefaciens является почвенной, грам-негативной бактерией, которая вызывает заболевания коронного желчного пузыря у растений, передавая T-DNA, область его плазмида Ti, в клетку растений через систему секреции типа IV11,12. В растениях, A. tumefaciens-опосредованное преобразование считается широко распространенным методом для модификации генов, поскольку это приводит к стабильной и низкой интеграции числа копий Т-ДНКв геном хозяина 13. Трансгенный рис был впервые создан через Agrobacterium-опосредованноепреобразование гена в середине 1990-х годов в japonica cultivar14. С помощью этого протокола в течение 4 месяцев было получено несколько трансгенных линий с эффективностью трансформации от 10%до 30%. Исследование показало, что есть два критических шага для успешной трансформации: один является индукция эмбрионального каллуса из зрелых семян, а другой является добавление ацетосиренгона, фенольное соединение, к бактериальной культуре во время совместного выращивания, что позволяет более высокую эффективность преобразованияв растениях 14,15. Этот протокол был широко использован с незначительными изменениями в japonica16,17,18,19, а также другие сорта, такие как indica20,21,22,23 и тропические japonica24,,25. Действительно, более 80% статей, описывающих преобразование риса использовать Agrobacterium-опосредованноепреобразование генов в качестве инструмента13. На сегодняшний день разработано несколько протоколов генетической трансформации с использованием семян риса в качестве исходного материаладля индукции каллуса 16,,17,,18,,19. Тем не менее, очень мало известно о молодых соцветий, как explants для производства каллуса. В целом, важно создать быстрый, воспроизводимый и эффективный протокол преобразования генов и регенерации для функциональной геномики и исследований по улучшению урожая.

В последние годы развитие технологии CRISPR-Cas9 привело к точному механизму редактирования генома, чтобы понять функцию генов и доставить агрономически важные улучшениядля разведения растений 26,27. CRISPR также предлагает значительные перспективы для манипулирования мужским репродуктивным развитием и гибридным производством. В этом исследовании мы использовали систему генного нокаута с использованием технологии CRISPR-Cas9 и соединили ее с эффективным протоколом преобразования генов риса, используя молодые соцветия в качестве эксплантов, создавая тем самым стабильные мужские стерильные линии для изучения репродуктивного развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. sgRNA-CAS9 конструкция вектора выражения завода и Agrobacterium-опосредованнаятрансформация

  1. Целевой мужской стерильный ген OsABCG15 в рисе в соответствии с опубликованнойлитературой 28.
  2. Дизайн sgRNA для целевого сайта, расположенного между 106-125 bp во втором exon OsABCG15 (Рисунок 1).
  3. Используйте полинуклеотидную киназу T4 для синтеза sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' и 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').
  4. Используйте эндонюклиз BbsI для переваривания вектора позвоночника psgR-Cas929.
  5. Ligate синтезированных sgRNA oligos с линейной psgR-Cas9 позвоночника с использованием T4 лигазы после протокола производителя.
  6. Используя HindIII/EcoRI, переварите кассету sgRNA из шага 1.5 и субклон в сайт HindIII/EcoRI двоичного вектора pCAMBIA1300 для стабильнойтрансформации 29.
  7. Подтвердите построенную плазмиду путем переваривания ферментов и секвенирования. Позже преобразуйте двоичную конструкцию в штамм Agrobacterium tumefaciens EHA105 и выращивайте их на пластинах выбора Kan/Rif при 28 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней.

2. Генетическая трансформация риса и культура тканей растений

  1. Индукция и регенерация Каллуса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежие молодые соцветия риса в качестве исходного материала, чтобы вызвать каллуса (Рисунок 2).
    1. Соберите молодые соцветия из поля для риса или зеленого дома на стадии мейоза, определяемой длиной цветка 1,6-4,8 мм(рисунок 2A)29. Убедитесь, что соцветия риса покрыты листовой оболочкой. Протрите каждую соцветие с 70% спиртового тампона и дайте ему высохнуть перед резки.
    2. Довнесите соцветие до чистой стерильной скамейки. Разрежьте его на мелкие кусочки (чем меньше, тем лучше) с стерилизованными ножницами, а затем перенесите черешки на пластину Петри, содержащую NBD2средний (рисунок 2B, Таблица 1).
    3. Инкубировать пластину в темноте при 26 градусов по Цельсию в течение 10-14 дней, чтобы вызвать каллуса (Рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте недавно сформированный каллус для инфильтрации Agrobacterium (шаг 2.2.7) непосредственно или восстановить еще раз в свежем NBD2 среды, чтобы получить больше каллуса. Передача каллуса в новую среду NBD2 каждые 8-10 дней.
  2. Трансформация и совместное культивирование
    1. Используйте бактерии A. tumefaciens, содержащие бинарную плазмиду из шага 1.6 для преобразования. Храните штаммы A. tumefaciens в среде YEB(таблица 1) с 50% глицеролом при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования.
    2. Полоса A. tumefaciens от -80 градусов по Цельсию глицерола запасов YEB агар среды, содержащейселективные антибиотики( Таблица 1 ) и расти на 25-28 градусов по Цельсию для 48-72 ч, чтобы колонии появляются.
    3. Прививка одной колонии от пластины YEB с селективными антибиотиками до 5 мл жидкой среды YEB, содержащей те же селективныеантибиотики (таблица 1), в конической стерильной пробирке 50 мл. Встряхните на орбитальном шейкере при 250 x g,при 25-28 градусов по Цельсию, пока бактерии не вырастут до OD600 из 0,5.
    4. Добавьте 1 мл бактериальной суспензии в 100 мл среды YEB(таблица 1) стеми же селективными антибиотиками в конической колбе 250 мл и встряхните на орбитальном шейкере при 250 x x g,при 28 градусах цельсия на 4 ч.
    5. Центрифуга при температуре 4000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре для сбора бактерий. Откажитесь от супернатанта.
    6. Повторное производство бактериальных гранул со средним AAM-AS(таблица 1) и разбавить подвеску до OD600 и 0,4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный OD бактериальной суспензии имеет решающее значение для эффективной трансформации. Это помогает в устранении избыточного роста бактерий на каллусе.
    7. Соберите около 150 здоровых растущих светло-желтых хрупких эмбриональных калли из шага 2.1.3 в стерильную колбу 150 мл. Добавить 50-75 мл бактериальной клеточной суспензии от шага 2.2.6 в стерильную колбу, а затем добавить около 10-25 мл свежей AAM-AS среды, чтобы погрузить калли в течение 10-20 мин, встряхивая время от времени.
    8. Вылейте бактериальную суспензию из колбы тщательно и высушите избыток бактериальной суспензии из каллуса с помощью стерильной фильтровальной бумаги #1 или бумажной ткани. Затем поместите их на чашку Петри со средним NBD-AS(таблица 1), покрытые стерильной фильтровальной бумагой #1. Инкубировать при 25-28 градусов по Цельсию в темноте в течение 3 дней и проверить на бактериальный разрастание.
  3. Выбор для резистентного каллуса
    1. После 3 дней совместного выращивания перенесите калли в стерильную чашку Петри со стерильной фильтровальной бумагой.
    2. Воздух сухой калли на 2 ч на чистой скамейке. Убедитесь, что каллус не привязан к фильтровальной бумаге.
    3. Передача калли равномерно с помощью стерильного пинцета в первичную среду отбора NBD2 (с 40 мг/л гигромицина и 250 мг/л тотентина)(таблица 1). Культура калли в течение 2 недель при 25-28 градусов по Цельсию в темноте.
    4. Через 2 недели, передача калли равномерно на новую тарелку, содержащую свежий выбор среднего NBD2 (с 40 мг / л гигромицин и 250 мг / л тономин) (Таблица 1). Культура калли в течение еще 2 недель в 25-28 градусов по Цельсию в темноте.
  4. Дифференциация Каллуса
    1. Передача каллуса на свежий MS Medium (с 25 мг/л гигромицином и 150 мг/л тономином)(таблица 1). Культура под светом при 25-28 градусов по Цельсию в течение примерно 2 недель.
    2. Повторите шаг 2.4.1 еще раз.
    3. Передача стрелять почки на новый MS среды (с 10 мг / Л гигромицин), чтобы размножаться больше побегов.
  5. Корневая индукция
    1. Передача новых побегов в 1/2 MS среды(таблица 1). Культура под светом при 25 градусов по Цельсию - 28 градусов по Цельсию. Преобразованные растения производят корни в течение 2 недель.
    2. После 1 недели, передать растения для очистки горшки, покрывающие растение, чтобы предотвратить обезвоживание.

3. Идентификация генотипа

  1. Соберите молодые листья из новых растений для общей извлечения ДНК с помощью метода cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)31.
  2. Используя геномную ДНК в качестве шаблона, выберите грунтовки (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGCCTCGTATT 3' и Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGTTTCA 3' расположен в регионе Гигромицин) для выполнения полимеразной цепной реакции (PCR) для проверки трансгеннойинтеграции и частот (рисунок 4). Следующие условия ПЦР: 94 градуса по Цельсию в течение 5 мин; 36 циклов (94 градуса по Цельсию на 30 с; 56 градусов по Цельсию на 30 с; 72 градусов по Цельсию в течение 1 мин); 72 КК в течение 7 мин. Успешные реакции ПЦР дают 604 bp amplicon.
  3. Выполните еще один ПЦР, чтобы усилить геномную область вокруг целевых объектов CRISPR с помощью конкретных праймеров (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAGTTTCTCT 3' и OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAACATTGCTAT 3') для определения генотипа трансформаторов. Условия ПЦР такие же, как и в шаге 3.2.
  4. Используйте фрагменты ПЦР из шага 3.3 непосредственно для секвенирования Sanger для выявления мутаций.

4. Наблюдайте за основным фенотипом мутанта

  1. Приготовьте раствор I2-KI:растворите 2 г KI (йодида калия) в 10 мл дистиллированной воды, а затем добавьте в него 0,2 г I2 (повторно починили йодом). После смешивания довнесите общий объем до 100 мл с дистиллированной водой.
  2. Приготовьте раствор FAA (63% ангидроус этанола, 5% ледниковой уксусной кислоты, 5% формальдегида и 27% воды) и перемешайте перед использованием.
  3. Приготовьте 0,5% раствора голубого окрашивания Толуйдина: растворите 0,5 г толуйдина в 100 мл дистиллированной воды.
  4. Выполните вегетативное фенотипическое наблюдение, с помощью визуализации целых растений с помощью цифровой камеры.
  5. Выполните наблюдение репродуктивного фенотипа, удалите палею и лемму из цветка. Сфот фотографируй целые пыльцы под стереомикроскопом.
  6. Наблюдайте за жизнеспособностью пыльцы при окрашивание йодом.
    1. Выберите зрелые рисовые шипы перед цветочным антезом, удалите палеа и лемму, чтобы освободить пыльники.
    2. Возьмите 6 пыль и поместите их на стеклянную горку. Добавить 1 каплю дистиллированной воды, раздавить пыль на пыль хорошо пинцетом, чтобы освободить пыльцу зерна, а затем добавить 2-3 капли I2-KI раствор. Обложка с крышкой.
    3. Наблюдайте под микроскопом низкого увеличения. Пыльца зерна окрашены в черный цвет показывают более энергичную жизнеспособность, не цвет или желто-коричневый окрашенные отстают или вырождаются.
  7. Выполните полутонкий раздел рисового пыльного пыль
    1. Зафиксните рисовые цветы на разных стадиях развития в раствор FAA. Вакуумные материалы при 4 градусов по Цельсию (как правило, 15 мин), чтобы позволить фиксатору проникать в ткани до тех пор, пока материал не утонет на дно бутылки коллекции.
    2. Замените новое решение FAA на следующий день. После того, как материал опускается на дно, заменить 70% этанола и хранить при 4 градусов по Цельсию для долгосрочного использования.
    3. Обезвоживать материалы с различными градиентами этанола (70%, 80%, 95% каждый раз в течение 30 мин, 100% этанола на 2 ч, 100% этанола, содержащего немного сафранина красителя в течение 2 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить немного красителя Сафранина во второй 100% этанола, чтобы цвет пыль для облегчения секции потом.
    4. Выполните встраивание, следуя инструкции производителя (Таблица материалов). Затем выпекать в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 48 ч перед секцией.
    5. Раздел образца толщиной 2 мкм с помощью микротома. Добавьте каплю воды на стеклянную горку. Затем возьмите тонкие секции, содержащие антерные блоки типсами, и положите их на поверхность капли воды на горках.
    6. Поместите горки на водяной бане при 50 градусов по Цельсию, чтобы полностью распределить секции, чтобы она прочно прилиплась к слайду.
    7. Используйте 0,5% толуидин синий раствор пятно слайды в течение 30 мин. Затем промыть водой и высушить в дымовой капот. Печать с нейтральным клеем дерева. Аккуратно поместите крышку на слайд и высушите в дымовой капот.
    8. Наблюдайте и фотографуйте образец под микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь демонстрируется использование технологии редактирования генов для создания мужской стерильной линии для будущих исследований Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации риса. Для создания мужской стерильной линии osabcg15, CRISPR-CAS9-опосредованного мутагенеза был использован для двоичного векторного строительства. SgRNA был обусловлен Промоутер OsU3, в то время как выражение кассеты hSpCas9 был обусловлен двойной 35S промоутер, и средний вектор был собран в одном двоичном векторе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Искусственные генные мужские стерильные мутанты традиционно генерируются случайным физическим, химическим или биологическим мутагенезом. Хотя это мощные методы, их случайный характер не может извлечь выгоду из огромного количества современных геномных знаний, которые имеют потенциал для доставки индивидуальных улучшений в молекулярномразведении 32. Система CRISPR-Cas9 широко используется в растениях благодаря простым и доступным средствам для управления и редактированияДНК 29

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить Xiaofei Чэнь для предоставления молодых соцветий риса и помощь в создании рисовой ткани культуры среды. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31900611).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-Нафталиноуксусная кислотаSigma-AldrichN0640
2, 4-дихлорфеноксиуксусная кислотаSigma-AldrichD7299
6-Бензиламинопурин (6-БА)Sigma-AldrichB3408
АцетосирингонSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Сульфат аммонияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Анеурин гидрохлоридSigma-AldrichT4625
Безводный этанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Бактериологический пептонSangon BiotechA100636
Экстракт говядиныSangon BiotechA600114
Борная кислотаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Дигидрат хлорида кальцияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Гидролизат казеиновой кислотыBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Гексагидрат хлорида кобальта (II)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Пентагидрат сульфата меди (II)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-глюкоза безводнаяSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-сорбитSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
ЭДТА, динатриевая соль, дигидратSigma-AldrichE5134
EOS цифровая зеркальная фотокамера и компактные системные камерыCanonEOS 700D
ФормальдегидSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
полностью автоматизированный ротационный микротомLeica BiosystemsLeica RM 2265
Ледяная уксусная кислотаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
глицинSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
гигромицинBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
ИнозитолСинофарм Химический реагент Ко., Лтд63007738
ЙодСинофарм Химический реагент Ко., Лтд10011517
Сульфат железа (II) гептагидратСинофарм Химический реагент Ко., Лтд10012116
КанамицинПекин XMJ Scientific Co., LtdK378
КинетинСигма-ОлдричK0753
L-аргининSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-аспарагиновая кислотаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-глютаминBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-пролинBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
сульфат магния гептагидратSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Моногидрат сульфата марганцаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
МикроскопыNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Никотиновая кислотаSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Хлорид калияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Дигидрофосфат калияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Йодид калияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Нитрат калияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Пиридоксина гидрохлорид (B6)Sigma-Aldrich47862
РифампицинBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Гидроксид натрияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Дигидрат молибдата натрияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
СтереомикроскопыLeica MicrosystemsLeica M205 A
СахарозаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Наборы для встраивания Technovit 7100Heraeus Teknovi, Германия14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Водяная баня для парафиновых секцийLeica BiosystemsLeica HI1210
Дрожжевой экстрактSangon BiotechA515245
гептагидрат сульфата цинкаSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

Ссылки

  1. FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
  2. FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
  3. Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
  4. Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
  5. Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
  6. Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
  7. Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
  8. Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782(2020).
  9. Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473(2013).
  10. Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
  11. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  12. Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
  13. Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824(2008).
  14. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
  15. Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
  16. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796(2006).
  17. Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
  18. Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
  19. Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
  20. Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
  21. Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
  22. Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
  23. Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49(2011).
  24. Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
  25. Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
  26. Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
  27. Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415(2016).
  28. Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
  29. Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
  30. Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  31. Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
  32. Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39(2013).
  33. Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

AgrobacteriumCRISPR Cas9OsABCG15
Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.