Методическая статья

Изоляция murine сперматогенных клеток с помощью фиолетово-возбужденных клеток проницаемых ДНК Связывание красителя

DOI:

10.3791/61666

⸱

14 января 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 3Division of Germ Cell Biology, National Institute for Basic Biology, National Institutes of Natural Sciences, 4Department of Basic Biology, School of Life Science, Graduate University for Advanced Studies (Sokendai), 5Department of Animal Science and Biotechnology, School of Veterinary Medicine, Azabu University, 6Faculty of Science and Technology, Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем простой и эффективный метод изоляции живых мейотических и постмейотических зародышевых клеток от взрослых мышей. Используя низкоцитотоксичность, фиолетовый возбужденный краситель связывания ДНК и флуоресценцию активированной сортировки клеток, можно изолировать высокообогащеные популяции сперматозоидов для многих нисходящих приложений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе мейоза и сперматогенеза. Хотя существуют установленные протоколы изоляции клеток с использованием Hoechst 33342 окрашивания в сочетании с флуоресценции активированной сортировки клеток, он требует сортировки клеток оснащен ультрафиолетовым лазером. Здесь мы описываем протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV), низкого цитотоксичности ДНК связывания красителя структурно похож на Hoechst 33342. DCV может быть возбужден как ультрафиолетовых, так и фиолетовых лазеров, что повышает гибкость выбора оборудования, в том числе сортера клеток, не оснащенных ультрафиолетовым лазером. Используя этот протокол, можно изолировать три живых клеток субпопуляции в мейотической профазы I, в том числе лептотен / зиготен, пахитен, и диплотен сперматоцитов, а также пост-мейотических круглых сперматозоидов. Мы также описываем протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей-тестов. В целом, процедура требует короткого времени для завершения (4-5 часов в зависимости от количества необходимых ячеек), что облегчает многие приложения вниз по течению.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сперматогенез является сложным процессом, в котором небольшая популяция сперматозоидов стволовых клеток поддерживать непрерывное производство большого количества спермы на протяжениивсей взрослой жизни 1,2. Во время сперматогенеза, динамическая хроматин ремоделирование происходит, когда сперматозоидные клетки проходят мейоз для производства гаплоидныхсперматозоидов 3,4,5. Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для молекулярного исследования, и несколько различных подходов к изоляции меиотических сперматозоидов были созданы, в том числеосадочных основе разделения 6,7 и флуоресценции активированныхклеток сортировки(FACS) 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Однако эти методы имеют технические ограничения. В то время как разделение на основе осадочных пород даетбольшое количество клеток 5,6,7,это трудоемкий. Установленный facS-основанный метод использует Hoechst 33342 (Ho342) для того чтобы отделить meiotic сперматиноциты основанные на содержании ДНАА и светлых scattering свойствах и требует сортеров клетки FACS оборудованных с ультрафиолетовым (УФ)лазером 8,9,10,11. Альтернативные методы на основе FACS требуют трансгенных линий мыши, которые выражают флуоресцентныебелки, синхронизация сперматогенеза 12, или фиксации клеток и маркировки антител, что не совместимо с изоляцией живыхклеток 13. Хотя есть еще один альтернативный метод с использованием клеток проницаемой ДНК связывания красителя, DyeCycle Зеленыйпятно 14,15,16,17, этот метод рекомендуется для изоляции сперматозоидных клеток от несовершеннолетних яичка. Таким образом, существует критическая необходимость разработки простого и надежного метода изоляции живых мейотических сперматозоидов, которые могут быть применены к любому штамму мыши любого возраста и которые могут быть выполнены с помощью любого сортера клеток FACS.

Здесь мы описываем такой давно испрашиваемый протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV). DCV является низкой цитотоксичности, клеток проницаемой ДНК связывания красителя структурно похож на Ho342, но с возбуждением спектра смещается в сторону фиолетовогодиапазона 18. Кроме того, DCV имеет более широкий спектр выбросов по сравнению с DCG. Таким образом, он может быть возбужден как УФ, так и фиолетовые лазеры, что повышает гибкость оборудования, что позволяет использовать сортер клеток FACS, не оборудованный УФ-лазером. Протокол DCV, представленный здесь, использует двумерное разделение с dcV синим и DCV красным, имитируя преимущество протокола Ho342. С этим преимуществом, наш протокол DCV позволяет нам изолировать высокообогащеные зародышевые клетки от взрослого яичка. Мы предоставляем подробный протокол закрытости, чтобы изолировать живые сперматозоидные клетки от взрослых мышей яички одной мыши (из двух яище). Мы также описываем эффективный и быстрый протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей испытаний, которые могут быть использованы для этой изоляции клеток. Процедура требует короткого времени (подготовка одноклеточной суспензии - 1 час, окрашивания красителя - 30 мин, а сортировки клеток - 2-3 часа: всего - 4-5 часов в зависимости от количества необходимых клеток; Рисунок 1). После изоляции ячеек может быть завершен широкий спектр приложений ниже по течению, включая РНК-сек, ATAC-seq, ChIP-seq и культуру клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол соответствует руководящим принципам Институционального комитета по уходу за животными и использованию (протокол No. IACUC2018-0040) в медицинском центре детской больницы Цинциннати.

1. Установка оборудования и реагентов для подготовки подвески яичек

  1. Подготовье каждого ферментного запаса в 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) и храните при -20 градусах по Цельсию (Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьтесь в любое время перед экспериментом.
  2. За день до эксперимента: Пальто, собирающих трубки (1,5 мл трубок) с сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) при 4 градусах цельсия за ночь.
  3. В день эксперимента: Установите водяную баню до 37 градусов по Цельсию.
  4. Предварительно теплый Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) при 37 градусов по Цельсию и подготовить 2 мл 1x диссоциации буфера для каждого образца прямо перед использованием (Таблица 1) в 15 мл центрифуги трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2 mL диссоциации буфер подготовлен для двух испытаний. Для рецепта буфера диссоциации, пожалуйста, обратитесь к таблице 1.

2. Вскрытие животных и подготовка суспензии яичек

  1. Пожертвуй 8-недельной мышонок, оставив в камере двуокиси углерода, по крайней мере 10 мин.
  2. Удалите оба яичка и поместите на 60 мм чашку Петри, содержащую 2 мл ледяного фосфатно-буферного солевого раствора (PBS).
  3. Удалите туника альбугинеа из яивок. Слегка рассейте семенные трубочки, аккуратно отделив их типсами.
  4. Перенесите семенные трубочки в чашку Петри диаметром 100 мм с новой каплей ледяного PBS и аккуратно распутайте семенные трубочки с типсами. Повторите эту стирку 3 раза, чтобы удалить интерстициальные клетки как можно больше.
  5. Инкубировать распутанные семенные трубочки в трубке 15 мл, содержащей 2 мл буфера диссоциации при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
  6. Аккуратно пипетки трубочные трубы 20 раз с помощью микропипюты 1000 йл.
  7. Инкубировать в течение 6 минут. Повторите нежный пипетки 20 раз.
  8. Инкубировать в течение 3 минут. Повторите нежный пипетки 10 раз, пока не останется видимых кусков.
  9. Добавьте 10 мл буфера FACS к подвеске. Центрифуга при температуре 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
  10. Повторите шаг 2.9 дважды, чтобы удалить сперматозоиды и как можно больше мусора, как это возможно.

3. Окрашивание клеток

  1. Переусердуйте гранулы клетки с 3 мл буфера FACS(таблица 1) и фильтровать подвеску клетки через 70 мкм нейлоновых клеток ситечко в 50 мл трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход клеток составляет около 100 миллионов клеток на два яичка (от 8-недельной мыши дикого типа B6).
  2. Подсчитайте количество клеток и разделите 10% клеток на новую трубку, как необлитробленное отрицательное управление и оставьте на льду.
  3. Добавьте 6 МКЛ пятна DCV (первоначальная концентрация 5 мМ) к оставшейся клеточной подвеске и хорошо перемешайте. Окончательная концентрация составляет 10 МКМ, а емкость составляет около 100 миллионов клеток.
  4. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут в темноте. Аккуратно встряхните подвеску клетки каждые 10 минут.
  5. После инкубации, без шага мытья, непосредственно добавьте 5 л DNase I (концентрация запасов составляет 10 мг/мл) к клеточной подвеске и проинфильтруйте клетки в трубку 5 мл FACS через 35 мкм нейлоновой сетки крышки. Держите образцы на льду до сортировки.

4. Цитометрия потока и экспериментальные ворота

  1. Подготовь сортер ячейки FACS. Убедитесь, что сортер клеток FACS оснащен оптикой Возбуждения: фиолетовый (405-нм) лазер; Оптика обнаружения: комбинация фильтра 450/50 bandpass (тот же набор фильтров 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для DCV-голубого обнаружения) и 665/30 bandpass (тот же набор фильтров Allophycocyanin (APC) для dcV-красного обнаружения. Здесь мы используем Sony SH800S сортировки клеток в качестве примера.
  2. Создайте новый эксперимент и навейте следующие рабочие участки, отображающие параметры, которые будут оптимизированы: Нажмите "Новаяплотность " на " Рабочий листИнструменты" меню бар для создания вперед рассеяния - область (FSC-A) против задней рассеяния - область (BSC-A) плотность участка в линейном масштабе. Нажмите« New Histogram», чтобы создать сюжет DCV-голубой гистограммы в логаритмическом масштабе.
  3. Кратко вихрь необлитого отрицательного контроля (от шага 3.2) и загрузить образец.
  4. Нажмите "Start" и "Record ",чтобы начать обработку незапачканного образца. В то время как образец работает, нажмите "Детектор и Порог Настройки" для оптимизации FSC и BSC напряжения путем корректировки как photomultiplier трубки (PMT) напряжения вверх или вниз, чтобы разместить незапачканные клетки в масштабе участка FSC / BSC.
  5. Отрегулируйте напряжение PMT вверх и вниз на "FL1: DAPI", в то время как образец работает, чтобы найти положение DCV-отрицательной популяции в первом десятилетии DCV-голубой гистограммы логаритмического участка (Рисунок 2A). После завершения регулировки напряжения PMT нажмите кнопку«Стоп», чтобывыгрузить необитый образец.
  6. Кратко вихрь образца (от шага 3.5) и загрузить образец.
  7. Нажмите" Следующаятрубка ", чтобы создать новый лист для DCV-окрашенных образца; и нажмитекнопку"Старт"и "Запись",чтобы приобрести dcV-окрашенный образец, запись ≥ 1 х 106 событий. Добавьте следующие рабочие графики: Нажмите «Новая плотность»на меню«Инструментылиста», чтобы создать участок плотности FSC-H (высота) против FSC-W (ширина) в линейном масштабе; Нажмите" Новая плотность", чтобы создать DCV-синий против DCV-красный участок плотности на линейном масштабе. После записи ≥ 1 х 106 событий, нажмите кнопку"Стоп"и разгрузите образец.
  8. На участке плотности FSC-A vs. BSC-A щелкните «Polygon»на меню«Plot Tools»,чтобы нарисовать большие ворота «Cells», чтобы включить большинство ячеек и исключить мелкий мусор(рисунок 2B). Применить ворота "Клетки" на FSC-H против FSC-W плотности участка. Нажмите« Rectangle», чтобы нарисовать ворота«Одиночных ячеек»,чтобы исключить не одиночные ячейки(рисунок 2C).
  9. Применить "Одиночные клетки" ворота DCV-синий против DCV-красной плотности участка и настроить шкалу, чтобы захватить расширенный профиль, как показано на рисунке 2D. Нажмите" Polygon" на "Участок Инструменты" меню бар, чтобы нарисовать "DCV" ворота, чтобы исключить незапачканные клетки и боковой населения (Рисунок 2D).
  10. Применить "DCV" ворота DCV-голубой сюжет гистограммы в линейном масштабе. Три основных пика относятся к различному содержанию ДНК: 1C, 2C и 4C(рисунок 2E).
  11. Нажмите «Новая Плотность», чтобы создать DCV-синий против DCV-красный участок плотности в линейном масштабе и применить »DCV» ворота для выполнения обратно gating от рисунка 2E, чтобы найти 1C и 4C населения (Рисунок 2F). Нажмите" Ellipse", чтобы нарисовать ворота на 1C населения, который находится в сжатой области (ворота 1C). Нажмите" Polygon", чтобы нарисовать ворота на 4C населения, которое является непрерывной кривой (ворота 4C).
  12. Нажмите"Новая плотность",чтобы создать DCV-синий против DCV-красный участок плотности в линейном масштабе и применить "4C" ворота; отрегулируйте шкалу, чтобы увеличить инажмите кнопку"Полигон", чтобы нарисовать ворота "4C_1" для более точного выбора(рисунок 2G).
  13. Нажмите"Новая плотность",чтобы создать новый участок плотности FSC-A против BSC-A в линейном масштабе и применить "4C_1" ворота; будет три обогащенные популяции, разделенные по размеру, соответствующему лептотену (L) /зиготену (яп.), пахитене (P) и диплотену (D) сперматозоидам. Нажмите"Полигон"или"Эллипс",чтобы нарисовать 3 ворота: "L / З", "P", и "D" на основе растущего размера(рисунок 2H).
  14. Нажмите "New Dot Plot", чтобы создать DCV-синий против DCV-красный цвет точка участок на линейной шкале, чтобы применить ворота и обеспечить три популяции находятся в непрерывном порядке в "4C_1" ворота (Рисунок 2I).
  15. Аналогичным образом, для населения 1С нажмите кнопку"Новаяплотность", чтобы создать новый участок плотности FSC-A против BSC-A в линейном масштабе и применить ворота "1С", выберите единый размер ячеек как чисто круглую сперматозоидовую популяцию,и нажмите кнопку "Эллипс",чтобы нарисовать ворота"RS"(рисунок 2J).

5. Сортировать мужские субпопуляции зародышевых клеток

  1. Подготовь 1,5 мл трубок, содержащих 500 йл 50% FBS для сбора клеток и загрузить трубку сбора в коллектор и нажмите "Нагрузка Коллекция".
  2. Нажмите" Next Tube","Старт","Запись"и "Сортировать Начало". Для использования двухй способной системы, которая позволяет двум популяциям, представляющим интерес, быть отсортированы в то же время в устройство сбора, следуйте парным комбинациям: лептотен (L) /зиготен (я) и пахитен (P) сперматозоиды на основе L / Я и P задние ворота; Круглые сперматозоиды (RS) и диплотен (D) сперматозоиды на основе RS и D задних ворот.
  3. Пока выборка работает, отрегулируйте скорость потока до 3000 евро, чтобы получить наиболее эффективную сортировку.

6. Анализ чистоты отсортированных клеток

  1. Соберите ≥ 10 000 ячеек населения. Выполните клеточный иммуностепенинг, чтобы подтвердить подступень.
  2. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и тщательно отбросить супернатант, сохраняя около 110 МКЛ жидкости в нижней части трубки.
  3. Возьмите 10 йл капли клеточной подвески, чтобы наблюдать под микроскопом и оценить обзор морфологии клеток и число.
  4. Нанесите 100 МКЛ клеточной подвески на каждый из слайдов камеры образца (см. Таблицу материалов)и загрузите камеры на Цитоспина.
  5. Спин образцов на 30 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Нарисуйте круг вокруг клетки гидрофобной ручкой. Сухие слайды на лабораторной скамейке в течение нескольких минут при комнатной температуре.
  6. Падение 50 йл PBS в круг слайда и нажмите.
  7. Добавить первичный раствор антитела (Разбавить первичные антитела с 5% ослиной сыворотки в PBS с 0,02% полисорбата 20) в круг слайда и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в одночасье.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы судить substage meiotic spermatocytes, SYCP3 было обнаружено, которое будет маркером топоров meiotic хромосомы, и qH2AX, который будет маркером реакции повреждения дна. (Для концентрации антител, пожалуйста, обратитесь к таблице материалов).
  8. Нажмите на основной раствор антитела со слайдов.
  9. Падение 50 йл PBS в круг слайда и нажмите. Повторите один раз.
  10. Добавить вторичный раствор антитела (разбавить вторичные антитела в PBS с 0,02% полисорбат 20) в круг слайда и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте.
  11. Падение 50 йл PBS в круг слайда и нажмите. Повторите один раз.
  12. Добавьте 50 МКЛ DAPI (концентрация запасов составляет 0,1 мкг/мл) пятно в течение 5 мин и нажмите.
  13. Добавьте 1-2 капли монтажа мультимедиа на слайды. Тщательно накройте монтажные средства с крышкой стекла и осторожно нажмите на крышку стекла, чтобы удалить дополнительные монтажные средства массовой информации и пузырь воздуха. Слайды готовы к оценке микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативный результат этого протокола сортировки показан на рисунке 3. Общее время сортировки двух яищей (одна мышь) обычно составляет около 3 часов, что зависит от концентрации клеточной подвески и скорости сортировки. После сортировки чистота сперматозоидов подтверждается иммуностимуляторами SYCP3 и NO2AX(рисунок 3A). Репрезентативная чистота отсортированных фракций L/Q, P, D сперматозоидов составляет около 80,4%, 90,6% и 87,6% соответственно

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем практический и простой протокол для изоляции субпопуляций сперматозоидов и сперматозоидов от одного взрослого самца мыши. Для обеспечения воспроизводимости этого протокола необходимо принять некоторые важные меры. Перед перевариванием ферментов, мыть шаг направлен на удаление интерстициальных клеток; после пищеварения, этот шаг помогает удалить сперматозоиды и мусор. Мытье/ центрифугирование 3 раза имеет важное значение. В нашем рецепте буфера диссоциации, сочетание нескольких различных ферментов об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников лабораторий Намекава, Есида и Маэдзава за помощь; Кэти Герхардт для редактирования рукописи; Мэри Энн Гендель для обмена H1T антитела, Цинциннати Детская больница медицинский центр (CCHMC) Научно-исследовательский поток цитометрии ядро для обмена оборудование FACS при поддержке NIH S10OD023410; Грант-в-помощи для научных исследований (KAKENHI; 17K07424) к T.N.; Постдокторантство Фонда Лалора А.С.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) до S.Y.; грант исследовательского проекта, предоставленный Отделом исследовательских услуг Университета Азабу, Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) - поддерживаемая программа проекта по брендингу частных университетов (2016-2019), Грант-в-помощи для научно-исследовательской деятельности Start-up (19K21196), Научный фонд Такеды (2019), и Uehara Memorial Foundation Research Incentive Грант (2018) для S.M.; Национальный институт здравоохранения R01 GM122776 до S.H.N.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл тубаWatson131-7155C
100 мм чашка ПетриCorning, Falcon351029
15 мл центрифугаWatson1332-015S
мл полистирольная туба с клеточным фильтром защелкивающаяся крышка (35 & микро; m нейлоновая сетка)Corning, Falcon352235
50 мл Центрифужная трубкаWatson1342-050S
60 мм чашка ПетриCorning, Falcon351007
70 &; м нейлоновая сеткаCorning, Falcon352350
Сортировщик клетокSonySH800S
Центрифуга
Коллагеназа, рекомбинантная, не имеющая животного происхожденияFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-23141
Коллагеназа, тип 1WorthingtonLS004196
Защитное стеклоFisher12-544-G
Cytospin 3Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, дигидрохлоридFisherD1306: 0,1 μ г/мл
Dnase ISigmaD5025-150KU
Сыворотка ослякаSigmaS30-M
Dulbecco' Фосфатно-солевой буфер (DPBS)Gibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885076
фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco16000044
гистоновые антитела H1tв подарок от Мэри Энн Гендель1/2000 разбавленные
Hank' s сбалансированный солевой раствор (HBSS)Gibco14175095
гиалуронидазу из бычьих яичекSigmaH3506-1G
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)SigmaP5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade MountantFisherP36930
rH2AX антителоMillipore05-635рабочая концентрация: 2 мкм; г/мл
Белок оплодотворения сперматозоидов 56 (Sp56) антителоQED Bioscience55101рабочая концентрация: 0,5 мкм; г/мл
Стерилизованные щипцы и ножницы
Superfrost /Plus Предметные стекла для микроскопаFisher12-550-15
Антитело SYCP3Abcamab205846рабочая концентрация: 5 мкм; г/мл
TWEEN 20 (Полисорбат 20)SigmaP9416
Vybrant DyeCycle Фиолетовое окрашивание (DCV)InvitrogenV35003
Водяная баня
5 )Рабочая концентрация

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
  2. Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186(2020).
  3. Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
  4. Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125(2018).
  5. Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
  6. Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
  7. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648(2013).
  8. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
  9. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
  10. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602(2011).
  11. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
  12. Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
  13. Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821(2019).
  14. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
  15. da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294(2016).
  16. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  17. Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
  18. Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
  19. Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
  20. Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  21. Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  22. Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81(2016).
  23. Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40(2013).
  24. Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
  25. Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
  26. Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233(2018).
  27. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DyeCycle Violet

Похожие статьи