Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка адипозы Клетки-предшественники из мыши Эпидидимальные жировые ткани

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61694

⸱

25 августа 2020 г.

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем простой метод, чтобы изолировать весьма жизнеспособные клетки-предшественники жировой клетки из мыши эпидидимальных жировых подушечек с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток.

Аннотация

Ожирение и нарушения обмена веществ, такие как диабет, болезни сердца и рак, все связаны с драматическим жировой ткани ремоделирования. Ткань-резидент жировой клетки-предшественники (АПК) играют ключевую роль в жировой ткани гомеостаза и может способствовать патологии тканей. Растущее использование технологий анализа одноклеточных клеток, включая одноклеточное РНК-секвенирование и одноклеточную протеомику, преобразует поле стволовых/прагениторных клеток, позволяя беспрецедентное разрешение отдельных изменений экспрессии клеток в контексте демографических или тканевых изменений. В этой статье мы предоставляем подробные протоколы для вскрытия эпидидимальной жировой ткани мыши, изолируем одиночные клетки, полученные из жировой ткани, и выполняем флуоресценцию активированной клеточной сортировки (FACS) для обогащения для жизнеспособногоSca1/CD31-/CD45-/Ter119- БТР. Эти протоколы позволят следователям подготовить высококачественные БТР, пригодные для анализа ниже по течению, такие как секвенирование одноклеточной РНК.

Введение

Жировая ткань играет ключевую роль в энергетическом метаболизме. Избыток энергии хранится в виде липидов, а жировая ткань способна значительно расшириться или опровержения в зависимости от питательного статуса и энергетического спроса. Расширение жировой ткани может быть результатом увеличения размера адипоцитов (гипертрофия) и/или увеличения числа адипоцитов (гиперплазия); последний процесс жестко регулируется пролиферацию и дифференциацию жировых клеток-предшественников1,2. Во время ожирения жировая ткань чрезмерно расширяется, а дисфункция тканей, включая гипоксию, воспаление и резистентность кинсулину, часто развивается 3,4. Эти осложнения являются факторами риска многих хронических заболеваний, включая гипертонию, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, инсульт ирак 5. Таким образом, ограничение неконтролируемого расширения жировой ткани и смягчение патологий жировой ткани являются главными приоритетами биомедицинских исследований. Во время расширения жировой ткани, резидентов жировой ткани полученных стволовых клеток (ASCs) размножаются и дифференцировать последовательно в preadipocytes (совершенные клетки-предшественники), а затем в зрелые адипоциты6. Недавние одноклеточные РНК-секвенирования (scRNA-seq) исследованияпоказывают,что эти жировые клетки-предшественники (APC) популяций (ASCs и preadipocytes) обладают существенной молекулярнойи функциональной неоднородностью 7,8,9,10,11,12. Например, ASCs отображают уменьшенную адипогенную способность дифференциации, в то же время показывая более высокие возможности распространения и расширения, по сравнению с предадипоцитами7. Дальнейшие молекулярные различия сообщаются в популяциях ASC и preadipocyte, хотя функциональная актуальность этих различий остается неясной7. Вместе эти данные подчеркивают сложность жирового пула клеток-предшественников и подчеркивают необходимость разработки и стандартизации инструментов для лучшего понимания и управления этими критическими популяциями клеток.

В этом протоколе подробно рассматривается изоляция высокой жизнеспособности Sca1- жировых популяций клеток-предшественников от эпидидимальных жировых прокладок мыши, которые подходят для чувствительных анализов ниже по течению, включая одноклеточные исследования (секвенирование секвенирования) и клеточной культуры. Изоляция и диссоциация эпидидимальных жировых прокладокбыла выполнена, как описано ранее 7,13 с небольшими изменениями, которые улучшают жизнеспособность изолированных БТР. Короче говоря, диссоциированные клетки от эпидидимальных жировых подушечек окрашены антителами против Sca1, маркером как дляASCs,так и дляпредадипоцитов 6,7и других маркеров линии (Lin): Ter119 (эритроидные клетки), CD31 (эндотелиальные клетки) и CD45 (лейкоциты). ЖизнеспособныйSca1/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- клетки затем сортируются по флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Важно отметить, что этот протокол был подтвержден успешной изоляции и анализа жизнеспособныхSca1/Lin - жировыеклетки-предшественники сообщили в недавнем исследовании секвенирования одноклеточной РНК, которые определили функционально неоднородных субпопуляций в ASCs и preadipocytes7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры для животных были проведены в соответствии с утверждением Комитета по институциональному уходу и использованию животных клиники Майо.

1. Подготовка решения

  1. Приготовьте коллагеназу 2% (w/v) раствор путем растворения коллагеназы II 2 г в сбалансированном соляном растворе 100 мл Hanks (HBSS). Aliquot 200 йл каждый для каждого использования.
  2. Подготовка среды нейтрализации путем смешивания 84 мл F-12 среды, 15 мл лошади сыворотки, и 1 мл пенициллина / стрептомицина.
  3. Подготовка потока цитометрии буфера путем растворения 500 мг бычьего альбумин сыворотки (BSA) и 400 йл 0,5 М ЭДТА в 100 мл фосфатно-буферного солевого раствора Дулбекко (DPBS).

2. Рассечение эпидидимальной жировой прокладки и диссоциации тканей

  1. Гуманно усыпляйте (изофлюран/вывих шейки матки) одного самца мыши. В этом протоколе использовалась четырехмесячная мышь FVB.
  2. Нанесите/распылите 70% этанола на живот и подвергните нижнюю брюшную полость с помощью чистых ножниц и типсов.
  3. Найдите эпидидимальные жировые прокладки (проксимальные/прикрепленные к яичкам). Держите соединение между яичками и эпидидимальной жировой площадкой с тупыми типсами и осторожно потяните, чтобы освободить эпидидимальный жир площадку.
  4. Удалить яички путем резки с помощью ножниц и инкубировать эпидидимальной жировой прокладки в 5 мл HBSS дополняется 3% BSA в 50 мл конической трубки при комнатной температуре в течение 15 мин.
  5. Центрифуга при 150 x g в течение 7 мин при 4 градусах Цельсия.
  6. Возьмите плавающий эпидидимальный жир площадку из 50 мл конической трубки и мелко фарш ткани с помощью чистых ножниц.
  7. Добавьте 200 МКЛ коллагеназы 2% раствор в 3,8 мл HBSS в 13 мл культуры трубки. Добавить рубленую ткань и инкубировать в вращающемся инкубаторе при 5 об/мин при 1 ч при 37 градусах Цельсия. Вместо вращающегося инкубатора, инкубатор культуры клеток при 37 градусов по Цельсию может быть альтернативно использован с случайными агитациями.
  8. Перенесите все содержимое в коническую трубку 50 мл и добавьте 10 мл среды нейтрализации. Смешайте осторожно, инвертирование трубки 2-3 раза.
  9. Подготовь еще 50 мл конической трубки, оснащенной 70 мкм клеточного ситечкой. Фильтр переваренной ткани в новую трубку с помощью клеточного ситечко.
  10. Перенесите поток через коническую трубку и центрифугу 15 мл при 350 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  11. Аккуратно удалите супернатант и повторно снимите клеточные гранулы с 5 мл DPBS. Центрифуга при 350 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  12. Аккуратно удалите супернатант и добавьте 50 МКЛ буфера цитометрии потока. Хорошо перемешать, мягко трубя и держать клетки на льду. Из-за объема клеточных гранул и небольшого количества остаточного супернатанта общий объем клеток в буфере цитометрии потока будет больше 50 МКЛ (примерно 100 МКЛ).

3. Маркировка антител и флуоресценция активированная сортировка клеток (FACS)

  1. После смешивания клеток хорошо с нежным пипетки, передача 54 йл клеточной подвески в 1,7 мл микроцентрифуг трубки. Добавьте 6 йл блокирующего реагента FcR и хорошо перемешайте с помощью пипетки. Инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Сохранить любые оставшиеся клетки после принятия 54 йл и держать их во льду, чтобы использовать в качестве незапачканного контроля в шаге 3,5 и шаг 3,6.
  2. Во время инкубации в шаге 3.1, подготовить антитела коктейль путем объединения 11 йл каждый из анти-Sca1-APC, анти-Ter119-FITC, анти-CD31-FITC, и анти-CD45-FITC антител в микроцентрифуг трубки. Хорошо смешайте с помощью нежной трубы и держите на льду защищены от света.
  3. После инкубации с реагентом FcR блокирующий в течение 10 минут, добавить 40 йл антитела коктейль и хорошо перемешать нежным пипетки. Инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
  4. Добавьте в окрашенные клетки 500 МКЛ буфера цитометрии потока, дополненного 1 мкг/мл DAPI. Хорошо смешайте с помощью нежной пипетки и фильтровать клетки с помощью пробирки 5 мл с крышкой оснастки ситечком клеток. Храните клетки на льду.
  5. Добавьте 500 МКЛ буфера цитометрии потока к оставшимся клеткам в шаге 3.1 и хорошо перемешайте с помощью нежной трубы. Фильтр клетки с помощью 5 мл пробирки с клеткой ситечко оснастки крышкой. Держите эти клетки на льду и использовать в качестве незапачканного контроля на следующем этапе.
  6. Возьмите окрашенные клетки и незапачканный контроль для анализа FACS или сортировки инструмента.
    1. Определить и изолировать БТР /FITC- /DAPI -населениес gating стратегии показано на рисунке 1. Эти клетки представляют собойжизнеспособныеSca1 /Ter119-/CD31-/CD45- клетки. Мусор и агрегаты ячеек истощаются с помощью участков вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Затем, DAPI- население закрыто, а затем gating БТР/FITC- население. Незапачканные элементы управления должны использоваться для оказания помощи в установлении параметров закрытости.
    2. Соберите клетки в 500 МКЛ цитометрии буфера потока в 1,5 мл микроцентрифуг трубки. Двигаясь вперед, все процедуры должны выполняться в стерильных условиях, чтобы свести к минимуму загрязнение. Приблизительно 50 000 – 100 000 ячеек собираются с одной мыши.
  7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра для оценки жизнеспособности клеток. Поскольку агрегаты ячеек могут препятствовать дальнейшему анализу ниже по течению, также оценивается наличие агрегатов клеток для обеспечения минимального присутствия (lt;5% от жизнеспособного числа клеток) этих агрегатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом эксперименте использовались четырехмесячные самцы FVB-мышей. После исключения мусора и дублетов с использованием участков FSC/SSC, жизнеспособные ячейки (DAPI- население) были закрыты, а затемвыборБТР /FITC- население(рисунок 1). Ворота DAPI, APC и FITC были нарисованы на основе незапачканного контроля. Стратегии Гэтинга показаны на рисунке 1.

После 1 ч сортировки, качество изоляции было количес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Одноклеточное секвенирование РНК (scRNA-seq) быстро набирает обороты в качестве мощного инструмента для одновременного изучения различных популяций клеток на уровне одной клетки. Из-за высоких затрат, связанных с подготовкой образца и высокой пропускной способностью секвенирования, крайне важно оптимизировать клеточные входы (высокая жизнеспособность и чистота), чтобы увеличить вероятность экспериментального успеха. Некоторые протоколы подготовки клеток опираются на удаление мертвых клеток и мусора с помощью низкого спин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы признаем, клиники Майо микроскопии клеточного анализа основного потока цитометрии фонда за помощь в сортировке FACS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,7 мл микроцентрифужная пробиркаVWR87003-294
13 мл культуральная пробиркаThermo Fisher Scientific50-809-216
15 мл коническая пробиркаGreiner Bio-one188 271
5 мл пробирка с клеточным фильтром защелкивающаяся крышкаThermo Fisher Scientific08-771-23
50 мл коническая пробиркаGreiner Bio-one227 261
70 &микро; m клеточный фильтрThermo Fisher Scientific22-363-548
Антитело Anti-CD31-FITCMiltenyi Biotec130-102-519
Антитело Anti-CD45-FITCMiltenyi Biotec130-102-491
Антитело Anti-Sca1-APCMiltenyi Biotec130-102-833
Антитело Anti-Ter119-FITCMiltenyi Biotec130-112-908
BSAGold BiotechnologyA-420-500
Коллагеназа типа IIThermo Fisher Scientific17101-015
DAPIThermo FisherD1306
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-144
F-12 среднийThermo Fisher Scientific11765-054
Блокирующий реагент FcRMiltenyi Biotec130-092-575
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025-092
Лошадиная сывороткаThermo Fisher Scientific16050-122
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140-122
Раствор йодида пропидиумаMiltenyi BiotecТел.: 130-093-233

Ссылки

  1. Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
  2. Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
  4. Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
  5. Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
  6. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
  7. Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).
  8. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
  9. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636(2018).
  10. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501(2019).
  11. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
  12. Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
  13. De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
  14. Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219(2020).
  15. Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057(2018).
  16. Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
  17. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  18. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Подготовка адипозы Клетки-предшественники из мыши Эпидидимальные жировые ткани
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.