Методическая статья

Постепенные изменения температуры для максимального размножения и нереста у Astyanax mexicanus

DOI:

10.3791/61708

⸱

14 февраля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье изложены основные лабораторные условия и протоколы для инкрементального температурного режима для стимуляции максимального нереста у мексиканской тетра Astyanax mexicanus,которая является формирующейся моделью для исследований развития и эволюции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мексиканская тетра, Astyanax mexicanus,является формирующейся модельной системой для исследований в области развития и эволюции. Существование глазных поверхностных (поверхностных рыб) и слепых пещерных (пещерных рыб) морфов у этого вида дает возможность исследовать механизмы, лежащие в основе морфологической и поведенческой эволюции. Пещерные рыбы развили новые конструктивные и регрессивные черты. Конструктивные изменения включают увеличение вкусовых рецепторов и челюстей, органов чувств боковой линии и жира в организме. Регрессивные изменения включают потерю или уменьшение глаз. пигментация меланина, школьное поведение, агрессия и сон. Чтобы экспериментально исследовать эти изменения, крайне важно получить большое количество порожденных эмбрионов. С тех пор, как оригинальные поверхностные рыбы A. mexicanus и пещерные рыбы были собраны в Техасе и Мексике в 1990-х годах, их потомков регулярно стимулировали к размножению и нересту большого количества эмбрионов два раза в год в лаборатории Джеффри. Хотя размножение контролируется изобилием и качеством пищи, светло-темными циклами и температурой, мы обнаружили, что постепенные изменения температуры играют ключевую роль в стимулировании максимального нереста. Постепенное повышение температуры с 72 ° F до 78 ° F в первые три дня недели размножения обеспечивает два-три последовательных нерестовых дня с максимальным количеством высококачественных эмбрионов, за которым следует постепенное снижение температуры с 78 ° F до 72 ° F в течение последних трех дней нерестовой недели. Процедуры, показанные в этом видео, описывают рабочий процесс до и во время недели лабораторной селекции для стимуляции нереста с добавочной температурой.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Телеост Astyanax mexicanus имеет глазкую поверхностно-обитую (поверхностную рыбу) форму и множество различных слепых пещерных (пещерных рыб) форм1,2. Пещерные рыбы эволюционировали в вечной темноте и под ограничениями пищи, что привело к появлению новых конструктивных и регрессивных черт3. Конструктивные черты включают увеличение вкусовых рецепторов и размера челюсти, органов чувств боковой линии и жировых запасов. Регрессивные черты включают потерю или уменьшение пигментации меланина, глаз и поведения, таких как сон, школьное образование и агрессия. Атрибутом системы Astyanax является полная фертильность между двумя формами, позволяющая использовать количественное отображение локусов признаков (QTL) для определения геномной области (областей), связанной с конструктивной и регрессивной эволюцией4,5,6,7. A. mexicanus предлагает выгодную систему для изучения развития, потому что его можно заставить часто нереститься в лаборатории. Эмбрионы A. mexicanus полупрозрачные, немного крупнее, чем у рыбок данио, производятся в больших количествах и развиваются в половозрелых взрослых особей примерно через 8-12 месяцев. Их период максимальной нерестоспособности составляет около 5 лет. Этот протокол описывает рабочий процесс, необходимый на объекте культивирования A. mexicanus в течение типичной недели размножения, и включает в себя детали обслуживания рыбной системы и режима контроля температуры для максимального нереста.

A. mexicanus - тропическая рыба, которая живет в реках, берущих начало на известняковых плато (поверхностные рыбы) и в бассейнах в известняковых пещерах (пещерные рыбы)8. Известняк растворяется, производя жесткую воду, и A. mexicanus процветает в жесткой воде. Рыбы, адаптированные к условиям жесткой воды, могут переносить целый ряд соленых условий, но обычно размножаются в конкретных9. Индукция нерестового поведения осуществляется сочетанием факторов. Поскольку рыбы хладнокровны и полагаются на окружающую среду для поддержания гомеостаза, их метаболизм чувствителен к изменениям окружающей среды, и они быстрее реагируют на стрессоры10. A. mexicanus следует культивируем в водных системах в тщательно регулируемых условиях потока воды, рН, проводимости, осмотического давления, освещения и температуры воды.

В лаборатории Джеффри рыбы поддерживаются в двух системах проточной воды: (1) «детская система» для молодых взрослых рыб до половой зрелости и (2) взрослая (или основная) система для половозрелых, размножающихся взрослых особей. «Детская система» состоит из резервуаров на 8 л и 15 л, снабженных проточной водой. «Детская система» засеивается мальками и молодыми метаморфизованными молодыми особями, выращенными из личинок в меньших (1-10 л) резервуарах, в которых еженедельно обменивается водой. Личинки, мальки и молодь чрезвычайно зависят от пищи и должны питаться живым кормом (солеными креветками) один раз в день, чтобы обеспечить высокий уровень выживаемости. Молодых особей из «детской системы» помещают во взрослую систему примерно через 1-1,5 года. Сначала их кормят измельченными тетрахлопьями, а после дальнейшего роста переводят в обычный режим кормления взрослых особей. Половую зрелость можно оценить по объему живота у самок, а методы определения пола были описаны11. Во взрослой системе вода автоматически обменивается в резервуарах по 42 л 3 раза за 24-часовой период. Система для взрослых ежедневно контролируется визуальным осмотром и автоматическими показаниями температуры, рН и проводимости с помощью датчиков. Оптимальный pH составляет около 7,4 и может варьироваться между 6,8-7,5, базовая температура системы составляет 72/73 ° F, а идеальная проводимость колеблется между 600-800 мС. Автоматические показания отображаются на экране контроллера, а визуальные проверки давления воды считываются на расходомерах, распределенных по всей системе. Независимые проверки качества воды проводятся еженедельно путем тестирования температуры и измерения параметров качества воды для pH, аммиака и нитрата с использованием колориметрического теста. Уровни аммиака и нитратов удерживаются на уровне или близко к нулю путем добавления полезных бактерий (например, цикла нутафинов) в систему. Освещение помещения управляется таймером, настроенным на 14-часовой световой и 10-часовой темные периоды. В дополнение к общим параметрам качества воды, упомянутым выше, следующие соображения требуют особого внимания в течение недели размножения.

Первым соображением является фотопериод, так как рыбы (даже пещерные рыбы в лаборатории) зависят от световых циклов, чтобы установить свои циркадные часы. Циркадные ритмы могут влиять на все, от размножения и кормления до здоровья иммунной системы12,13 и должны быть последовательными для максимальной пользы для здоровья. Рыбы поддерживаются в системе проточной воды на 14-часовом свете и 10-часовом темном фотопериоде. Поверхностные рыбы обычно начинают нерест через час после того, как система потемнела, и свет, введенный в этот период, может мешать и прекращать нерест. Нерест слепых пещерных рыб меньше нарушается светом. По сравнению с нерестом поверхностных рыб, нерест пещерной рыбы задерживается, обычно начиная через четыре-пять часов после того, как система потемнела.

Второе соображение – это питание. Взрослых рыб обычно кормят рационом из тетрахлопьев один раз в день. Перед нерестом рыбу кормят богатой белком диетой, дополненной дополнительным количеством тетрахлопьев и другой пищи: яичными желтковыми хлопьями и иногда живыми калифорнийскими черными червями(Lumbriculus variegatus),чтобы компенсировать потерю белка из-за производства яиц во время предыдущего нерестового цикла. В течение недели размножения рыб кормят два раза в день, один раз утром и снова днем / вечером. Рыб, кормящихся только один раз в день, но с одной очень большой порцией пищи, следует избегать, так как это может вызвать недоедание14.

Третье соображение – это пространство. Требования к пространству основаны на средней массе тела взрослой особи, а также на поведенческих соображениях, таких как наличие у рыб стайного поведения или агрессивного поведения. Переполненные или недонаселенные аквариумы могут привести к повышенной агрессии и постоянному стрессу, что делает рыб уязвимыми к травмам от своих товарищей по аквариуму и неохотно участвует в нересте15. Обычно мы размещаем 10-20 рыб на 42 л аквариума.

Четвертое соображение – это температура. Как упоминалось выше, рыбы являются хладнокровными животными и полагаются на окружающую среду для поддержания температуры тела. Поскольку температура оказывает непосредственное влияние на метаболические процессы, изменения температуры могут вызвать поведенческие изменения у рыб16. Эта программа разведения состоит из двухнедельных циклов температуры: первая неделя вводит скачок температуры до 78 ° F, а следующая неделя поддерживает статическую температуру 72 ° F. В течение первой (племенной) недели на дно резервуаров каждый вечер помещаются гнездовые сети с пластиковыми краями. Гнездовые сети служат барьером между рыбой в аквариумах и нерестяными яйцами, которые в противном случае были бы съедены. Температура повышается на 2 ° F в день до максимума 78 ° F к середине недели, и нерест индуцируется в соответствии с световым циклом в первые 2-3 вечера этой недели. Затем температура понижается на 2 ° F с шагом до 72 ° F в течение оставшихся дней недели, а базовая температура поддерживается до начала следующей недели размножения. Размножение обычно стимулируется не чаще двух раз в месяц, чтобы дать рыбе время на восстановление.

В целом, этот метод позволяет нерестить большое количество эмбрионов самого высокого качества в течение более длительного периода времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта процедура была одобрена руководящими принципами институционального ухода за животными Университета Мэриленда, Колледж-Парк (в настоящее время IACUC 469 #R-NOV-18-59; Проект 1241065-1).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Календари в течение недели размножения и недели без разведения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Понедельник

  1. В 9-10 утра выполните испытания воды и шаги 1.1.1-4 ниже.
    1. Запишите температуру в помещении, резервуаре и резервуаре с помощью термометра.
    2. Запишите уровни аммиака, нитратов и нитратов с помощью колориметрического испытательного набора.
    3. Запишите pH из системы мониторинга, а также из набора колориметрических тестов.
    4. Регистрируйте проводимость с монитора carboy и монитора основной системы.
  2. Начиная с 10 утра, кормите всех рыб.
    1. Кормите всех рыб во взрослой системе тетрахлопьями, измельчая хлопья в аквариумах с молодыми рыбами. Кормите только столько хлопьев, сколько аквариум с рыбой может съесть полностью за 3-5 минут, примерно «пощипывая пальцем».
  3. Проверьте инкубатор, используемый для размещения чаш для пальцев развивающихся эмбрионов, и при необходимости замените воду.
    1. Откройте инкубатор эмбрионов и проверьте уровень воды во всех водоемах. Если у них заканчиваются воды, добавьте системную воду. Проверьте настройки температуры инкубатора. Растить эмбрионы при 73-77 °F (23-25 °C).
  4. Чистый живой корм.
    1. Чтобы очистить черных червей, извлеките непокрытые бассейны Tupperware, содержащие их культуры, из холодильника с живым кормом и вылейте лишнюю воду над скоплениями червей в раковину. Используя дистиллированную воду, суспендировать и промыть червей несколько раз, пока вода не прольется.
    2. Добавьте достаточно чистой воды, чтобы скопления червей были покрыты примерно наполовину. Замените оставшихся червей в холодильнике с живым кормом, непокрытым.
  5. Корм для рыб.
    1. По крайней мере, через 30 минут после первого кормления кормите рыбу в аквариумах, в которых желательно разведение, хлопьями яичного желтка, черными червями или и тем, и другим. Добавьте «палецовый хлопья» из желтковых хлопьев на бак. Добавьте достаточное количество скоплений черных червей, чтобы каждая рыба в аквариуме съела около 5-10 червей.
  6. В 10:00 - 13:00 установите температуру воды на уровне 74 °F.
  7. Очистите резервуары для размножения по мере необходимости и установите гнездовые сети.
  8. Очистите резервуары и положите сетки не менее чем через час после последнего кормления. Заранее очистите все резервуары, в которые помещены сетки. Установите селекционные сети осторожно, чтобы не мешать подаче воздуха в резервуар.

2. Вторник

  1. Соберите эмбрионы и промыть все племенные сетки.
    1. В 9-10 утра снимите сетки для размножения со дна резервуаров взрослой системы. Осторожно промойте эмбрионы в ручную сетку, используя шланг, прикрепленный к карбою, и перевернуть ручную сетку в чашу с чистой системной водой, чтобы изгнать эмбрионы.
    2. Соберите и вымойте каждый набор эмбрионов, а затем поместите в чашу с чистой системой воды, содержащей 0,00003% метиленового синего (синей воды). Если из одного резервуара находится исключительно большое количество эмбрионов, разделите их на несколько чаш. Концентрация живых эмбрионов должна составлять около 100 на 200 мл голубой воды в каждом чаше.
    3. Оцените время оплодотворения, поразвив эмбрионы под микроскопом, используя опубликованную таблицу времени развития A. mexicanus 17.
    4. Часто контролируйте чаши с эмбрионами. Удалите мертвые или деформированные эмбрионы и мусор, такие как несъединая пища или фекалии, с помощью пипетки Пастера. Часто меняйте синюю воду в чашах.
    5. Поместите чаши в инкубатор на 5-7 дней. В это время желток был изношен и для дальнейшего развития необходимо подкормление культур живыми солеными креветками.
  2. Возьмем данные о нересте.
    1. Для каждого резервуара, в который сбрасывают эмбрионы, запишите следующую информацию.
      1. Запишите дату и номер резервуара.
      2. Запишите приблизительное количество выпавших эмбрионов(рисунок 2):
        Высокий (500+)
        Средний (200-500)
        Низкий(<200)
      3. Запишите качество выпавших эмбрионов(рисунок 2):
        Высокий (>75% живого)
        Средний (25-50% живой)
        Низкий (<25% живого)
      4. Оцените первоначальное время нереста, обратившись к промежуточной таблице17 Astyanax mexicanus.
      5. Запишите температуру, при которую система была установлена, когда рыба нерестилась.
  3. Кормите всех рыб.
  4. Установите температуру воды на 76 °F.
  5. Приготовьте живой корм.
  6. Кормовые рыбные #2.
  7. Зачерпните излишки пищи и мусора из резервуаров и очистите перед сбросом сетей.

3. Среда

  1. Повторите шаги 2.1-2.2. Соберите эмбрионы и промыть все племенные сетки.
  2. Берите данные о нересте, как и раньше.
  3. Выполняйте тесты воды, как и раньше.
  4. Кормите всех рыб.
  5. Установите температуру воды на 78 °F.
  6. Подготовьте живую ленту.
  7. Проверьте эмбрионы в инкубаторе.
    1. Очистите и измените воду эмбрионов в пальчиковых чашах, которые со временем будут использоваться для пополнения общего взрослого племенного поголовья. Используйте системную воду, обработанную метиленовым синим цветом.
  8. Снова покормите рыбу.
  9. Очищайте резервуары по мере необходимости и сбрасывайте сетки.

4. Четверг

  1. Повторите шаги 2.1-2.2. Собирайте эмбрионы, мойте и храните сетки для размножения.
  2. Берите данные о нересте, как и раньше.
  3. Установите температуру воды на 76 ° F.
  4. Очистите живую ленту.
  5. Очистите все отдельные резервуары.
  6. Проверьте эмбрионы в инкубаторе.
  7. Кормовые рыбные #2.

5. Пятница

  1. Кормите всех рыб.
  2. Установите температуру воды на 74 °F.
  3. Очистите живую ленту.
  4. Проверьте эмбрионы в инкубаторе.

6. Суббота

  1. Корм для рыб.

7. Воскресенье

  1. Корм для рыб.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как правило, мы разводим и нерестим потомков поверхностных рыб, первоначально собранных в Насимиенто-дель-Рио-Чой в Сан-Луис-Потоси, Мексика (поверхностная рыба Рио-Чой) и Сан-Соломон-Спрингс в государственном парке Балморхеа, штат Техас (техасская поверхностная рыба), и пещерных рыб, полученных из Куэва-де-Эль-Пашон (пещерная рыба Пачон) в Тамаулипасе, Мексика, и Куэва-де-лос-Сабинос (пещерная рыба Лос-Сабинос) и Сотано-де-ла-Тинаха (пещерная рыба Тинаха) в Сан-Луис-Потоси Мексика.

В течение ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astyanax mexicanus - это новая биологическая модель, которая часто нерестится и может быть легко выведена в лаборатории1,2. Поскольку мы заинтересованы в механизмах развития, лежащих в основе эволюционных изменений в пещерных рыбах A. mexicanus, производство и использование эмбрионов имеет жизненно важное значение для наших исследовательских целей. Основной целью поддержания взрослого поголовья рыб является производство эмбрионов и молодых мальк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Дэвида Мартасяна, Дидре Хейзера, Эми Паркхерст, Крейга Фута и Мэнди Нг за ценный вклад в культурный центр лаборатории Джеффри A. mexicanus. Исследования в лаборатории Джеффри в настоящее время поддерживаются грантом NIH EY024941.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BlackwormsEastern Aquatics, Ланкастер, ПенсильванияНет
Сети для разведения Изготовленныена заказ
яйца морских креветокAquaCave Lake Forest, Иллинойс.Нет
Колориметрический набор для тестированияPetcoАртикул:11916API Набор для тестирования pH пресной воды
Хлопья яичного желткаPentair, Миннеаполис, МиннесотаНет
Пальчиковые чашиКаролина Биологическое снабжение741004Тарелки для культур, 4,5 дюйма, 250 мл
Ручные сеткиЛюбой зоомагазин
Инкубатор для эмбрионовFisher Scientific51-029-321HPM405 л
Растворимые морские солиSpectrum Brands, Блэксбург, ВирджинияНет
Метиленовый синийSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриM9140
Пастеровские пипеткиFisher Scientific13-678-205.75 in.
Решение для замачивания сеткойЛюбой зоомагазин
Nutrafin CycleAmazonNoneБактериальный буст
Холодильник для живой подачиЛюбой источник
СтереомикроскопЛюбой источник
ТермометрЛюбой источник
Tetra Tropical CrispsSpectrum Brands, Блэксбург, ВирджинияНет

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
  2. Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
  3. Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
  4. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
  5. Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
  6. O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281(2013).
  7. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15(2015).
  8. Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1(2018).
  9. Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
  10. Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62(2019).
  11. Borowsky, R. Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
  12. Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112(2015).
  13. Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
  14. Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34(2009).
  15. Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
  16. Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025(2019).
  17. Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
  18. Borowsky, R. In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
  19. Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591(2019).
  20. Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
  21. Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28(2014).
  22. Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487(2017).
  23. Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
  24. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370(2015).
  25. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Surface FishCave FishEmbryo CollectionBreeding ProtocolSpawning StimulationEmbryo StagingIncubator SetupWater Temperature

Похожие статьи