Методическая статья

Сочетание мультиплексной флуоресцентной гибридизации in situ с флуоресцентной иммуногистохимией на свежезамороженных или фиксированных срезах мозга мышей

DOI:

10.3791/61709

⸱

25 июня 2021 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, University of New South Wales

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается метод сочетания флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и флуоресцентной иммуногистохимии (IHC) как в свежезамороженных, так и в фиксированных срезах мозга мышей с целью получения мультиметочного FISH и флуоресцентного сигнала IHC. ИГХ нацелен на цитоплазматические и мембранные присоединенные белки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это молекулярный метод, который определяет наличие и пространственное распределение специфических транскриптов РНК в клетках. Нейрохимическое фенотипирование функционально идентифицированных нейронов обычно требует одновременного мечения несколькими антителами (белком-мишенью) с использованием иммуногистохимии (ИГХ) и оптимизации гибридизации in situ (таргетная РНК) в тандеме. Может быть достигнута «нейрохимическая сигнатура» для характеристики конкретных нейронов, однако осложняющие факторы включают необходимость верификации мишеней FISH и IHC перед объединением методов, а также ограниченное количество РНК и белков, которые могут быть нацелены одновременно в пределах одного и того же участка ткани.

Здесь мы опишем протокол, использующий как свежезамороженные, так и фиксированные препараты мозга мышей, который обнаруживает несколько мРНК и белков в одном и том же участке мозга с помощью РНК-скопа FISH с последующим флуоресцентным иммуноокрашиванием, соответственно. Мы используем комбинированный метод для описания паттерна экспрессии мРНК с низкой распространенностью (например, рецептор галанина 1) и мРНК с высокой распространенностью (например, транспортер глицина 2) в иммуногистохимически идентифицированных ядрах ствола мозга.

Основные соображения по маркировке белков после анализа FISH выходят за рамки подготовки тканей и оптимизации маркировки зондов FISH. Например, мы обнаружили, что на связывание антител и специфичность маркировки может отрицательно влиять стадия протеазы в анализе FISH-зонда. Протеазы катализируют гидролитическое расщепление пептидных связей, облегчая проникновение FISH-зонда в клетки, однако они также могут переваривать белок, на который нацелен последующий анализ ИГХ, вызывая нецелевое связывание. Субклеточное расположение целевого белка является еще одним фактором, способствующим успеху ИГХ после FISH-анализа. Мы наблюдали, что специфичность ИГХ сохраняется, когда белок-мишень связан с мембраной, в то время как ИГХ, нацеленная на цитоплазматический белок, требует обширного устранения неполадок. Наконец, мы обнаружили, что работа с фиксированной замороженной тканью, установленной на предметном стекле, более сложной, чем со свежезамороженной тканью, однако качество ИГХ было в целом лучше с фиксированной замороженной тканью в сочетании с РНК-скопом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки и мРНК, которые нейрохимически определяют субпопуляции нейронов, обычно идентифицируются с помощью комбинации иммуногистохимии (ИГХ) и/или гибридизации in situ (ISH) соответственно. Сочетание ISH с методами ИГХ облегчает характеризацию паттернов колокализации, уникальных для функциональных нейронов (нейрохимическое кодирование), максимизируя способность мультиплексного мечения.

Флуоресцентные методы ISH (FISH), включая RNAscope, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с более ранними методами детектирования РНК, такими как радиоактивный ISH и нерадиоактивный хромогенный ISH. FISH позволяет визуализировать одиночные транскрипты мРНК в виде точечных пятен1. Кроме того, анализ РНК-скопа позволяет одновременно маркировать увеличенное количество мишеней РНК, используя различные метки флуорофора. Несмотря на эти преимущества, технические ограничения могут повлиять на количество флуорофоров/хромогенов, которые могут быть использованы в одном эксперименте. К ним относятся наличие комплектов фильтров для микроскопов; Такие соображения усугубляются, когда нейрохимическая идентификация использует комбинированные FISH и IHC, по сравнению с использованием каждого метода по отдельности, поскольку неотъемлемые шаги, оптимальные для одного метода, могут быть вредными для другого.

Предыдущее применение FISH в сочетании с ИГХ продемонстрировало экспрессию специфических клеточных мишеней в В-клеточных лимфомах человека2, эмбрионах цыплят3, эмбрионах рыбок данио4, сетчатке мыши5 и клетках внутреннего уха мыши6. В этих исследованиях ткань препарировалась либо с помощью фиксированного формалином парафина (FFPE)2,3,5, либо свежего целого монтировки 4,6. В других исследованиях применяли хромогенный РНК-скоп на фиксированных препаратах мозга мышей и крыс 7,8,9. В частности, Baleriola et al.8 описаны два различных тканевых препарата для комбинированного ISH-IHC; фиксированные участки мозга мыши и секции мозга человека FFPE. В недавней публикации мы объединили FISH и флуоресцентный ИГХ на свежезамороженных срезах, чтобы одновременно визуализировать мРНК с низкой распространенностью (рецептор галанина 1, GalR1), мРНК с высокой распространенностью (транспортер глицина 2, GlyT2) и везикулярный транспортер ацетилхолина (vAChT) белка10 в ретикулярной формации ствола мозга.

Ядро солитарного тракта (НТС) является основной областью мозга, участвующей в вегетативной функции. Расположенная в заднем мозге, эта гетерогенная популяция нейронов получает и интегрирует огромное количество вегетативных сигналов, в том числе и тех, которые регулируют дыхание. NTS содержит несколько нейронных популяций, которые могут быть фенотипически охарактеризованы паттерном экспрессии мишеней мРНК, включая GalR1 и GlyT2, а также белковых маркеров фермента тирозингидроксилазы (TH) и транскрипционного фактора Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

Владелец РНКаскопа рекомендует свежезамороженные препараты тканей, но ткани, приготовленные путем транскардиальной перфузионной фиксации цельного животного, наряду с длительной криозащитой (хранение при -20 °C) фиксированных замороженных срезов ткани, распространены во многих лабораториях. Таким образом, мы стремились разработать протоколы для FISH в сочетании с ИГХ с использованием свежезамороженных и фиксированных замороженных тканевых препаратов. Здесь мы приводим свежезамороженные и фиксированные замороженные срезы мозга: (1) протокол комбинированного FISH и флуоресцентного ИГХ, (2) описание качества маркировки мРНК и белков, получаемых при использовании каждого препарата, (3) описание экспрессии GalR1 и GlyT2 в NTS.

Наше исследование показало, что в сочетании с методологией РНК-скопа успех ИГХ варьировался в свежезамороженных и фиксированных замороженных препаратах и зависел от локализации белков-мишеней в клетке. В наших руках мембранно-связанное мечение белков всегда было успешным. В отличие от этого, ВПХ для цитоплазматического белка требовала устранения неполадок даже в тех случаях, когда цитоплазматический белок был чрезмерно экспрессирован у трансгенного животного (Phox2b-GFP)11. Наконец, в то время как GalR1 экспрессируется в некатехоламингических нейронах в NTS, экспрессия GlyT2 отсутствует в NTS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Краткое описание этапов предварительной обработки тканей можно найти на рисунке 1. Все процедуры проводились в соответствии с Комитетом по уходу за животными и этике Университета Нового Южного Уэльса в соответствии с руководством по использованию и уходу за животными в научных целях (Австралийский национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям).

1. Пробоподготовка свежезамороженных тканей головного мозга

  1. Транскардиальная перфузия
    1. Приготовьте гепаринизированный (2500 Ед/л) 0,1 М фосфатный буфер (ФБ), рН 7,5. Приготовьте суспензию этанола из сухого льда, смешав сухой лед с этанолом. Он будет иметь температуру примерно −72 °C и будет использоваться для немедленного замораживания собранной ткани.
    2. Усыпляют взрослых мышей C57BL/6 и Phox2b-GFP11 (Mouse Genome Informatics Database ID MGI:5776545) путем обезболивания пентобарбиталом натрия (70 мг/кг, в/в) с помощью 27,5-дюймового игольчатого калибра.
      ВНИМАНИЕ: Пентобарбитал является барбитуратом. Он остро токсичен в высоких дозах и может вызвать смерть от остановки дыхания. Перед использованием ознакомьтесь с местными рекомендациями по здравоохранению, правовым нормам и правилам безопасности материалов.
    3. Обнажите сердце и канюлируйте левый желудочек с помощью иглы (23-дюймового калибра). Проводят транскардиальную перфузию гепаринизированным 0,1 М ПБ до очищения крови (2-3 минуты) со скоростью потока 11-13 мл/мин. Определяют очищение крови, контролируя окраску печени и эффузат из правого предсердия12.
    4. Изолируйте мозг от полости черепа, немедленно поместите его в компаунд с оптимальной температурой резки (OCT) в криомолд или алюминиевую фольгу и поместите в ванну с этанолом с сухим льдом. Храните замороженную встроенную ткань в герметичном контейнере при температуре -80 °C до 3 месяцев.
  2. Секционирование свежезамороженных тканей
    1. Установите температуру криостата на -20 °C. Оставьте ткань, внедренную в ОКТ, и криостатный патрон в криостате на ~30 минут, чтобы обеспечить равновесие к новой температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите ткань в замороженном виде; транспортируйте ткань из морозильной камеры с температурой -80 °C в криостат на сухом льду.
    2. Закрепите ткань на предварительно охлажденном патроне криостата с помощью ОКТ-компаунда. В этом протоколе тканевые блоки устанавливались на патрон в корональной плоскости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите излишки ОКТ с ткани с помощью бритвенного лезвия, чтобы свести к минимуму количество ОКТ, срезаемого криостатом и впоследствии переносимого на предметное стекло.
    3. Вырежьте корональные срезы толщиной 14 мкм и установите их на предметные стекла для микроскопии.
      1. Перед монтажом секций нагрейте слайды до комнатной температуры. После того, как секция будет смонтирована, храните салазки в слайд-боксе в криостате.
      2. Если на одном предметном стекле необходимо установить более одной секции, согрейте область для второй секции, положив палец на противоположную сторону предметного стекла на 5-10 секунд, чтобы облегчить прилегание секции к предметному стеклу. Срез холодной ткани не будет прикреплен к холодному предметному стеклу. Секции должны прилегать к слайдам ровно; Складывание приведет к тому, что они упадут с направляющих во время стирки.
      3. Если на участках замечены трещины, увеличьте температуру криостата на 1-5 °C, чтобы этого избежать. Особенно важно расположить срезы тканей в непосредственной близости друг от друга на одном предметном стекле. Это предотвратит потерю FISH-зондов и реагентов во время анализа.
    4. Срезы тканей, прикрепленные к предметным стеклам, храните в герметичном контейнере при температуре -80 °C до 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите секции замороженными и избегайте циклов замораживания, чтобы предотвратить деградацию РНК. Транспортируйте слайд-бокс из криостата в морозильную камеру с температурой -80 °C на сухом льду.
  3. Фиксация свежезамороженных тканей
    1. В день проведения зондового анализа FISH приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 M PB, pH 7,5 (4% раствор PFA). Фильтруют, пропуская фильтровальную бумагу (класс 1: 11 мкм, таблица материалов) в воронку Бюхнера или тигельный фильтр.
      ВНИМАНИЕ: PFA вреден и токсичен при контакте с кожей или вдыхании. Все процедуры с раствором PFA следует проводить в вытяжном шкафу. Отходы раствора PFA следует утилизировать тщательно в соответствии с институциональными протоколами безопасности.
    2. Охладите 4% раствор PFA до 4 °C. Транспортируйте задвиженную ткань из морозильной камеры с температурой -80 °C в сухом льду и сразу же погрузите ее в предварительно охлажденный фиксатор на 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы этот этап фиксации не превышал 15 минут, так как чрезмерная фиксация приведет к неспецифической фоновой маркировке.
  4. Обезвоживание свежезамороженных тканей
    1. Обезвоживайте срезы тканей, погружая предметные стекла в дифференцированные концентрации этанола. В банку Coplin сначала погрузите 50%, затем 70% и, наконец, абсолютный этанол на 5 минут каждый при комнатной температуре. Повторите окончательную абсолютную инкубацию этанола во второй раз.
    2. Высушите горки на воздухе и очертите группу секций с помощью гидрофобной барьерной ручки, убедившись, что внутренняя площадь сведена к минимуму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что предметное стекло полностью высохло, прежде чем рисовать гидрофобный барьер. Гидрофобный барьер должен окружать участки ткани полностью без зазоров и должен быть сухим перед дальнейшей обработкой.

2. Пробоподготовка фиксированной замороженной ткани головного мозга

  1. Фиксация транскардиальной перфузии
    1. Эвтаназию мышей обезболивали пентобарбиталом натрия (70 мг/кг, в/м) с последующей транскардиальной перфузией, сначала 0,1 М ПБ, затем 4% раствором ПФА. Закрепите 10-минутной перфузией со скоростью 11-13 мл/мин.
    2. Изолируют мозг от полости черепа после перфузионной фиксации и погружают на ночь в 4% раствор PFA при температуре 4 °C.
  2. Срезы фиксированных тканей
    1. Промыть мозг в стерильном 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) перед удалением менингеальных слоев с помощью препарирующего микроскопа с помощью тонких щипцов.
    2. Разрежьте мозг точно на блоки (отделите ствол мозга от переднего мозга перед разделением вибратомы) с помощью матрицы мозга (таблица материалов). В частности, разрежьте ствол мозга каудально в месте пирамидной декуссации и рассеките мозжечок. Точно так же разрезают передний мозг непосредственно рострально к зрительной хиазме.
    3. Закрепите ткань на вибрирующем патроне микротома с помощью цианоакрилата и поместите в 2% раствор агара.
    4. Срезы тканей толщиной 30 мкм вырезать с помощью вибрирующего микротома и хранить срезы в растворе криопротектора (30% безРНКазная сахароза, 30% этиленгликоль, 1% поливинилпирролидон (ПВП-40), в 0,1 М ПБ, рН 7,4). Срезы тканей можно хранить в криопротекторе при температуре -20 °C до 6 месяцев.
  3. Подготовка фиксированных секций перед FISH
    1. В день FISH промойте свободно плавающие участки три раза, по 10 минут на каждую стирку, чтобы удалить раствор криопротектора. Для промывки помещают срезы в 0,1 м PBS в 12-луночную планшет для культивирования клеток и перемешивают на вращающемся платформенном шейкере (90 - 100 об/мин).
    2. После мытья используйте кисть, чтобы закрепить срезы на предметных стеклах для микроскопии и высушить на воздухе не менее 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секции должны плотно прилегать к направляющим, так как любые выраженные складки приведут к их отсоединению во время стирки.
    3. Используя гидрофобную барьерную ручку, нарисуйте барьер вокруг секций, чтобы ограничить реагенты FISH секциями. Опять же, важно свести к минимуму внутреннюю площадь контура, нарисованного барьерной ручкой.
      ВОЗМОЖНАЯ ТОЧКА РАЗРЫВА: Срезы можно хранить при комнатной температуре в течение ночи, чтобы продолжить анализ на следующий день.

3. Анализ РЫБЫ

ПРИМЕЧАНИЕ: Остальная часть протокола относится как к свежезамороженным, так и к фиксированным замороженным тканям.

  1. Подготовьте реагенты и инструменты для этапов гибридизации и амплификации.
    1. Установите настольный инкубатор и водяную баню на 40 °C.
    2. Подготовьте увлажненную, защищенную от света камеру для инкубации предметных стекол. Увлажнение предотвращает пересыхание тканей – предметные стекла надежно расположены над влажным резервуаром. В идеале камера изготовлена из сверхпрочного полистирола, она светонепроницаема и воздухонепроницаема для поддержания насыщенной атмосферы водяного пара. Закрытие камеры основано на минимальном трении, чтобы избежать движения. Мы использовали слайд-бокс, выстланный влажными лабораторными салфетками (Таблица материалов) внизу. Поместите слайд-бокс внутрь инкубатора, чтобы он прогрелся до 40 °C.
    3. Нагрейте буфер для промывки 50x (таблица материалов) и зонды до 40 °C в течение 10 минут на водяной бане, затем остудите до комнатной температуры.
    4. Приготовьте 1 л 1x Wash Buffer из 50-кратной концентрации бульона.
    5. Подготовка смеси зондов (Таблица материалов): зонд C1 готов к использованию при концентрации на складе, в то время как зонды C2 и C3 поставляются с концентрацией 50x и требуют разбавления разбавителем, входящим в комплект.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси зондов можно хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
  2. Лечение протеазой
    1. Инкубируйте срезы с Protease III (таблица материалов) при комнатной температуре в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что протеаза III и инкубационные реагенты в последующих процессах (смесь зондов, растворы для амплификации, блокирующий буфер и сыворотки антител) полностью покрывают участки. Наконечник пипетки можно использовать для распределения реагента по участку, чтобы покрыть всю площадь внутри гидрофобного барьера.
    2. Дважды промойте предметные стекла 0,1 м PBS, каждый раз по 2 минуты, в большой пластиковой квадратной чашке Петри. Здесь использовалась квадратная чашка для биопроб размером 245 мм х 245 мм (Таблица материалов). Возьмите с одной стороны блюда и осторожно наклоните 3-5 раз. После промывки смахните излишки 0,1 М PBS с предметного стекла и сразу же добавьте следующий реагент. Не допускайте высыхания срезов ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время каждой стирки предметные стекла погружаются в раствор комнатной температуры. Это рабочий процесс для всех последующих этапов стирки. Фиксированные секции толщиной 30 мкм легче смещаются с предметных стекол, чем секции толщиной 14 мкм, будьте осторожны во время стирки.
  3. Гибридизация и амплификация
    1. Смыв раствор протеазы, поместите предметные стекла в увлажненную, предварительно прогретую камеру. Инкубируйте срезы с зондовой смесью (таблица материалов) в течение 2 часов при температуре 40 °C в настольном инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что для положительных и отрицательных контрольных зондов отведено не менее 2 секций для оценки качества образца РНК и оптимальной пермеабилизации. Положительные контрольные зонды нацелены на гены, отвечающие за ведение домашнего хозяйства; В данном случае это был коктейль из РНК, нацеленных на убиквитин С (UBC; высокая распространенность), пептидилпропилизомеразу B (PPIB; умеренное распространение) и РНК-полимеразу 2a (POLR2A; низкое распространение). Отрицательные контрольные зонды нацелены на бактериальный ген 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатредуктазы (DapB), который обычно отсутствует в образцах мозга мышей. Положительный сигнал DapB указывает на неспецифический сигнал и/или бактериальное загрязнение образца.
    2. После гибридизации с зондовой смесью этапы усиления сигнала состоят из инкубации с усилителем 1-FL (30 минут), затем с усилителем 2-FL (15 минут), затем с усилителем 3-FL (30 минут) и, наконец, с усилителем 4-FL (15 минут) - каждый при 40 °C. С помощью прилагаемых флаконов-капельниц покройте участки тканей раствором для амплификации. Приступайте к анализу ИГХ после последнего этапа амплификации.
    3. Промывайте предметные стекла буфером для промывки дважды в течение 2 минут между гибридизацией зонда и каждым этапом амплификации.

4. Анализ ИГХ

  1. Шаг блокировки IHC
    1. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител, инкубируют срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с блокирующим раствором, содержащим 10% нормальной лошадиной сыворотки, 0,3% Tween20 в 1x TBSm (50 мМ Tris-Cl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,05% мертиолят) после анализа FISH. Готовят первичные антитела в буфере для разведения, содержащем 1x TBSm, 5% нормальной лошадиной сыворотки и 0,1% Tween20. Основные поставщики антител перечислены в Таблице материалов.
  2. Иммуногистохимия
    1. Удалите излишки блокирующего буфера, щелкнув предметным стеклом, и инкубируйте срезы с первичными антителами в течение ночи при 4 °C.
    2. Промойте предметные стекла 3 раза (по 5 минут каждый) с 1 TBSm и инкубируйте со вторичными антителами в разбавителе, содержащем 1x TBSm, 1% нормальной лошадиной сыворотки и 0,1% Tween20 в течение 2 часов при комнатной температуре. Вторичные антитела, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.
    3. Промойте предметные стекла 3 раза с помощью 1x TBSm (5 минут каждая) перед нанесением покрытия монтажным средством с DAPI (таблица материалов) или без него.

5. Визуализация

  1. Исследуйте иммуноокрашивание под эпифлуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой (подробности см. в таблице материалов ). Получайте репрезентативные изображения с 20-кратным увеличением и сохраняйте их в виде файлов TIFF.
  2. Экспортируйте репрезентативные изображения в программное обеспечение для обработки изображений (таблица материалов) для регулировки яркости/контрастности для повышения четкости и отражения истинного рендеринга.

6. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Количественный анализ целевых транскриптов

ПРИМЕЧАНИЕ: Это статья о методах, и количественные результаты не предоставляются. Метод количественной оценки, представленный здесь, взят из Dereli et al.10. См.

  1. Получите изображения из областей интереса, как описано в 5.1, и примените одни и те же настройки микроскопа и камеры (например, время экспозиции и интенсивность света) ко всем изображениям одного и того же флуорофора.
  2. Постройте график профилей нейронов с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Таблица материалов).
  3. Выровняйте срезы по уровню Брегмы в соответствии со стереотаксическим атласом мозга13.
  4. Примените одинаковую яркость и контрастность ко всем изображениям одного и того же флуорофора. Рассматривайте только нейроны с DAPI-окрашенными ядрами.
  5. Вручную подсчитайте количество мРНК, экспрессирующих белки, мРНК/мРНК, белок/белок и коэкспрессирующих мРНК/белок клеток в интересующей области.
  6. Чтобы уменьшить систематическую ошибку в экспериментальных результатах, сделайте так, чтобы человек, оценивающий результаты эксперимента, был слеп к экспериментальным группам.
  7. Примените поправку Аберкромби14 к общему количеству ячеек с помощью следующего уравнения Аберкомби:
    Скорректированное количество ячеек = ручное количество ячеек x толщина сечения / (толщина сечения + размер ядра)
    Например, для срезов толщиной 14 мкм средняя ширина ядра составляет 7,7 ± 0,3 мкм, а средняя толщина сечения составляет 14 ± 1 мкм из расчета 30 клеток и 10 секций соответственно у 5животных10. Согласно уравнению Аберкромби, скорректированное количество клеток будет ручным подсчетом клеток x 14/(14+7,7).

Технологическая схема обработки тканей: транскардиальная перфузия, секционирование для криостата/вибратома, приготовление FISH.
Рисунок 1: Параллельный рабочий процесс этапов предварительной обработки тканей как для свежезамороженных, так и для параформальдегидных фиксированных тканей. Этапы обработки свежезамороженных тканей отображаются в красных рамках, в то время как этапы обработки фиксированных тканей из параформальдегида (PFA) отображаются в синих рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Схема рабочего процесса флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и иммуногистохимии.
Рисунок 2: Краткое описание комбинированной процедуры FISH-зонда и иммуногистохимии. После предварительной обработки ткани ткань, установленную на предметном стекле, обматывают с помощью гидрофобного барьерного пера, как показано на первом кадре, и инкубируют в растворе протеазы при комнатной температуре. После промывки ткань переносят в настольный инкубатор для гибридизации на 2 часа перед последовательными этапами амплификации. В системе гибридизации in situ используется запатентованная конструкция Z-зонда, предусилители и усилители, как показано на кадрах 3-66. После того, как ткань прошла обработку FISH-зондом, ее промывают перед блокировкой обычной лошадиной сывороткой. Первичную инкубацию антител проводят в течение ночи при 4 °C для максимального связывания антитело-антиген. Инкубацию вторичных антител (2 часа) проводили при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы описываем метод комбинирования мультиплексного FISH с флуоресцентным ИГХ для локализации экспрессии мРНК для GalR1 и GlyT2 с использованием свежезамороженных и параформальдегидных фиксированных тканей соответственно в NTS мыши. Конвейер процедур обработки тканей, FISH и IHC, описанных в методах, показан на рисунке 1 и рисунке 2. В таблице 1 приведена сводная информация о комбинациях зондов и антител FISH, используемых на каждо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нейронауках FISH и IHC обычно используются для исследования пространственной организации и функциональной значимости мРНК или белков в субпопуляциях нейронов. Протокол, описанный в этом исследовании, повышает способность к одновременному обнаружению мРНК и белков в отделах мозга. Наш комбинированный мультиплексный анализ FISH-IHC позволил провести фенотипическую идентификацию различных субпопуляций нейронов в NTS как в свежезамороженных, так и в фиксированных препаратах мозга. FISH-IHC в фиксированных замороженных ткан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована грантом Австралийского исследовательского совета Discovery Project DP180101890 и грантом проекта Фонда медицинских исследований Ребекки Л. Купер PG2018110

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ANIMALS
C57BL/6мышь Australian BioResources, Moss ValeMGI: мышь 2159769
Phox2b-eGFPAustralian BioResources, Moss ValeMGI: 5776545
REAGENTS
CyanoacrylateLoctite
ЭтиленгликольСигма-Олдрич324558
гепарин-натрияClifford Hallam Healthcare1070760Проконсультируйтесь с местным поставщиком ветеринарных услуг или аптекой.
Летабарб (пентабарбитол натрия) Эвтаназия для инъекцийVirbac (Australia) Pty LtdN/AПроконсультируйтесь с ветеринаром о местных фармацевтических правилах в отношении пентабарбитола натрия
Молекулярный порошок агарозыSigma Aldrich5077
OCT Compound, 118 млScigen Ltd4586
Параформальдегид, приллированный, 95%Sigma-Aldrich441244-1KG
Поливинилпирролидон, средний моль весом 40 000  (ПВП-40)Sigma-AldrichPVP40
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930с
флуоресцентных реагентов DAPI RNAscope Multiplex (до 3-плексной возможности)Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)ADV320850включает 50x Wash Buffer и протеазу III
РНКазу AwayThermo-Fisher Scientific7003
Tris (гидроксиметил)аминометанSigma-Aldrich252859
Tween-20, для молекулярной биологииSigma-AldrichP9416
EQUIPMENT
Настольный инкубаторThermoline научный микроинкубатор Модель: TEI-13G
Brain Matrix, мышь, 30г взрослый, корональный, 1ммTed Pella15050
CryostatLeicaCM1950
Игла для рисования (калибр 23 дюйма)BD0288U07
Гидрофобная барьерная ручкаVector labsH-4000
Kimtech Science Kimwipes Салфетки для деликатных задачKimberley Clark Professional34120
Olympus BX51OlympusBX-51
Перистальтический насосColeparmer MasterflexСерия L/S 
Цифровой фотоаппарат Retiga 2000RQImagingRET-2000R-F-CLRцветной фотоаппарат
SuperFrost Plus Стеклянные слайды (белый)Thermo-Fisher Scientific4951PLUS4
(Вибратом)Фильтровальнаябумага
ватмана, класс 1, диаметр 110 ммMerckWHA1001110
<прочный> ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
CorelDRAW Corel CorporationVersion 7
FIJI (ImageJ Distribution)Open Source/GNU General Public License (GPL)N/AImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Хайнер, М. К. и др. (2017), "ImageJ2: ImageJ для следующего поколения научных данных изображений", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    и Фиджи: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
<сильные>ПЕРВИЧНЫЕ АНТИТЕЛА
антитирозингидроксилазные антителаMillipore SigmaAB1542Sheep поликлональные (разведение 1:1000), RRID: AB_90755
антитела против тирозингидроксилазы, клон LNC1Millipore SigmaMAB318Мышиный моноклональный (разведение 1:1000), RRID: AB_2201528
антитела против везикулярного транспортера ацетилхолина (VAchT)Sigma-AldrichABN100Goat polyclonal (разведение 1:1000), RRID:
AB_2630394 антитело GFPNovus BiologicalsNB600-308Rabbit поликлональное (разведение 1:1000), RRID: антитело AB_10003058
Phox2b (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-376997Мышиный моноклональный (разведение 1:1000), RRID:
AB_2813765<сильные>ВТОРИЧНЫЕ АНТИТЕЛА
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) Jackson ImmunoResearch711-545-152Donkey Anti-Rabbit (разведение 1:400), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-155-147Donkey Anti-Sheep (разведение 1:400), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch705-175-147Donkey Anti-Goat (разведение 1:400), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, shp Sr Prot)Jackson ImmunoResearch715-175-151Donkey Anti-Mouse (разведение 1:400), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-175-147Donkey anti-Sheep (разведение 1:400), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 олигонуклеотидный зондACDBio448821-C1мишени bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Глицин транспортер 2 олигонуклеотидный зондACDBio409741-C3мишени bp 925 - 2153 (Номер генного банка: NM_148931.3)
Олигонуклеотидный зонд Phox2bACDBio407861-C2мишени bp 1617 - 2790 (Код генного банка: NM_008888.3)
набором Вибрационный микротом Leica VT1200S

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
  3. Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
  4. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55(2014).
  5. Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
  6. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  7. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120(2015).
  8. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).
  9. Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  10. Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343(2019).
  11. Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
  14. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
  15. Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
  16. Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
  17. Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
  18. Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
  19. Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
  20. Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
  21. Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
  22. Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
  23. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  24. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  25. Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
  26. Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
  27. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNAscope FISH

Похожие статьи