В этом протоколе описывается метод сочетания флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и флуоресцентной иммуногистохимии (IHC) как в свежезамороженных, так и в фиксированных срезах мозга мышей с целью получения мультиметочного FISH и флуоресцентного сигнала IHC. ИГХ нацелен на цитоплазматические и мембранные присоединенные белки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сочетание мультиплексной флуоресцентной гибридизации in situ с флуоресцентной иммуногистохимией на свежезамороженных или фиксированных срезах мозга мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это молекулярный метод, который определяет наличие и пространственное распределение специфических транскриптов РНК в клетках. Нейрохимическое фенотипирование функционально идентифицированных нейронов обычно требует одновременного мечения несколькими антителами (белком-мишенью) с использованием иммуногистохимии (ИГХ) и оптимизации гибридизации in situ (таргетная РНК) в тандеме. Может быть достигнута «нейрохимическая сигнатура» для характеристики конкретных нейронов, однако осложняющие факторы включают необходимость верификации мишеней FISH и IHC перед объединением методов, а также ограниченное количество РНК и белков, которые могут быть нацелены одновременно в пределах одного и того же участка ткани.
Здесь мы опишем протокол, использующий как свежезамороженные, так и фиксированные препараты мозга мышей, который обнаруживает несколько мРНК и белков в одном и том же участке мозга с помощью РНК-скопа FISH с последующим флуоресцентным иммуноокрашиванием, соответственно. Мы используем комбинированный метод для описания паттерна экспрессии мРНК с низкой распространенностью (например, рецептор галанина 1) и мРНК с высокой распространенностью (например, транспортер глицина 2) в иммуногистохимически идентифицированных ядрах ствола мозга.
Основные соображения по маркировке белков после анализа FISH выходят за рамки подготовки тканей и оптимизации маркировки зондов FISH. Например, мы обнаружили, что на связывание антител и специфичность маркировки может отрицательно влиять стадия протеазы в анализе FISH-зонда. Протеазы катализируют гидролитическое расщепление пептидных связей, облегчая проникновение FISH-зонда в клетки, однако они также могут переваривать белок, на который нацелен последующий анализ ИГХ, вызывая нецелевое связывание. Субклеточное расположение целевого белка является еще одним фактором, способствующим успеху ИГХ после FISH-анализа. Мы наблюдали, что специфичность ИГХ сохраняется, когда белок-мишень связан с мембраной, в то время как ИГХ, нацеленная на цитоплазматический белок, требует обширного устранения неполадок. Наконец, мы обнаружили, что работа с фиксированной замороженной тканью, установленной на предметном стекле, более сложной, чем со свежезамороженной тканью, однако качество ИГХ было в целом лучше с фиксированной замороженной тканью в сочетании с РНК-скопом.
Введение
Белки и мРНК, которые нейрохимически определяют субпопуляции нейронов, обычно идентифицируются с помощью комбинации иммуногистохимии (ИГХ) и/или гибридизации in situ (ISH) соответственно. Сочетание ISH с методами ИГХ облегчает характеризацию паттернов колокализации, уникальных для функциональных нейронов (нейрохимическое кодирование), максимизируя способность мультиплексного мечения.
Флуоресцентные методы ISH (FISH), включая RNAscope, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с более ранними методами детектирования РНК, такими как радиоактивный ISH и нерадиоактивный хромогенный ISH. FISH позволяет визуа....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Краткое описание этапов предварительной обработки тканей можно найти на рисунке 1. Все процедуры проводились в соответствии с Комитетом по уходу за животными и этике Университета Нового Южного Уэльса в соответствии с руководством по использованию и уходу за животными в научных целях (Австралийский национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям).
1. Пробоподготовка свежезамороженных тканей головного мозга
- Транскардиальная перфузия
- Приготовьте гепаринизированный (2500 Ед/л) 0,1 М фосфатный буфер (ФБ), рН 7,5. Приготовьте суспензию этанола из сухого льда, смешав сухой лед с этан....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В данной работе мы описываем метод комбинирования мультиплексного FISH с флуоресцентным ИГХ для локализации экспрессии мРНК для GalR1 и GlyT2 с использованием свежезамороженных и параформальдегидных фиксированных тканей соответственно в NTS мыши. Конвейер процедур обработки тканей, FISH и IHC, описанных в методах, показан на рисунке 1 и рисунке 2. В таблице 1 приведена сводная информация о комбинациях зондов и антител FISH, используемых на каждо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В нейронауках FISH и IHC обычно используются для исследования пространственной организации и функциональной значимости мРНК или белков в субпопуляциях нейронов. Протокол, описанный в этом исследовании, повышает способность к одновременному обнаружению мРНК и белков в отделах мозга. Наш комбинированный мультиплексный анализ FISH-IHC позволил провести фенотипическую идентификацию различных субпопуляций нейронов в NTS как в свежезамороженных, так и в фиксированных препаратах мозга. FISH-IHC в фиксированных замороженных ткан.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была профинансирована грантом Австралийского исследовательского совета Discovery Project DP180101890 и грантом проекта Фонда медицинских исследований Ребекки Л. Купер PG2018110
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 | мышь Australian BioResources, Moss Vale | MGI: мышь 2159769 | |
| Phox2b-eGFP | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Этиленгликоль | Сигма-Олдрич | 324558 | |
| гепарин-натрия | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Проконсультируйтесь с местным поставщиком ветеринарных услуг или аптекой. |
| Летабарб (пентабарбитол натрия) Эвтаназия для инъекций | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Проконсультируйтесь с ветеринаром о местных фармацевтических правилах в отношении пентабарбитола натрия |
| Молекулярный порошок агарозы | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118 мл | Scigen Ltd | 4586 | |
| Параформальдегид, приллированный, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Поливинилпирролидон, средний моль весом 40 000 (ПВП-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | с |
| флуоресцентных реагентов DAPI RNAscope Multiplex (до 3-плексной возможности) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | включает 50x Wash Buffer и протеазу III |
| РНКазу Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris (гидроксиметил)аминометан | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, для молекулярной биологии | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Настольный инкубатор | Thermoline научный микроинкубатор Модель | : TEI-13G | |
| Brain Matrix, мышь, 30г взрослый, корональный, 1мм | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Игла для рисования (калибр 23 дюйма) | BD | 0288U07 | |
| Гидрофобная барьерная ручка | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Салфетки для деликатных задач | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Перистальтический насос | Coleparmer Masterflex | Серия L/S | |
| Цифровой фотоаппарат Retiga 2000R | QImaging | RET-2000R-F-CLR | цветной фотоаппарат |
| SuperFrost Plus Стеклянные слайды (белый) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| (Вибратом) | Фильтровальная | бумага | |
| ватмана, класс 1, диаметр 110 мм | Merck | WHA1001110 | |
| <прочный> ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public License (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Хайнер, М. К. и др. (2017), "ImageJ2: ImageJ для следующего поколения научных данных изображений", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z и Фиджи: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| <сильные>ПЕРВИЧНЫЕ АНТИТЕЛА | |||
| антитирозингидроксилазные антитела | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep поликлональные (разведение 1:1000), RRID: AB_90755 |
| антитела против тирозингидроксилазы, клон LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Мышиный моноклональный (разведение 1:1000), RRID: AB_2201528 |
| антитела против везикулярного транспортера ацетилхолина (VAchT) | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (разведение 1:1000), RRID: |
| AB_2630394 антитело GFP | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit поликлональное (разведение 1:1000), RRID: антитело AB_10003058 |
| Phox2b (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Мышиный моноклональный (разведение 1:1000), RRID: |
| AB_2813765<сильные>ВТОРИЧНЫЕ АНТИТЕЛА | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey Anti-Rabbit (разведение 1:400), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey Anti-Sheep (разведение 1:400), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey Anti-Goat (разведение 1:400), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey Anti-Mouse (разведение 1:400), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (разведение 1:400), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 олигонуклеотидный зонд | ACDBio | 448821-C1 | мишени bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Глицин транспортер 2 олигонуклеотидный зонд | ACDBio | 409741-C3 | мишени bp 925 - 2153 (Номер генного банка: NM_148931.3) |
| Олигонуклеотидный зонд Phox2b | ACDBio | 407861-C2 | мишени bp 1617 - 2790 (Код генного банка: NM_008888.3) |
Ссылки
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
