Одновременное живое изображение нескольких эмбрионов насекомых в образец камерного листа флуоресценции микроскопов

Summary

Флуоресцентная микроскопия на основе легкого листа является наиболее ценным инструментом в биологии развития. Одной из основных проблем в сравнительных исследованиях является разница в окружающей среде. Наш протокол описывает экспериментальную основу для одновременного живого изображения нескольких образцов и, следовательно, решает этот вопрос про-активно.

Abstract

Флуоресцентная микроскопия на основе светового листа предлагает эффективные решения для изучения сложных процессов в нескольких биологически релевантных масштабах. Образцы камерных установок, которые специально разработаны для сохранения трехмерной целостности образца и обычно имеют вращение образца, являются лучшим выбором в биологии развития. Например, они были использованы для документирования всего эмбрионального морфогенеза плодовой мухи Drosophila melanogaster и красной муки жука Tribolium castaneum. Тем не менее, многие доступные протоколы живой визуализации обеспечивают только экспериментальные рамки для отдельных эмбрионов. Специально для сравнительных исследований такие подходы неудобны, так как последовательно изображенные образцы страдают от дисперсии окружающей среды. Кроме того, это ограничивает количество образцов, которые могут быть просасылись в течение данного времени. Мы предоставляем экспериментальную основу для одновременного живого изображения, что увеличивает пропускную способность в образца камеры на основе установок и, таким образом, обеспечивает аналогичные условия окружающей среды для всех образцов. Во-первых, мы предоставляем рекомендации по калибровке световых листов флуоресцентных микроскопов. Во-вторых, мы предлагаем монтажный метод для нескольких эмбрионов, который совместим с вращением образца. В-третьих, мы предоставляем образцовые трехмерные наборы данных живой визуализации Drosophila, для которых мы сопоставляем три трансгенные линии с флуоресцентно помеченными ядрами, а также Tribolium, для которых мы сравниваем производительность трех трансгенных подлин, которые несут тот же трансген, но в разных геномных местах. Наш протокол специально разработан для сравнительных исследований, так как он активно устраняет дисперсию окружающей среды, которая всегда присутствует в последовательной живой визуализации. Это особенно важно для количественного анализа и характеристики аберрологических фенотипов, которые являются результатом, например, нокаут-экспериментов. Кроме того, это увеличивает общую пропускную способность, что очень удобно, когда доступ к световым микроскопам флуоресценции листа ограничен. Наконец, предлагаемый метод монтажа может быть адаптирован для других видов насекомых и дальнейшей модели организмов, например, зебры, практически без оптимизации усилий.

Introduction

Флуоресценция микроскопии является одним из наиболее важных методов визуализации в науке о жизни, особенно в клеточной и биологии развития. В конфокальных флуоресценции^{микроскопов 1}, которые являются самыми художественными для трехмерной флуоресценции изображения с середины 1990-х годов, тот же объектив используется для флюорофора возбуждения и обнаружения излучения света. Лазерный луч освещения возбуждает все фторфоры вдоль оси освещения/обнаружения, и соответствующий внефокусный сигнал подвергается дискриминации до обнаружения пинхолом. Следовательно, для каждого двумерного изображения весь образец освещается. Следовательно, для каждого трехм....

Protocol

1. Подготовительная работа

1. Выберите объектив освещения / обнаружение объектива / камеры сочетание для LSFM, который подходит научный вопрос и настроить микроскоп. Размер поля зрения является фактором размера чипа камеры и увеличения объектива обнаружения. Объектив освещения должен быть выбран таким образом, чтобы все поле зрения было покрыто примерно планарной световой пленкой^34. Три рекомендуемые комбинации перечислены в таблице 1.
2. Для приготовления агарозных алицитов и поиска блюд добавьте 2 г низкорастучая агарозы в 200 мл автоматической водопроводной воды и нагрейте смесь в микроволновой печи при темпера....

Results

Наш протокол описывает экспериментальную основу для сравнительной флуоресценции живой визуализации в образец камеры на основе LSFMs. Например, эта структура может быть использована для сопоставления (i) эмбрионов двух или более видов, ii) эмбрионов линий, в которых один или несколько генов выбиты плюс элементы управления дикого типа, (iii) несколько эмбрионов одной и той же трансгенной линии, (iv) эмбрионы из различных трансгенных линий, или (v) эмбрионы из подлин, которые несут тот же трансген , но в разных геномных мес.......

Discussion

Одной из областей исключительного применения LSFMs является биология развития. В этой дисциплине важно смотреть на живые образцы, иначе морфогенетические процессы не могут быть описаны динамически. Экспериментальная основа для одновременного живого изображения в образцах камерных LSFMs, как описано здесь, удобна по двум основным причинам.

Эмбиент дисперсия, которая неизбежна в последовательной живой визуализации, может быть решена про-активно. В живой визуализации, связанной с эмбрионами насек.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-луночная пластина	Orange Scientific	4430500
24-луночный планшет	Orange Scientific	4430300	Только для визуализации в реальном времени с использованием Tribolium
35-mm Ø Чашка Петри	Fisher Scientific	153066	Только для визуализации в реальном времени с участием Drosophila.
90-мм и Oslash; Чашка	Петри Fisher Scientific	L9004575
100 &микро; Ячеистый фильтр размера меш	BD Biosciences	352360
250 &микро; m размер ячеистого сита	VWR International	200.025.222-038	Только для визуализации в реальном времени с использованием Tribolium
300 &; Размер ячеистого сита v	VWR International	200.025.222-040	Только для визуализации в реальном времени с использованием Tribolium
710 &; Размер ячеистого сита VWR	International	200.025.222-050	Только для визуализации в реальном времени с использованием Tribolium
800 &; m размер ячеистого сита	VWR International	200.025.222-051	Только для визуализации в реальном времени с участием Tribolium
405 пшеничной муки тонкого помола	Demeter e.V.	SP061006	Только для визуализации в реальном времени с участием Tribolium
коммерчески доступной среды Drosophila	Genesee Scientific	66-115	Только для визуализации в реальном времени с участием Drosophila / Изготовленной на заказ среды Drosophila также могут использоваться
флуоресцентные микросферы, 1.0 &; m & Oslash;	Thermo Fisher Scientific	T7282
неактивные сухие дрожжи	Genesee Scientific	62-108
низкоплавкая агароза	Carl Roth	6351.2
узкие флаконы	Genesee Scientific	32-109	Только для визуализации в реальном времени с участием Drosophilaмаленькая
кисть	VWR International	149-2121
гипохлорит натрия (NaOCl), ~12% активен Cl	Carl Roth	9062.3	Внимание: гипохлорит натрия является коррозионным веществом
из цельнозерновой муки	Demeter e.V.	SP061036	Только для визуализации в реальном времени с участием Tribolium / Великобритания: широкие флаконы из муки грубого помола
	Genesee Scientific	32-110	Только для визуализации в реальном времени с участием Drosophila