Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках с использованием 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET

2.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61720

⸱

27 октября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

В этой статье

Краткое содержание

Из-за низкого отношения сигнал/шум (SNR) датчиков на основе резонансной передачи энергии (FRET) измерения сигналов цАМФ были сложными, особенно в трех пространственных измерениях. Здесь мы описываем гиперспектральную методологию визуализации и анализа FRET, которая позволяет измерять распределение цАМФ в трех пространственных измерениях.

Аннотация

Циклический АМП является вторым мессенджером, который участвует в широком спектре клеточной и физиологической деятельности. Несколько исследований показывают, что сигналы цАМФ разделены и что компартментализация способствует специфичности сигналов в рамках сигнального пути цАМФ. Разработка биосенсоров на основе резонансного переноса энергии (FRET) на основе Fӧrster способствовала способности измерять и визуализировать сигналы цАМФ в клетках. Однако эти измерения часто ограничиваются двумя пространственными измерениями, что может привести к неправильному толкованию данных. На сегодняшний день были проведены лишь очень ограниченные измерения сигналов цАМФ в трех пространственных измерениях (x, y и z) из-за технических ограничений в использовании датчиков FRET, которые по своей природе демонстрируют низкое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, традиционные подходы к визуализации на основе фильтров часто неэффективны для точного измерения сигналов цАМФ в локализованных субклеточных областях из-за ряда факторов, включая спектральные перекрестные помехи, ограниченную силу сигнала и автофлуоресценцию. Чтобы преодолеть эти ограничения и позволить использовать биосенсоры на основе FRET с несколькими флуорофорами, мы разработали гиперспектральные подходы к визуализации и анализу FRET, которые обеспечивают спектральную специфичность для расчета эффективности FRET и возможность спектрально отделять сигналы FRET от смешивающей автофлуоресценции и / или сигналов от дополнительных флуоресцентных меток. Здесь мы представляем методологию реализации гиперспектральной визуализации FRET, а также необходимость построения соответствующей спектральной библиотеки, которая не является ни недовыборочной, ни передискретированной для выполнения спектрального размешивания. Хотя мы представляем эту методологию для измерения трехмерных распределений цАМФ в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVECs), эта методология может быть использована для изучения пространственных распределений цАМФ в ряде типов клеток.

Введение

Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является вторым мессенджером, участвующим в ключевых клеточных и физиологических процессах, включая деление клеток, приток кальция, транскрипцию генов и трансдукцию сигналов. Растущее количество доказательств свидетельствует о существовании цАМФ-компартментов в клетке, благодаря которым достигается сигнальнаяспецифичность 1,2,3,4,5,6,7. До недавнего времени компартментализация цАМФ выводилась на основе различных физиологических или клеточных эффектов, индуцированных различными агонистами G-связанных рецепторов8,9,10,11. Совсем недавно флуоресцентные зонды на основе FRET предоставили новые подходы для прямого измерения и наблюдения сигналов цАМФ в ячейке12,13,14.

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это физическое явление, при котором передача энергии происходит между донорскими и акцепторными молекулами нерадиационным образом, когда молекулы находятся в непосредственнойблизости 15,16. С развитием флуоресцентных индикаторов на основе FRET это физическое явление было использовано в биологических приложениях для изучения белково-белковых взаимодействий17,колокализации белка18,передачи сигналов Ca+2 19,экспрессии генов20,деления клеток21 и циклической нуклеотидной сигнализации. Индикаторы цАМФ на основе FRET обычно состоят из цАМФ-связывающего домена, донорского флуорофора и акцепторного флуорофора22. Например, датчик цАМФ H18812,22, используемый в данной методологии, состоит из цАМФ-связующего домена, полученного из Epac, зажатого между бирюзовыми (донорскими) и венериными (акцепторными) флуорофорами. В базальных условиях (несвязанные) бирюза и Венера находятся в такой ориентации, что между флуорофорами возникает FRET. При связывании цАМФ с связующим доменом происходит конформационное изменение, в результате чего Бирюза и Венера раздвигаются, что приводит к снижению FRET.

Подходы к визуализации на основе FRET предлагают многообещающий инструмент для исследования и визуализации сигналов цАМФ в клетке. Однако современные методы микроскопической визуализации на основе FRET часто лишь частично успешны в достижении достаточной силы сигнала для измерения FRET с субклеточной пространственной четкостью. Это связано с несколькими факторами, включая ограниченную силу сигнала многих репортеров FRET, высокий уровень точности, необходимый для точной количественной оценки изменений эффективности FRET, и наличие смешанных факторов, таких как клеточная автофлуоресценция23,24. Результатом часто является изображение FRET, которое страдает от слабого SNR, что делает визуализацию субклеточных изменений в FRET очень сложной. Кроме того, исследование пространственно локализованных сигналов цАМФ почти исключительно проводилось только в двух пространственных измерениях, а осевое распределение цАМФ редко считалось25. Вероятно, это связано с тем, что низкий SNR препятствует возможности измерения и визуализации градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях. Чтобы преодолеть ограничения использования датчиков FRET с низким SNR, мы внедрили гиперспектральные подходы к визуализации и анализу для измерения FRET в отдельных клетках25,26,27.

Подходы к гиперспектральной визуализации были разработаны НАСА для дифференциации наземных объектов, присутствующих на спутниковых снимках28,29. С тех пор эти методы были переведены в поле флуоресцентной микроскопии30,с несколькими коммерческими системами конфокальных микроскопов, предлагающими спектральные детекторы. В традиционной (неспектральной) флуоресцентной визуализации образец возбуждается с помощью полосового фильтра или лазерной линии, а излучение собирается с помощью второго полосового фильтра, часто выбираемого в соответствии с пиковой длиной волны излучения флуорофора (флуорофоров). Напротив, подходы к гиперспектральной визуализации направлены на выборку полного спектрального профиля либо флуоресцентного излучения26,31,32, либо возбуждения33,34 на определенных интервалах длин волн. В наших предыдущих исследованиях мы показали, что гиперспектральные подходы к визуализации и анализу могут предложить улучшенную количественную оценку сигналов FRET в клетках по сравнению с традиционными методами визуализации FRET на основе фильтров26. Здесь мы представляем методологию выполнения 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET для измерения и визуализации распределений цАМФ в трех пространственных измерениях. Эти подходы позволили визуализировать агонист-индуцированные цАМФ пространственные градиенты в одиночных ячейках25. Интересно, что в зависимости от агониста градиенты цАМФ могут быть очевидны в клетках. Представленная здесь методология использует спектральное размешивание неоднородного фона и клеточной автофлуоресценции для повышения точности измерений FRET. Хотя эта методология демонстрируется в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVEC) с использованием биосенсора цАМФ FRET, методология может быть легко модифицирована для использования с альтернативными репортерами FRET или альтернативными клеточными линиями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол следует процедурам, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университетом Южной Алабамы.

1. Подготовка клеток, образцов и реагентов к визуализации

  1. Выделяют легочные микрососудистые эндотелиальные клетки крыс (PMVECs), как описаноранее 35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки были выделены и культивированы ядром клеточной культуры в Университете Южной Алабамы, Мобил, штат Алабама, на 100-миллиметровых блюдах для клеточных культур.
  2. Высевят ИВПК на 25 мм круглых стеклянных обшивках и дадут им расти в инкубаторе при 37 °C до тех пор, пока клетки не достигнут не менее 80% конфюсации (не менее 24 часов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки и тип клеток могут варьироваться от исследования к исследованию, и, следовательно, для посева и выращивания клеток следует соблюдать процедуры клеточной культуры, специфичные для клеток. Протокол посева и культивирования клеток, используемый в этих исследованиях, доступен в качестве дополнительной информации в файле под названием «Дополнительная File_Cell культуры и трансфекции».
  3. Трансфектировать PMVEC с помощью биосенсора FRET и инкубировать в течение 48 часов при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол трансфекции PMVEC также описан в дополнительном информационном файле под названием «Дополнительные File_Cell культуры и трансфекции».
  4. В день визуализации нагрейте буфер Тирода до 37 °C на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер Тирода состоит из 145 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ CaCl2
  5. Установите крышку, содержащую трансфектные ячейки, в камеру ячеек и закрепите верхнюю часть монтажной прокладкой для предотвращения утечки.
  6. Протрите нижнюю часть крышки с помощью деликатной салфетки, чтобы очистить лишнюю мякоть или прилипчивые ячейки.
  7. Добавьте 800 мкл рабочего буфера и 4 мкл ядерной метки 5 мМ в камеру ячейки и аккуратно помечайте в течение 5–10 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении буферных или реагентных растворов к покровным слипам, установленным в камере ячеек, обязательно добавляйте раствор осторожно и сбоку от камеры ячеек, чтобы не выбить адгезивные ячейки. Добавление 4 мкл ядерной метки 5 мМ к 800 мкл буфера создает конечную концентрацию ядерной метки 25 мкМ. Для слабо адгезивных клеток, таких как клетки HEK293, сначала смешайте ядерную метку и буфер во флаконе, а затем добавьте к чехлам, установленным в камере клетки. Это предотвратит подъем клеток с крышки.
  8. Накройте камеру ячейки алюминиевой фольгой для защиты от света и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  9. Подготовка реагента: Добавьте 1 мкл 50 мМ-м раствора в 199 мкл буфера. Это даст конечную концентрацию форсколина 50 мкМ при добавлении к клеткам, которые были приготовлены с 800 мкл буфера. 1 мкл ДМСО в 199 мкл буфера также должен быть подготовлен для использования в качестве органов управления транспортным средством.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этих исследованиях форсколин используется в качестве активатора аденилилциклазы для стимуляции производства цАМФ. При желании данная методика может быть легко модифицирована, чтобы позволить лечение альтернативными реагентами для стимуляции или ингибирования аденилциклазы, фосфодиэстераз и т.д.

2. Получение изображений

  1. Используйте конфокальный микроскоп, оснащенный спектральным детектором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы получения изображений, описанные здесь, были разработаны с использованием коммерчески доступной системы микроскопа Nikon A1R. Эти шаги, возможно, потребуется скорректировать при использовании альтернативного спектрального микроскопа. Убедитесь, что все оборудование включено по крайней мере за 30 минут до начала эксперимента, чтобы достичь стабильных условий эксплуатации.
  2. Выберите цель погружения в воду в 60 раз и добавьте каплю воды к цели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации живых клеток с высоким разрешением рекомендуется использовать объектив с высокой числовой диафрагмой. Пожалуйста, обратитесь к Списку материалов для получения информации о цели, используемой в этих исследованиях.
  3. Поместите камеру нагруженной ячейки (из шага 1.7) на ступень микроскопа.
  4. Выберите установленный фильтр DFT (DAPI/FITC/TRITC), настроив ручку фильтра на правой стороне микроскопа.
  5. Работа микроскопа в флуоресцентном широкоугольном режиме с помощью окуляров для выбора поля зрения, содержащего клетки, экспрессирующие датчик цАМФ FRET.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что средняя интенсивность сигнала FRET на донорской или акцепторной пиковой длине волны излучения в выбранной ячейке составляет, по меньшей мере, 100 единиц интенсивности (A.U.) или, по меньшей мере, 4X базового сигнала области без экспрессии клеток. Это можно подтвердить с помощью средства просмотра профилей спектра, доступного в программном обеспечении NIS Elements. При поиске ячейки с хорошим сигналом желательно отбросить чрезмерно яркие клетки (они могут быть скомпрометированы).
  6. Откройте программное обеспечение NIS, переключитесь в конфокальный режим, разблокируйте кнопку лазерной блокировки и нажмите на Live.
  7. Используйте ручку фокусировки, чтобы сфокусироваться на ячейках, глядя на предварительный просмотр на экране.
  8. Настройте параметры устройства, сбора и z-стека в программном обеспечении, как описано ниже.
  9. Настройки сбора:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки камеры и устройства могут быть применены с использованием ранее полученного изображения. Откройте изображение, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Повторно использовать настройки камеры.
    1. Откройте меню настроек A1, установите флажки, соответствующие лазерным линиям 405 нм и 561 нм, выберите SD для спектрального детектора, выберите 10 для разрешения и 31 для каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меню настроек A1 отображается в виде небольшого значка шестеренки в левом верхнем углу окна настроек A1 Plus. 405 нм лазер используется для возбуждения донора и 561 нм лазер используется для возбуждения ядерной метки.
    2. Установите диапазон длин волн (410 – 730 нм), выбрав начальные и конечные значения длин волн.
    3. Щелкните значок binning/skip в меню настроек A1 и выберите поле с номером 15, затем нажмите кнопку ОК в меню настроек A1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это для удаления канала длины волны, который соответствует лазеру возбуждения 561 нм (обычно это15-й канал длины волны). Важно не использовать эту полосу длин волн, чтобы избежать искусственно заниженного сигнала, который может создать спектральный артефакт. Сигнал ниже в этой полосе из-за механического пальца, который закрывает детекторный элемент, чтобы защитить его от лазерного повреждения.
    4. Установите интенсивность лазера на 8% и 2% для лазеров 405 нм и 561 нм соответственно, Si Hv (усиление детектора) на уровне 149 и радиус точечного отверстия 2,4 воздушных дисковых единиц (AU).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера, возможно, придется регулировать в зависимости от возраста прибора и состояния лазеров. При регулировке интенсивности лазера между различными образцами или экспериментальными группами важно поддерживать одинаковое соотношение интенсивностей лазера (например, 8:2). Кроме того, важно выбрать интенсивность лазера, которая не настолько яркая, чтобы создать быстрое фотоотбеливание. Коэффициент усиления детектора должен быть отрегулирован таким образом, чтобы максимизировать интенсивность сигнала при минимизации шума детектора. Для этих исследований был использован коэффициент усиления в 149. Размер точечного отверстия 2,4 а.е. был выбран в качестве баланса между получением изображений с достаточным отношением сигнал/шум (SNR) и поддержанием оптического сечения (конфокальность). Увеличение размера точечного отверстия увеличивает SNR, но уменьшает конфокальность.
    5. Установите скорость сканирования на 0,25 спектральных кадров в секунду, выберите значок, соответствующий однонаправленному для направления сканирования, введите 4 для счетчика и установите 1024 x 1024 для размера сканирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналы FRET слабые, и часто требуется медленная скорость сканирования. При использовании скорости сканирования 0,25 получение спектрального z-стека завершается за ~3 минуты. Скорость сканирования может быть увеличена или уменьшена в зависимости от используемых флуорофоров. Например, для более ярких флуорофоров, таких как eGFP, можно использовать более высокую скорость сканирования (2 кадра в секунду). Число, введенное под счетчиком, соответствует значению усреднения кадра 4, что помогает в снижении шума при получении изображения. Для очень стабильных образцов и там, где время не является ограничением, более высокие значения усреднения (до 16) могут быть использованы для получения изображений с улучшенным SNR.
  10. Определите параметры сбора z-стека:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, введенные на этапах 2.10, возможно, потребуется скорректировать с учетом изменений в связывании или концентрации флуоресцентных этикеток, типе этикетки, количестве используемых этикеток, клеточной линии и других изменениях в пробоподготовке, которые могут повлиять на плотность маркировки клеток и/или клеточную автофлуоресценцию. При корректировке параметров захвата следует проявлять осторожность для достижения достаточного SNR при минимизации фотоотбеливания. Кроме того, при настройке спектрального анализа FRET следует позаботиться о том, чтобы параметры хорошо работали во всех группах лечения. Желательно провести испытание каждой группы лечения с предложенными настройками параметров, чтобы убедиться, что SNR является достаточным и фотоотбеливание сведено к минимуму.
    1. Откройте окно сбора ND, щелкнув Просмотр → управление получением → сбором ND.
    2. Введите путь/место назначения и имя файла, чтобы сохранить ND-файл во всплывающем окне.
    3. Установите флажок, соответствующий z-серии.
    4. Нажмите на live в окне настроек A1 Plus. Откроется окно просмотра в реальном времени.
    5. Отрегулируйте ручку фокусировки на микроскопе, чтобы выбрать верхнюю часть ячейки, и нажмите кнопку «Сверху» в окне сбора ND, чтобы установить текущее положение в качестве верхней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется фокусироваться немного выше верхней части ячейки, чтобы гарантировать, что вся ячейка отобрана в серии z.
    6. Отрегулируйте ручку фокусировки на микроскопе, чтобы выбрать нижнюю часть ячейки, и нажмите «Снизу» в окне сбора ND, чтобы установить текущую позицию в качестве нижней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сосредоточьтесь немного ниже нижней части ячейки, чтобы убедиться, что вся клетка отобрана.
    7. Введите 1 мкм для размера шага, выберите сверху вниз для направления z-сканирования и нажмите кнопку «Выполнить» в окне ND Acquisition, чтобы получить z-стек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага определяет количество z-срезов, которые будут получены в зависимости от верхнего и нижнего расположения (т.е. пройденного расстояния). Размер шага 1 мкм был выбран в качестве компромисса между скоростью изображения, выборкой по оси Z и фотоотбеливанием. Использование конфокального диаметра точечного отверстия 2,4 а.е. и 60-кратного водоиммерного объектива привело к толщине оптического сечения 1,73 мкм. Следовательно, размер шага 1 мкм немного ниже критериев выборки Найквиста, но это компромисс, который был сделан для сокращения времени, необходимого для получения z-стека. Для очень стабильных образцов, для которых скорость не является критической, для увеличения разрешения по оси z может использоваться меньший шаг оси Z и, возможно, меньший диаметр конфокального отверстия. Нижняя часть должна давать аналогичные результаты и может использоваться для оценки любых эффектов фотоотбеливания, которые могут возникнуть во время сканирования z.
  11. Настройте систему идеальной фокусировки (PFS), если она доступна:
    ПРИМЕЧАНИЕ: PFS позволяет системе компенсировать колебания глубины фокуса во время получения изображения. Для настройки PFS могут быть использованы следующие шаги, и эти шаги могут незначительно отличаться в зависимости от версии Nikon A1R и используемой версии NIS Elements.
    1. Выделите симметричный режим, определенный значком диапазона в окне сбора ND.
    2. Включите кнопку PFS на передней панели микроскопа (убедитесь, что дихроичная зеркальная ручка, расположенная на секции под стадией образца, находится «в»).
    3. Переопределите верхнюю часть (повернуть против часовой стрелки) и нижнюю (повернуть по часовой стрелке) с помощью ручки на передней грани контроллера смещения PFS.
    4. Определите относительную z-позицию/z-глубину, щелкнув «относительная» в окне получения ND.
    5. Щелкните память на передней грани микроскопа, чтобы программное обеспечение запомнить относительную z-глубину.
  12. После того, как сбор z-стека будет завершен, аккуратно добавьте желаемый реагент (forskolin или vehicle control) с помощью пипетки и подождите 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте реагент очень осторожно, чтобы не нарушать клетки или не перемещать положение клеточной камеры в пределах стадии XY микроскопа; полезно проверить в последующем просмотре в реальном времени или изображении, что поле зрения не сместилось во время добавления реагента. 10-минутное время ожидания - это время для того, чтобы лечение курсолином вступить в силу. Если используется альтернативное лечение, время ожидания, возможно, потребуется скорректировать.
  13. Через 10 минут измените имя файла и нажмите кнопку Выполнить в окне получения ND.
  14. Повторите этапы 2.11 – 2.13, как описано выше, по меньшей мере для 5 обложек, чтобы получить достаточные результаты для статистического анализа (n = 5 для каждой группы обработки – форсколина и контроля транспортного средства).
  15. Подготовьте образцы и образцы заготовок для построения спектральной библиотеки и получения спектральных изображений с использованием параметров сбора, аналогичных описанным в шагах 2.9 и 2.10.

3. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изображения будут использоваться для построения спектральной библиотеки, содержащей чистые спектры всех отдельных конечных элементов, присутствующих в исследовании. Конечные элементы в спектральной библиотеке могут варьироваться от исследования к исследованию, если используются разные флуорофоры. Подробная процедура построения спектральной библиотеки приведена в дополнительном информационном файле под названием «Дополнительная File_Spectral библиотека». Здесь мы описываем экспорт данных в файлы .tiff, линейное спектральное размешивание, измерения эффективности FRET, трехмерную реконструкцию и оценку уровней cAMP. Анализ изображений может быть выполнен с использованием различных платформ анализа изображений и программирования, таких как ImageJ, Python, MATLAB или CellProfiler. В этих исследованиях использовались скрипты MATLAB.

  1. Экспорт данных изображения:
    1. Создайте новые папки с тем же именем файла, соответствующим спектральным изображениям z-стека, полученным на шагах 2.13 и 2.14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги, описанные для экспорта данных, специфичны для NIS Elements AR версии 4.30.01. Эти шаги могут незначительно отличаться в зависимости от версии программного обеспечения.
    2. Щелкните Файл, который откроет окно файла. Найдите и выберите файл спектрального изображения, полученный на шаге 2.12, и нажмите кнопку Открыть.
    3. После загрузки файла щелкните Файл→ Импорт/Экспорт→ Экспорт документа ND.
    4. Во всплывающем окне: найдите и выберите папку, созданную на шаге 3.1.1, выберите Формат изображения с тегами (TIF) для типа файла, затем выберите Моно изображение для каждого канала и Сохранить битовую глубину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Префикс файла будет предварительно сгенерирован; измените это значение для удобства. Порядок индексов будет меняться в зависимости от выбранных каналов и должен отображать "z, c" для индексации в соответствии с местоположением z-среза первым и номером полосы волн второй. Убедитесь, что поля, соответствующие параметрам Применить LUT или Вставить наложения или Использовать имена точек, не выбраны.
    5. Нажмите кнопку Экспорт, чтобы экспортировать файлы tiff в папку назначения в виде отдельных файлов TIFF.
    6. Повторите шаги 3.1.2 – 3.1.5 для экспорта файлов спектральных изображений, полученных на шаге 2.13.
  2. Линейное спектральное размешивание:
    1. Откройте программное обеспечение для программирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанный программный скрипт для разминожения необработанных спектральных изображений предоставляется на веб-сайте BioImaging and BioSystems Университета Южной Алабамы во вкладке Ресурсы (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Откройте файл с надписью «Линейное размешивание.m» и нажмите кнопку «Выполнить» на панели инструментов редактора.
    3. Найдите и выберите папку, содержащую экспортированную последовательность файлов *.tif, сгенерированную программным обеспечением NIS Elements.
    4. Нажмите ok, чтобы продолжить, что откроет новое окно под названием Wavelength and Z-Slice.
    5. Скопируйте имя первого файла (без z-slice и номера канала) в папку, выбранную на шаге 3.2.4, и вставьте его в первый шаг диалогового окна с надписью «Введите имя изображения».
    6. Введите количество каналов на втором шаге с надписью «Введите количество полос длин волн», количество z-срезов на третьем шаге с надписью «Введите количество Z-срезов» и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество полос длин волн может изменяться при внесении изменений в настройки сбора, такие как корректировка диапазона длин волн или размера шага длины волны. Количество Z-срезов также может изменяться в зависимости от высоты ячейки.
    7. Просмотрите и выберите файл длины волны под названием «Wavelength.mat» во всплывающем окне с надписью «Выберите файл информации о длине волны» и нажмите «Открыть».
    8. Найдите и выберите файл «Library.mat» в новом всплывающем окне с надписью «Выберите файл спектральной библиотеки», нажмите «Открыть» и дождитесь завершения размешивания фрагментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл Library.mat представляет собой файл, содержащий чистые спектры для каждого флуорофора концевого элемента вместе с автофлуоресценцией клеток и фоновыми спектральными сигнатурами. В этом случае к флуорофорам эндмембера относятся бирюза, венера и DRAQ5. Фоновые спектральные сигнатуры включают клеточную или матричную автофлуоресценцию, покровную флуоресценцию и покровную дифракцию. Файл Wavelength.mat - это файл, содержащий информацию о канале длин волны, используемую для получения спектрального изображения. Пример файла библиотеки и файла длины волны доступен на веб-сайте Bioimaging and Biosystems (см. примечание к разделу 3.2.1). Для получения дополнительной информации о том, как создавать спектральную библиотеку и файлы длин волн, обратитесь к файлу дополнительной информации под названием «Дополнительная библиотека File_Spectral». Несмешанные изображения, соответствующие каждому z-фрагменту, будут сохранены в папку с именем «Unmixed», созданную в процессе разминирования в папке, выбранной на шаге 3.2.3.
  3. Расчет эффективности FRET:
    1. Откройте сценарий программирования под названием «multiFRRCF.m» и нажмите кнопку «Выполнить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл программирования доступен на веб-сайте Университета Южной Алабамы по биовизуализации и биосистемам (см. примечание к шагу 3.2.1).
    2. Введите количество экспериментальных испытаний для анализа во всплывающем диалоговом окне под названием «Сколько папок следует перелизировать» и нажмите кнопку «ОК».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные изображений из каждого эксперимента должны быть сохранены в отдельной папке несмешаемых изображений. Этот шаг просто позволяет коду анализа зацикливаться на многих папках в качестве шага экономии времени.
    3. Найдите и выберите несмешанные папки и нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раз, когда открывается всплывающее окно «Обзор папки», зависит от числа, введенного в диалоговом окне «Сколько папок для перелицензов» на предыдущем шаге. Найдите и выберите папки одну за другой.
    4. В новом всплывающем окне введите следующую информацию в соответствующие поля: коэффициент масштабирования составляет 12,4, порог 5,6, X, Y и частота Z — 5, 5 и 1 соответственно, а алгоритм сглаживания — гауссовский.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент масштабирования представляет собой значение в пикселях/мкм и будет использоваться для масштабирования выборки в Z-направлении до направления XY. Коэффициент масштабирования получается из размера пикселя изображения, который обычно предоставляется в качестве метаданных в изображении для большинства систем конфокальных микроскопов. Например, если изображение получено с интервалом 0,08 мкм/пиксель, коэффициент масштабирования должен составлять 12,5 пикселя/мкм. Пороговое значение будет использоваться для порогового значения изображений и создания двоичной маски ячейки. Мы создали список оптимальных значений на основе интенсивности донора изображения + акцептора. Используйте 4,5 в качестве порогового значения, если изображение имеет яркую интенсивность донор+акцептор и низкий фон, значение от 5,6 до 6,5 для изображений с умеренной интенсивностью донор+акцептор и/или более высокий фон и значение 7,5 и выше для изображений с интенсивностью донор+акцептор, которая ниже фона. Значение частоты соответствует интервалу, в количестве пикселей, на котором выполняется нарезка на последующих этапах. Например, если Z-глубина ячейки составляет 17 мкм при размере шага 1 мкм и в направлении XY используется коэффициент масштабирования 12,5 пикселей/мкм, то глубина набора данных 3-мерного изображения будет ресамплитирована на 212 пикселей (направление Z). На основе введенного значения частоты Z (например, 1 пиксель) набор данных 3-мерного изображения будет повторно разрезан, начиная с верхней части набора данных изображения, а затем с шагом 1 пиксель вниз. В результате получается 212 перерезых изображений. Если бы для частоты Z был введен больший интервал значений частоты, то было бы сгенерировано меньше перерезых изображений. Перерезки изображений сохраняются на последующих этапах.
    5. Нажмите кнопку Выполнить и подождите, пока не будут выполнены все измерения и перелицензирование FRET.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В родительском каталоге создается отдельная папка, в которую сохраняются релистрированные изображения эффективности FRET в оттенках серого и цветные (примененная цветовая карта) изображения эффективности FRET. Например, все изображения FRET в градациях серого и цветовой карты, перекрашенные в направлении X (плоскость YZ), сохраняются в папку под названием «Resliced_XFRET».
    6. Повторите анализ с аналогичными настройками для всех экспериментов – до и после обработки курсфорсколина и управления транспортным средством.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, упомянутые в разделе 3.3, описывают значения, вводимые для пользовательского программного скрипта анализа FRET для генерации 3-мерных данных изображения FRET. Однако этот скрипт выполняет несколько операций во время выполнения, в том числе: загрузка данных изображения, создание стеков изображений, сглаживание, расчеты эффективности FRET, создание и применение маски границы ячейки, 3-мерная реконструкция изображения, перерезка 3-мерных изображений через заданные интервалы (частоты), применение цветовой карты для визуализации изменений FRET и сохранение перерезых данных изображения в том же каталоге. Дополнительные сведения были включены в качестве комментариев в сценарий программы.

4. Сопоставление эффективности ЛАД с уровнями цАМФ

  1. Откройте файл программирования с именем 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' и нажмите кнопку «Запустить» в главном окне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл доступен на веб-сайте BioImaging and BioSystems (см. примечание к разделу 3.2.1). Этот файл считывает изображения эффективности FRET в градациях серого и преобразует их в уровни cAMP на основе характеристической кривой. Эта характеристическая кривая использует отношение цАМФ-к-ФРЕТ, задокументировано в литературе15,36, которое описывается уравнением Хилла (третье уравнение, показанное ниже). Однако Kd зонда в неповрежденных ячейках трудно оценить, и мы предположили, что он составляет 1 мкМ в наших расчетах. Следовательно, результаты показаны как функция Kd. (т.е. [цАМФ] = x* Kd). Уравнения, используемые для измерения эффективности FRET и сопоставления FRET с уровнями cAMP, показаны ниже:
    figure-protocol-1
    Где E — эффективность FRET, а кажущаяся иd-явная — несмешанные интенсивности пикселей акцепторных и донорских изображений соответственно.
    Qa и Qd являются квантовыми выходами акцептора и донора. Обратите внимание, что Qa и Qd отменяются, когда уравнение для kλ включено в уравнение эффективности FRET, kλ является поправочный коэффициент:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3 и figure-protocol-4 являются коэффициентами вымирания донора и акцептора на длине волны возбуждения донора, i (405 нм).
    figure-protocol-5
    E — эффективность ФРЕТа, а KD = константа диссоциации = 1 мкМ.
  2. Найдите и выберите первое изображение FRET в области оттенка серого (сохраненное на шаге 3.3.5) и нажмите кнопку ОК.
  3. Откройте изображения FRET/cAMP, чтобы проверить распределение сигналов cAMP в трех измерениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает использование гиперспектральных подходов к визуализации и анализу FRET для измерения градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях в живых клетках. Существует несколько ключевых шагов, связанных с получением этих результатов, для которых требуется тщательное внимание при анализе и количественной оценке данных. Эти ключевые шаги включают в себя построение соответствующей спектральной библиотеки, фоновое спектральное размешивание, пороговое значение для идентификации границ ячеек и расчеты эффе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Разработка биосенсоров FRET позволила измерять и визуализировать циклические нуклеотидные сигналы в отдельных клетках, и существует большая перспектива для визуализации субклеточных сигнальных событий13,22,37,38. Однако использование биосенсоров FRET имеет несколько ограничений, включая низкие характеристики сигнал-шум многих флуоресцентных репортеров FRET на основе белка и слабую эффективность...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Доктора Ливсли и Рич раскрывают финансовую заинтересованность в начинаючей компании SpectraCyte, LLC, которая была создана для коммерциализации технологий спектральной визуализации. Однако все процедуры, описанные в этом протоколе, проводились с использованием коммерчески доступных продуктов, не связанных с SpectraCyte, LLC.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кейса Джалинка (Нидерландский институт рака и Центр передовой микроскопии ван Левенгука, Амстердам, Нидерланды) за предоставление нам биосенсора H188 cAMP FRET и Кенни Тринха (Инженерный колледж Университета Южной Алабамы) за техническую помощь в сокращении времени, занимаемого для запуска наших специально разработанных программных сценариев.

Авторы хотели бы отметить источники финансирования: Американская кардиологическая ассоциация (16PRE27130004), Национальный научный фонд; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Attofluor Cell ChamberInvitrogenA7816Attofluor содержит стальные ячейковые камеры и резиновое уплотнительное кольцо. Камера ячейки удерживает покровное стекло, а уплотнительное кольцо обеспечивает механизм блокировки для удержания буфера в камере ячейки без утечки
Диметилсульфоксид (ДМСО)Растворитель Fisher ScientificBP231-100используется для приготовления исходного раствора для сколколина.
DRAQ5 Раствор флуоресцентного зондаThermo Scientific62252Ядерная метка
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092Содержит питательные вещества и факторы роста для роста и деления клеток в чашках для культивирования.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF6178Фактор роста, который добавляют в питательную среду, активатор
аденилициклазыForskolinSigma F3917
H188 Cyclic AMP FRET биосенсорНидерландского института рака, доктор К. ДжалинкГифтПлазмида, кодирующая бирюзу (донорный флуорофор), Венеру (акцепторный флуорофор), и связывающий домен, полученный из Epac.
Image Jimage.netСкачать бесплатноЕще одна платформа обработки изображений, используемая для расширения спектральной информации и обработки изображений.
Интегрирующая сферическаяокеаническая оптикаFOIS-1Используется для измерения интенсивности освещения лазерной линии при различных интенсивностях лазера (?).
Ламинин Мышиный белок, натуральныйинвитроген23017-015Покровные стекла покрыты ламинином, и это способствует прикреплению клеток, росту и подвижности клеток.
Lipofectamine 3000 Transfection: KitInvitrogenL3000-015Реагент для трансфекции, используемый для трансфекции клеток с биосенсором H188 FRET
MATLABMathworksR2019aОперации обработки изображений (линейное расмешивание и расчет эффективности FRET) выполняются путем написания пользовательских программ в среде программирования
MATLAB конфокальный микроскоп Nikon A1R, конфокальный микроскоп Nikon A1RNikon Instruments, Nikon A1R,Получение спектральных изображений осуществляется с помощью конфокального микроскопа.
Программное обеспечение Nikon ElementsПрограммный ключNikon Instrumentsиспользуется для экспорта и обработки файлов изображений nd2 (многомерных изображений), полученных с помощью калибровочной лампы Nikon A1R
NIST-traceable OceanOpticsLS-1-CAL-INTЛампа с известным спектром для использования в качестве стандартного
PBS pH 7,4 (1X)Gibco10010-023coom используется только буферная сурговая клеточная культура
Легочные микрососудистые эндотелиальные клетки (PMVECs)Внутри - ядро клеточной культуры, Университет Южной АлабамыВыделенные из крыс легочные микроциркуляторныеPMVEC образуют внутреннюю оболочку кровеносного сосуда.
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Антибиотики Gibco15140-122добавляются в культуральную среду для предотвращения контаминации клеток.
Предварительно очищенные микростекла Gold Seal ClayAdams3010стекла для микроскопа, используемые для фиксации клеток
ProLong Diamond Antifade Mounting MediaInvitrogenP36961Если образцы зафиксированы с помощью антивыцветающего монтанта, то последний защищает флуоростирующие красители и хромофоры от выцветания.
СпектрометрOcean OpticsQE65000Используется для измерения спектрального отклика источника света (?)
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Gibco25200-056Переваривает белок-белковую связь между клеткой и клеточным матриксом и помогает расчленять и приподнимать клетки во время клеточного покрытия.
Буфер Tyrodesсобственного производстваБуферTyrodes используется для изготовления рабочих растворов и поддержания ячеек в водном растворе во время получения изображений.
Пластины для культивирования клеток на 6 лунокCorning3506с ламининовым покрытием помещаются в чашку для культур на 6 лунок (один покров на лунку). В каждую лунку добавляется клетка вместе со средой.
25 мм круглая крышка микроскопа FisherScientific12545102Клетки были выращены на круглых стеклянных покровных крышках
60X OjectiveNikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27погружение в воду и широко используемый объектив для клеток
DMEM., , , русла Предметные

Ссылки

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031(2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513(2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586(2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010(2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453(2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3DFRET
Измерение 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках с использованием 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.